齦溝液中miR-146a、miR-21表達(dá)水平與種植體周?chē)椎南嚓P(guān)性研究

鐘秋 陳艷莉 冷建瓊 周吉

種植體周?chē)资且蚩谇患?xì)菌微生物導(dǎo)致的組織炎癥，是致炎因子引起的破骨細(xì)胞活化導(dǎo)致的牙槽骨吸收平衡遭到破壞，可導(dǎo)致種植體松動(dòng)脫落，進(jìn)而影響種植效果[1，2]。因此，及早發(fā)現(xiàn)種植體周?chē)拙哂兄匾饬x。miR-146a是炎癥因子信號(hào)傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，而miR-21可通過(guò)多種途徑參與調(diào)控細(xì)胞分化和更新，參與牙周組織修復(fù)，且二者均參與牙周炎等慢性炎癥疾病發(fā)展過(guò)程，但有關(guān)其在種植體周?chē)字械淖饔脵C(jī)制報(bào)道較少[3，4]。本研究以我院108例行種植體修復(fù)患者為研究對(duì)象，檢測(cè)其齦溝液中miR-146a、miR-21水平，分析其表達(dá)水平與種植體周?chē)椎年P(guān)系，旨在為臨床種植體周?chē)最A(yù)防及治療提供參考，以提高牙種植修復(fù)效果。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取我院2019年7月～2020年7月收治的進(jìn)行牙種植修復(fù)的108例患者（共108枚）為研究對(duì)象，年齡25～78歲，平均（48.56±2.43）歲；其中男62例，女46例。根據(jù)種植體檢測(cè)指標(biāo)情況將患者分為健康種植體組48例（48枚）、種植體周?chē)捉M60例（60枚）。其中健康種植體組中男30例，女18例，年齡23～76歲，平均（47.83±2.35）歲；種植體周?chē)捉M中男32例，女28例，年齡23～78歲，平均（48.72±2.76）歲。選取同期體檢牙齦健康的75例健康者作為對(duì)照組，年齡23～77歲，平均（47.32±2.51）歲；其中男40例，女35例。三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①口腔情況良好，首次進(jìn)行種植牙修復(fù)術(shù)；②種植6個(gè)月后進(jìn)行相關(guān)檢查獲取牙齦完整數(shù)據(jù)，X線片顯示種植體骨組織破壞程度，輕度骨吸收，即出現(xiàn)骨喪失則為種植體周?chē)祝虎蹍⒄彰绹?guó)牙周病協(xié)會(huì)制定的牙周病新分類方法《種植義齒》[5]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)確診為種植體周?chē)?；健康種植體診斷標(biāo)準(zhǔn)為：探診無(wú)出血、化膿、疼痛等情況，且無(wú)軟組織增生；④患者知情且簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并全身系統(tǒng)性疾病；②進(jìn)入本研究前3個(gè)月服用過(guò)抗生素類藥物；③合并慢性咽炎、扁桃體炎等口腔局部炎癥疾??；④妊娠期及哺乳期婦女。本研究獲我院倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2022-033-01）。

1.2 樣本采集 以清水漱口后使用無(wú)菌干棉球擦干牙面，隔濕取樣，用探針去除菌斑，然后將濾紙條插入牙齦保持60s，取出濾紙，測(cè)量浸潤(rùn)長(zhǎng)度，并將浸潤(rùn)部分裝入抗凝管內(nèi)，震蕩1h，以4℃ 1000r/min離心10min，取上清液置于-70℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 臨床指標(biāo)測(cè)量 用牙簽探診檢查所有種植體的近側(cè)、近中、遠(yuǎn)中頰側(cè)、舌側(cè)4個(gè)位點(diǎn)的探診深度數(shù)據(jù)結(jié)果，取其平均值作為最終結(jié)果。使用專用的牙周探針?biāo)鶞y(cè)得的齦袋或牙周袋深度，是齦緣至袋底或齦溝底的距離，即為探診深度。根據(jù)齦溝出血指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有種植體齦溝出血情況進(jìn)行評(píng)估：0分表示牙齦健康不出血；1分表示牙齦輕度炎癥；2分表示牙齦輕度炎癥且探診后點(diǎn)狀出血；3分表示牙齦中度炎癥，探診后血滯于齦溝內(nèi)；4分表示牙齦重度炎癥，探診后血溢出齦溝；5分表示探診后牙齦出血。計(jì)算齦溝液量。采用CT檢測(cè)患者牙槽嵴高度，即種植體根尖部到種植體頸部標(biāo)志點(diǎn)間垂直距離，若骨高度變低，則該部分為骨吸收量。

