一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株的分離鑒定及其對(duì)養(yǎng)殖廢水的脫氮效果

陳春秀，馬 超，劉 皓，王群山，賈 磊，于燕光，殷小亞，錢 紅

(1.天津市水產(chǎn)研究所，天津300221；2.天津市農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300201 )

近年來，隨著我國海水養(yǎng)殖業(yè)向集約化現(xiàn)代化的高速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的養(yǎng)殖廢水，同時(shí)也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染及生態(tài)安全等問題。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的殘料、排泄物、尸體等有機(jī)物導(dǎo)致養(yǎng)殖廢水中含有大量含氮化合物，不僅危害養(yǎng)殖動(dòng)物，損害養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)效益，還會(huì)對(duì)我們賴以生存的環(huán)境及水生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響及危害，從而制約了我國海水養(yǎng)殖的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，海水養(yǎng)殖廢水的凈化處理已成為養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問題。生物脫氮因其經(jīng)濟(jì)高效、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注，并應(yīng)用于養(yǎng)殖廢水處理，其中異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌相比于傳統(tǒng)脫氮，不受限于氧氣，而且能將氨氮直接轉(zhuǎn)化為氮的氣態(tài)產(chǎn)物而備受關(guān)注，近年來一直是學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

1983年Robertson首次發(fā)現(xiàn)并提出異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌概念，其后不同菌屬的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌被相繼從不同環(huán)境中分離并鑒定，包括不動(dòng)桿菌、假單胞菌、黏質(zhì)沙雷氏菌等。目前，關(guān)于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理實(shí)際應(yīng)用方面鮮有報(bào)道的研究，大多處于實(shí)驗(yàn)室階段。孫雪梅等從海水中分離出一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌2-3屬于鹽單胞菌() ，在高鹽環(huán)境中生長，同時(shí)具有高效的異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，能夠獨(dú)立完成脫氮的全部過程。張達(dá)娟等從凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中分離出來的一株施氏假單胞菌()，通過凈化模擬養(yǎng)殖水體結(jié)果表明此菌株脫氮效果明顯。脫氮細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用越來越廣泛，而異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌也勢必會(huì)給規(guī)模集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理帶來新的希望。因此，篩選出適應(yīng)有氧高鹽水環(huán)境，且能高效脫氮的菌株，是海水養(yǎng)殖廢水凈化的關(guān)鍵。不僅有利于揭示異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌脫氮機(jī)理，還可以為海水養(yǎng)殖廢水凈化處理等工藝提供菌種。本研究從海水養(yǎng)殖廢水處理池中經(jīng)分離篩選得到1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA 基因序列分析對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定，并將其接種到實(shí)際的半滑舌鰨工廠化養(yǎng)殖廢水中，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用處理效果進(jìn)行了初步研究。以期對(duì)海水養(yǎng)殖廢水凈化及其相關(guān)微生態(tài)制劑開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 分別從天津市漢沽區(qū)對(duì)蝦育苗尾水沉淀池塘采集底泥和海水養(yǎng)殖廢水處理池中生物填料采集生物膜，用于分離篩選細(xì)菌。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液

溴甲基酚藍(lán)(BTB)固體培養(yǎng)基：檸檬酸鈉5.0 g，KNO1 g，KHPO1.5 g，KHPO1.5 g，BTB 1mL，MgSO·7HO 0.2 g，鹽度為15 ‰的人工海水， BTB 1 mL，瓊脂25.0 g，用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.3。該培養(yǎng)基用于菌株分離和初篩。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：NHCl 0.5 g；檸檬酸鈉5.66 g；維氏鹽溶液50 mL；調(diào)pH至7.0。該培養(yǎng)基用于初篩菌株氨氮去除能力測試。

維氏鹽溶液：KHPO5.0 g；MgSO·7HO 2.5 g；FeSO·7HO 0.05 g；MnSO·4HO 0.05 g；鹽度為15‰的人工海水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌分離純化 取水樣懸液10 mL用無菌水稀釋制備成10稀釋液，取0.1 mL涂布在BTB固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，將能使BTB培養(yǎng)基由綠變藍(lán)的菌株在已制好的平板培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離純化，挑取不同類型的菌落分離純化3次以上，直至得到單一的菌落為止。鏡檢驗(yàn)純并采用甘油保存法-80 ℃保種。

1.2.2 好氧反硝化菌株硝化能力的測定 無菌條件下，將分離純化的菌株分別接種至裝有100 mL液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中富集培養(yǎng)，28 ℃，120 r/min培養(yǎng)24 h。再將富集后的菌懸液再次分別以1 %的接種量接種至分別裝有液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基的錐形瓶中，于28 ℃恒溫，搖床培養(yǎng)24 h后，搖勻后移取10 mL菌液，以8 000 r/min離心，取上清液。檢測其中氨氮的濃度。根據(jù)氨氮和總氮的去除率，挑選一株高效的脫氮細(xì)菌。

