女性尖銳濕疣患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)及復(fù)發(fā)觀察

黃永初，張小超，朱小美

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科，武漢 430000）

尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的表皮良性增生性疾病，主要通過性接觸、母嬰等途徑傳播，在歐美國(guó)家發(fā)病率僅次于淋病，在我國(guó)發(fā)病率逐年升高[1]。目前臨床發(fā)現(xiàn)的HPV病毒有100多個(gè)亞型，其中30多種具有致病性，根據(jù)病毒的致病性又可分為高危型與低危型，不同亞型的HPV引起的尖銳濕疣形態(tài)、預(yù)后不盡相同[2]。HPV感染機(jī)體后很少進(jìn)入血液，幾乎不會(huì)發(fā)生抗原遞呈，導(dǎo)致機(jī)體不能完全將HPV徹底清除，增加了尖銳濕疣的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，成為尖銳濕疣臨床治療的難點(diǎn)。因此，尋找一種低復(fù)發(fā)的治療方案是臨床研究的重點(diǎn)。近年來，研究[3]發(fā)現(xiàn)，尖銳濕疣患者有明顯的Th1/Th2免疫失衡，且免疫失衡與患者復(fù)發(fā)有關(guān)。研究[4]指出，肛門直腸尖銳濕疣的復(fù)發(fā)與HPV感染亞型有顯著的相關(guān)性。但目前國(guó)內(nèi)關(guān)于治療后復(fù)發(fā)的女性尖銳濕疣患者HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系研究較少。鑒于此，本研究就女性尖銳濕疣患者HPV感染亞型、T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的差異及二者之間的關(guān)系進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院收治的162例女性尖銳濕疣患者進(jìn)行回顧性病例對(duì)照研究，將其中81例治療后復(fù)發(fā)的患者納入復(fù)發(fā)組，81例治療后未復(fù)發(fā)患者納入未復(fù)發(fā)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）尖銳濕疣符合《皮膚性病學(xué)》[5]中診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者病史、典型表現(xiàn)，結(jié)合醋酸白試驗(yàn)、HPV及組織病理檢查明確診斷；2）患者均依據(jù)《尖銳濕疣治療專家共識(shí)（2017）》[6]接受規(guī)范治療；3）臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并其他性傳播疾病，如淋病、梅毒等；2）合并其他皮膚疾病，如皰疹、濕疹、皮炎等；3）患有過敏性疾病或自身免疫性疾??；4）患有嚴(yán)重肝腎功能、心肺功能異常；5）合并結(jié)核、病毒性肝炎等其他傳染性疾病；6）HPV混合感染；7）近期內(nèi)使用過免疫調(diào)節(jié)劑。本研究符合《赫爾辛基宣言》中倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集 查閱患者病歷資料，采用描述性研究記錄患者的年齡、吸煙史、大量飲酒史（每日飲酒超過20 g，或2周內(nèi)飲酒超過40 g）、性伴侶數(shù)、安全套使用情況（有、無或偶爾使用）、皮損數(shù)量、感染部位（陰唇、尿道口、宮頸）、生殖系統(tǒng)感染情況。

1.2.2 HPV檢測(cè)方法 治療前使用洗脫管收集患者皮損組織并搗碎漂洗，離心分離10 min，轉(zhuǎn)速13 000 r·min-1，留取管底細(xì)胞，加入裂解液50 μL，加熱10 min（100℃水?。俅坞x心（13 000 r·min-1，10 min），留取上清液；采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增后，加入0.1%十二烷基硫酸鈉、檸檬酸鈉混合液5 mL，水浴加熱10 min，雜交1 h（51℃）；最后進(jìn)行洗膜、顯色；判定HPV感染亞型。結(jié)果判定：根據(jù)洗膜條中藍(lán)色斑點(diǎn)顯色的位置判定，包括高危型：HPV16、18、31、33、45、52、56、59；低危型：HPV6、11、42、43、44。