1.4 齦溝液中miR-146a與miR-21水平檢測(cè) 取齦溝液待測(cè)樣品于室溫解凍后，采用實(shí)時(shí)熒光定量復(fù)擴(kuò)增法（qRT-PCR）檢測(cè)齦溝液中miR-146a、miR-21水平。使用miRNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）提取總miRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司）將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，miScript SYBR GreenPCR Kit（上海力敏實(shí)業(yè)有限公司）進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95℃ 15s，95℃50s，60℃ 15s，共40個(gè)循環(huán)。以內(nèi)源性U6小核RNA進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算miR-146a、miR-21相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 臨床指標(biāo)比較 檢查并測(cè)量所有種植體的探診深度、齦溝出血指數(shù)、齦溝液量、骨吸收量，然后進(jìn)行組間分析比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用F檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson直線分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床指標(biāo)比較 種植體周?chē)捉M齦溝出血指數(shù)、探診深度、齦溝液量、骨吸收量均顯著高于健康種植體組（t=17.848、8.641、18.918、15.785，P＜0.05）和對(duì)照組（t=21.321、11.501、23.535、30.188，P＜0.05），健康種植體組亦高于對(duì)照組（t=3.872、2.178、3.858、9.934，P＜0.05），且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 齦溝液中miR-146a與miR-21水平比較 種植體周?chē)捉M齦溝液中miR-146a、miR-21水平均顯著高于健康種植體組（t=9.768、7.952，P＜0.05）和對(duì)照組（t=20.310、20.657，P＜0.05），健康種植體組亦高于對(duì)照組（t=15.646、19.662，P＜0.05），且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表1 3組臨床指標(biāo)比較（±s）

表1 3組臨床指標(biāo)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與健康種植體組比較，②P＜0.05

組別 齦溝出血指數(shù) 探診深度（mm） 齦溝液量（μl） 骨吸收量（mm）種植體周?chē)捉M（n=60） 3.24±1.03①② 4.23±1.15①② 1.95±0.36①② 2.71±0.45①②健康種植體組（n=48） 0.79±0.24① 2.72±0.64① 0.87±0.23① 1.48±0.36①對(duì)照組（n=75） 0.65±0.18 2.51±0.48 0.72±0.22 1.03±0.14 F 366.916 82.854 342.386 351.916 P 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 齦溝液中miR-146a與miR-21水平比較（±s）

表2 齦溝液中miR-146a與miR-21水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與健康種植體組比較，②P＜0.05

組別 miR-146a miR-21種植體周?chē)捉M（n=60） 3.86±1.15①② 3.65±1.12①②健康種植體組（n=48） 2.21±0.56① 2.34±0.58①對(duì)照組（n=75） 1.01±0.32 0.89±0.24 F 242.797 247.640 P 0.000 0.000

2.3 齦溝液中miR-146a、miR-21水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系 齦溝液中miR-146a與miR-21水平與齦溝出血指數(shù)、探診深度、骨吸收量呈正相關(guān)（P＜0.05），與齦溝液量無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 齦溝液中miR-146a、miR-21水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系