1.2.3 菌種鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將篩選的一株高效菌株接種于BTB固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，待長出單個(gè)菌落后，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色和電鏡掃描。

16S rDNA基因分子鑒定：采用蛋白酶K裂解的方法進(jìn)行基因組DNA抽提，采用引物8F(5′ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′ -GGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，上游引物8F和下游引物1492R各1 μL，模板1 μL，補(bǔ)ddHO至40 μL。PCR 程序：94 ℃，3 min ；94 ℃，30 s；56 ℃，30 s ；72 ℃ 90 s；循環(huán)25次；72 ℃，5 min；10 ℃，5 min。高效菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物測序工作由上海微基生物科技有限公司完成，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，并利用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株WM2對(duì)養(yǎng)殖廢水脫氮效果研究 試驗(yàn)所用水樣采集自天津漢沽水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水處理池。經(jīng)檢測，該廢水中氨氮濃度為(0.83±0.04)mg/L，硝態(tài)氮(0.19±0.02)mg/L，亞硝態(tài)氮(0.87±0.05)mg/L。

將養(yǎng)殖廢水抽濾后分裝到3個(gè)250 mL錐形瓶中(三個(gè)平行)，按1%接種量介入菌株WM2懸液，接種后將水樣至于28 ℃，120 r/min培養(yǎng)箱中48 h，每24 h取50 mL水樣測定氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮濃度，測定方法參照海洋監(jiān)測規(guī)范(GB 17378.4-2007)和《水和廢水監(jiān)測分析方法》進(jìn)行。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0中利用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，顯著性差異水平參考<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化和初篩菌株

利用BTB培養(yǎng)基的顯色反應(yīng)，共分離純化篩選出5株具有反硝化能力的菌株。然后將5株菌株接入氨氮初始濃度為101 mg/L的異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后檢測其中氨氮和總氮的濃度。結(jié)果表明(圖1)，5組液體培養(yǎng)基中的氨氮都有一定的降解，說明5株菌株均有一定的硝化能力，其中3號(hào)菌株處理的液體中氨氮和總氮去除率最高，分別為76.3%和53.5%，圖2的結(jié)果顯示3號(hào)菌株并沒有亞硝態(tài)氮的積累，因此將此菌株作為研究對(duì)象，并命名為WM2。

圖1 5株菌株在異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的總氮和氨氮去除率

圖2 5株菌株在異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的亞硝態(tài)氮濃度

2.3 菌株鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)特征 分離的菌株WM2在固體培養(yǎng)基平板上形成的菌落呈現(xiàn)圓形，略微凸起，顏色略黃且透明，邊緣規(guī)則整齊，表面光滑(圖3 a)。通過顯色反應(yīng)表明該菌株為革蘭氏陰性菌(圖3 b)。經(jīng)電鏡掃描發(fā)現(xiàn)，菌株WM2為短桿狀，無鞭毛(圖3 c)。

圖3 菌株WM2的形態(tài)特征

2.3.2 菌株16S rDNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育 通過擴(kuò)增和測序，獲得菌株WM2的16S rDNA序列大小為1 393 BP，BLAST對(duì)比結(jié)果表明，菌株WM2與AR-11(GenBANk:NR_116301.1) 的相似度最高為99.282%，在比對(duì)結(jié)果中挑選與菌株WM2相似性最高的前10位物種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，結(jié)合菌株WM2的形態(tài)學(xué)，結(jié)果表明菌株WM2屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)海生桿菌屬()。

圖4 基于16S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的菌株WM2的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株WM2在海水養(yǎng)殖廢水中的脫氮效果

將篩選的菌株WM2應(yīng)用于實(shí)際海水養(yǎng)殖廢水中，經(jīng)菌株WM2處理后的養(yǎng)殖廢水中的氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度均有所下降(圖5)，其脫氮效果明顯，處理48 h后的氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮去除率分別為99.66%、88.77%和89.38%(圖6)。