1.2.3 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)方法 治療前采集患者外周血5 mL，離心10 min，轉(zhuǎn)速3 500 r·min-1，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液清洗2次，加入70%冷乙醇固定細(xì)胞過夜保存（-20 ℃）；再次離心（3 500 r·min-1，10 min）并加入核糖核酸酶、碘化丙啶染液，避光孵育30 min（4 ℃），保證每個(gè)樣本獲取2×104細(xì)胞數(shù)；使用流式細(xì)胞儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)BriCyte E6）測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+，計(jì)算每1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+的百分比。正常參考值：CD3+：61% ～ 85%，CD4+：28% ～ 58%，CD8+：19%～48%，CD4+/CD8+：0.9～2.0。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，用Shapiro-Wilk正態(tài)分布檢驗(yàn)計(jì)量資料正態(tài)性，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示符合正態(tài)分布計(jì)量資料，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；例（%）表示計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)；采用Kendall’s tau-b相關(guān)性分析檢驗(yàn)女性尖銳濕疣患者HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的相關(guān)性；采用Logistic回歸分析檢驗(yàn)HPV感染亞型、T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)尖銳濕疣復(fù)發(fā)的影響；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者基線資料比較

復(fù)發(fā)組大量飲酒史、合并泌尿系統(tǒng)感染占比高于未復(fù)發(fā)組，使用安全套占比低于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）見表1。

表1 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者基線資料比較 （n= 81）例（%）

2.2 女性尖銳濕疣患者HPV亞型分布情況

162例女性尖銳濕疣患者高危型HPV亞型75例，低危型HPV亞型87例；復(fù)發(fā)組高危型HPV感染占比（62.96%，51/81）高于未復(fù)發(fā)組（29.63%，24/81），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.099，P= 0.001）。見表2。

表2 女性尖銳濕疣患者HPV感染亞型分布 例（%）

2.3 不同HPV感染亞型女性尖銳濕疣患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)

HPV感染高危型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于低危型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同HPV感染亞型CD8+比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同HPV感染亞型患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)（±s）

表3 不同HPV感染亞型患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)（±s）

注：與高危型比較，# P＜0.05，### P＜0.001

項(xiàng)目 例數(shù) CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+高危型 75 73.32±10.00 41.98±6.76 33.60±11.75 1.37±0.45低危型 87 76.90±8.94# 46.89±6.46### 33.13±15.32 1.58±0.45#

2.4 女性尖銳濕疣患者HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)Kendall’s tau-b相關(guān)性分析檢驗(yàn)，女性尖銳濕疣患者HPV感染亞型與CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+水平呈負(fù)相關(guān)（r= -0.162、-0.330、-0.207，P＜0.05）。

2.5 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)

復(fù)發(fā)組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+低于未復(fù)發(fā)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)（±s，n= 81）

表4 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)（±s，n= 81）

注：與復(fù)發(fā)組比較，### P＜0.001

項(xiàng)目 CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+復(fù)發(fā)組 72.56±9.64 42.42±6.20 35.12±11.21 1.30±0.37未復(fù)發(fā)組 77.92±8.80### 46.82±7.15### 31.58±15.76 1.66±0.48###

2.6 HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群影響尖銳濕疣復(fù)發(fā)的回歸分析

將尖銳濕疣復(fù)發(fā)作為因變量（1 =復(fù)發(fā)，0 =未復(fù)發(fā)），將HPV感染亞型與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+作為自變量（HPV感染亞型為分類變量，1=高危型，0 =低危型；CD3+、CD4+、CD4+/CD8+為連續(xù)變量），經(jīng)Logistics回歸分析，結(jié)果顯示HPV感染高危型是尖銳濕疣復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素（OR＞1，P＜0.05），CD3+、CD4+、CD4+/CD8+高是尖銳濕疣復(fù)發(fā)的保護(hù)因素（OR＜1，P＜0.05）。見表5。

表5 HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群影響尖銳濕疣復(fù)發(fā)的回歸分析

3 討論

HPV感染是引起尖銳濕疣的病原學(xué)原因。由于尖銳濕疣的發(fā)病部位較為特殊，女性患者，就醫(yī)、治療均等受到一定限制，給女性患者身心健康造成嚴(yán)重影響[7]。目前，尖銳濕疣沒有公認(rèn)的治療方案，主要根據(jù)患者病情制定綜合防治措施[8]。多數(shù)患者經(jīng)治療后皮損可消退或改善，HPV感染減少，但并沒有有效的手段徹底根除HPV感染，部分患者治療后仍會(huì)復(fù)發(fā)。