圖5 菌株WM2處理不同時(shí)間后養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的濃度

圖6 菌株WM2處理不同時(shí)間后養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的去除率

3 討論

海生桿菌屬屬于海洋螺菌目、海洋螺菌科，最早于1997年由González等發(fā)現(xiàn)并鑒定。到目前為止超過18種菌種從各種海洋環(huán)境中被分離，且均為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞形態(tài)為桿狀，其中大多數(shù)菌種的最適生長溫度為30 ℃，pH為7～8。對(duì)于海生桿菌屬的研究多見于海洋芳香烴污染物治理，如Bae等從海洋沉積物中分離一株可以降解苯的海生桿菌菌株ST58-10T，王夢汝等在對(duì)海生桿菌屬基因組測序數(shù)據(jù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，海生桿菌屬普遍具有苯、苯酚和苯甲酸的降解途徑。而對(duì)于海生桿菌屬在脫氮作用方面研究鮮有報(bào)道。目前應(yīng)用異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌對(duì)養(yǎng)殖廢水進(jìn)行凈化處理的研究廣泛，陳猛等從豬糞水自然曝氣池中篩選出菌株ZF2-3，將其應(yīng)用于養(yǎng)殖廢水脫氮結(jié)果表明，水體中氨氮、總氮濃度分別降低37.7%、67.4%；康傳磊等考察了3株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌對(duì)圓斑星鰈養(yǎng)殖廢水的凈化效果，研究表明添加的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌可在不添加碳源的情況下實(shí)現(xiàn)脫氮功能，有效維護(hù)養(yǎng)殖水質(zhì)，并且對(duì)圓斑星鰈無毒害及致病作用。本研究從海水養(yǎng)殖廢水處理池中分離篩選的菌株WM2，通過形態(tài)學(xué)和16S rDNA基因序列分析表明該菌株屬于海生桿菌屬，且為一株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌，具有良好的脫氮性能，尤其是在高鹽有氧條件下的養(yǎng)殖廢水中脫氮效果顯著，普通微生物在高鹽度環(huán)境下因高滲透壓導(dǎo)致其細(xì)胞質(zhì)壁分離抑制其酶活及生長，從而使常規(guī)生物處理效果不明顯，因此該菌株的發(fā)現(xiàn)對(duì)海水養(yǎng)殖廢水凈化具有重大意義，存在巨大開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

在本試驗(yàn)初篩時(shí)，液體異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中氯化銨是唯一的氮源，菌株WM2表現(xiàn)出較強(qiáng)的氨氮去除效果，氨氮去除率達(dá)到76.3%，且?guī)缀鯖]有亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的積累，具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化功能，同時(shí)WM2對(duì)總氮的去除率為76.3%，因此我們推斷部分氨氮被用于菌體細(xì)胞物質(zhì)的合成，其余部分氨氮可能通過羥胺氧化途徑直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)排出反應(yīng)體系；當(dāng)用菌株WM2對(duì)實(shí)際養(yǎng)殖廢水進(jìn)行凈化處理時(shí)，氮源變成氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的混合氮源，WM2的脫氮效果顯著，處理48 h后的氨氮去除率89.38%、硝態(tài)氮去除率88.77%、亞硝態(tài)氮去除率99.66%，但其具體脫氮機(jī)理還有待研究。碳源同樣是好氧反硝化菌脫氮效果主要影響因子之一，不僅為細(xì)菌進(jìn)行生命活動(dòng)提供能量，還能為其好氧反硝化過程提供電子受體，且有研究表明好氧反硝化菌主要以葡萄糖、丁二酸鈉、乙酸鈉和檸檬酸鈉等為碳源，少數(shù)也有以難降解的有機(jī)物為碳源，郭超等對(duì)一株從污泥中分離出的高效好氧反硝化菌株Y8進(jìn)行不同碳源脫氮性能時(shí)發(fā)現(xiàn)丁二酸鈉為最佳碳源。除了碳源外，適宜的溫度、pH、碳氮比、菌種接種濃度都是異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌脫氮效果的影響因素，而本試驗(yàn)對(duì)篩選菌株進(jìn)行脫氮性能測試時(shí)所有培養(yǎng)基均以檸檬酸鈉作為唯一碳源且試驗(yàn)條件較為單一，并沒有確定WM2最佳脫氮條件，下一步擬對(duì)其生理生化特性及脫氮機(jī)理進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

從對(duì)蝦育苗尾水沉淀池塘采集底泥和海水養(yǎng)殖廢水處理池中生物填料，利用BTB培養(yǎng)共分離純化篩選出5株具有反硝化能力的菌株。并利用異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基測試這5株菌株的氨氮去除能力，其中3號(hào)菌株氨氮和總氮去除率最高，分別為76.3%和53.5%，并命名為WM2進(jìn)行下一步研究。

通過形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明菌株WM2為革蘭氏陰性菌，電鏡掃描發(fā)現(xiàn)其為短桿狀，無鞭毛，菌落呈現(xiàn)圓形，略微凸起，顏色略黃且透明，邊緣規(guī)則整齊，表面光滑。16S rDNA序列大小為1 393 BP，與strain AR-11(GenBANk:NR_116301.1) 的相似度最高為99.282%。

菌株WM2對(duì)實(shí)際海水養(yǎng)殖廢水處理48 h后氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮去除率分別為99.66%、88.77%和89.38%，其脫氮效果明顯。