尖銳濕疣的復(fù)發(fā)與多種因素有關(guān)，如大量飲酒、安全套使用、生殖系統(tǒng)感染等。大量飲酒不僅會(huì)降低機(jī)體的免疫功能，引起DAN修飾對(duì)宮頸上皮造成損傷，也會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生一過性的抑制作用，導(dǎo)致尖銳濕疣的復(fù)發(fā)[9]。陰道炎、宮頸炎等生殖系統(tǒng)感染性疾病會(huì)導(dǎo)致宮頸、陰道局部免疫力低下，且長(zhǎng)期的炎性刺激也會(huì)增加尖銳濕疣的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[10]。從不或很少使用安全套也是引起尖銳濕疣復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素[11]。因此，在尖銳濕疣的治療過程中，需要明確告知患者養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣，忌飲酒，合理使用安全套，保持良好的個(gè)人衛(wèi)生，有助于減少尖銳濕疣治療后復(fù)發(fā)。

本研究觀察了不同HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果顯示，HPV感染高危型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平低于低危型，且HPV感染亞型與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈負(fù)相關(guān)，說明不同HPV感染亞型患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)存在差異。但目前臨床關(guān)于不同HPV感染亞型患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的差異相關(guān)報(bào)道較少。本研究并沒有對(duì)尖銳濕疣患者HPV感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行闡明，且HPV感染與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的關(guān)系復(fù)雜，可能涉及黏附分子、抗原提呈等多個(gè)因素的相互作用。

HPV感染的主要細(xì)胞為皮膚黏膜鱗狀上皮細(xì)胞，侵入機(jī)體后可在基底層角質(zhì)復(fù)制，引起宿主細(xì)胞異常增殖[12]。HPV亞型包括高危型與低危型，由于HPV很難在體外培養(yǎng)，因此不同亞型HPV感染引起的尖銳濕疣發(fā)病機(jī)制尚未闡明。上海地區(qū)2017年至2018年男性尖銳濕疣流行病學(xué)調(diào)查顯示，HPV感染亞型中高危型以16/52/51型為主，低危型以6/11型為主[13]。在初發(fā)尖銳濕疣患者中以HPV6、HPV11單一感染常見，但高危型HPV16占多重感染的60%，且復(fù)發(fā)率顯著高于其他類型HPV感染[14]。本研究結(jié)果顯示，HPV感染高危型是尖銳濕疣復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，說明尖銳濕疣復(fù)發(fā)與HPV感染亞型有關(guān)。高危型HPV感染與低危型相比具有更強(qiáng)的致病性，且高危型感染所致的細(xì)胞分化程度較低，會(huì)影響宿主對(duì)病原體的識(shí)別，導(dǎo)致HPV持續(xù)感染，引起尖銳濕疣復(fù)發(fā)。HPV16型E6、E7蛋白能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子小核仁RNA宿主基因12，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，并通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/Slug蛋白途徑促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。

尖銳濕疣的復(fù)發(fā)也與機(jī)體無法對(duì)HPV感染產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答有關(guān)，機(jī)體免疫應(yīng)答異常可引起HPV免疫逃逸，導(dǎo)致HPV在體內(nèi)持續(xù)感染，引起尖銳濕疣復(fù)發(fā)[16]。男性肛門HPV感染率與CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)，隨著CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，HPV感染率顯著降低[17]。本研究結(jié)果顯示，CD3+、CD4+/CD8+高是尖銳濕疣復(fù)發(fā)的保護(hù)因素，說明尖銳濕疣復(fù)發(fā)與T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)有關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。王海霞等[18]研究證實(shí)，尖銳濕疣HPV感染的妊娠女性存在顯著的Th1/Th2免疫失衡，且Th1/Th2免疫失衡可影響患者的妊娠結(jié)局。CD4+T細(xì)胞可增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，CD8+T細(xì)胞則具有免疫抑制作用，2種T細(xì)胞的相互拮抗可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，當(dāng)CD4+/CD8+降低可引起免疫系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致HPV持續(xù)感染，并減弱機(jī)體對(duì)HPV的清除能力，導(dǎo)致尖銳濕疣治療后復(fù)發(fā)。

綜上所述，不同HPV感染亞型女性尖銳濕疣患者T淋巴細(xì)胞表達(dá)差異顯著，且T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)與疾病復(fù)發(fā)密切相關(guān)。臨床可根據(jù)HPV感染亞型、T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)對(duì)尖銳濕疣患者治療后復(fù)發(fā)情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，并采取免疫療法治療尖銳濕疣，減少治療后復(fù)發(fā)。本研究為觀察性研究，無法明確HPV感染亞型、T淋巴細(xì)胞亞群在尖銳濕疣發(fā)病、進(jìn)展中的作用機(jī)制，以及HVP感染亞型與T淋巴細(xì)胞亞群之間的相互作用。