3 討論

由于種植體周?chē)M織代謝與免疫能力降低，當(dāng)口腔衛(wèi)生不佳時(shí)易出現(xiàn)種植體周?chē)?。?jù)相關(guān)研究表明，種植體周?chē)装l(fā)生率高達(dá)20%左右，其可導(dǎo)致種植體脫落、種植術(shù)失敗，因此明確種植體齦溝液中相關(guān)指標(biāo)與種植體周?chē)着R床指標(biāo)的關(guān)系，對(duì)于預(yù)防種植體周?chē)装l(fā)生及牙種植成功具有積極意義[6]。本研究顯示，種植體周?chē)捉M患者齦溝液中miR-146a與miR-21水平呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與種植體周?chē)着R床指標(biāo)呈正相關(guān)，對(duì)于評(píng)估種植體周?chē)椎陌l(fā)生具有較好價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，種植體周?chē)捉M齦溝出血指數(shù)、探診深度、齦溝液量、骨吸收量均顯著高于健康種植體組和對(duì)照組，說(shuō)明齦溝出血指數(shù)、探診深度、齦溝液量可反映種植體周?chē)谆顒?dòng)狀況及炎癥程度，是種植體周?chē)籽装Y進(jìn)展及牙周組織損傷程度的重要評(píng)估指標(biāo)[7，8]。骨吸收量是骨重建的重要參考指標(biāo)，骨吸收增加會(huì)使牙體穩(wěn)定性下降。探診深度表示牙周袋深度，在炎癥牙齦中深度更深，是評(píng)估牙周健康狀況的重要臨床指標(biāo)之一，組織有炎癥時(shí)牙齦探針可穿透結(jié)合上皮進(jìn)入結(jié)締組織內(nèi)，而健康牙齦則中止于結(jié)合上皮，因此在炎癥牙齦中深度更深。齦溝液量水平可反映牙周組織炎癥情況。齦溝出血指數(shù)是評(píng)估牙齦炎癥活動(dòng)期狀況的臨床指標(biāo)，是評(píng)估牙周炎癥的重要指標(biāo)之一[9，10]。

通過(guò)檢測(cè)齦溝液中miR-146a與miR-21水平發(fā)現(xiàn)，種植體周?chē)捉M齦溝液中miR-146a、miR-21水平均顯著高于健康種植體組和對(duì)照組，說(shuō)明miR-146a與miR-21可能與種植體炎癥反應(yīng)有關(guān)。對(duì)齦溝液中miR-146a、miR-21水平與種植體牙周炎癥臨床指標(biāo)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-146a及miR-21水平與齦溝出血指數(shù)、探診深度、骨吸收量呈正相關(guān)，可作為評(píng)估種植體周?chē)M織健康狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。究其原因?yàn)槲⑿NA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，參與細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程，在慢性炎癥疾病中表達(dá)異 常[11，12]。miR-146包 括miR-146a和miR-146b兩個(gè)亞型，miR-146a是重要的免疫調(diào)控因子，在慢性炎性疾病中呈高表達(dá)，可能與介導(dǎo)炎癥因子信號(hào)傳導(dǎo)，發(fā)揮免疫細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)功能，參與慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程有關(guān)[13，14]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，miR-146a在牙齦炎性組織中呈較高表達(dá)，其可促進(jìn)巨噬細(xì)胞活性增強(qiáng)，介導(dǎo)炎癥因子釋放增加，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)過(guò)程，可能是導(dǎo)致牙周炎癥發(fā)展的重要原因[15，16]。miR-21是參與細(xì)胞增殖、分化的重要的miRNA，miR-21可通過(guò)調(diào)控RunX2蛋白，發(fā)揮對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，可反映成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化趨勢(shì)。牙周干細(xì)胞具有更新、分化和免疫調(diào)節(jié)特性，在維持牙周環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。牙周有炎癥時(shí)炎性因子大量分泌，促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，導(dǎo)致骨吸收失衡，進(jìn)而影響種植體穩(wěn)定性[17，18]。較高水平的miR-21可刺激超氧化物歧化酶分泌，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌，活性增加，與超氧化物歧化酶水平呈正相關(guān)[19，20]。也有研究指出，miR-21可通過(guò)促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，促進(jìn)成骨分化，進(jìn)而參與牙周組織損失、修復(fù)過(guò)程，其水平升高與牙周組織損傷程度密切相關(guān)[21]。通過(guò)檢測(cè)齦溝液中miR-146a與miR-21水平可了解牙周組織炎癥活動(dòng)狀況及牙周組織損傷情況，進(jìn)而為種植體周?chē)自u(píng)估提供參考。對(duì)種植體周?chē)装Y組織進(jìn)行有效清除，以骨替代材料填充引導(dǎo)骨組織再生，促進(jìn)新骨形成，進(jìn)而提高種植成功率[22]。但吸煙、飲酒、不良口腔衛(wèi)生習(xí)慣等會(huì)影響種植體組織修復(fù)情況，因此，miR-146a與miR-21在種植體周?chē)字械淖饔脵C(jī)制還需進(jìn)一步研究，進(jìn)而為臨床種植成功率的提高提供參考。

綜上所述，種植體周?chē)谆颊啐l溝液中miR-146a、miR-21水平顯著升高，其可為預(yù)測(cè)種植體周?chē)装l(fā)生提供依據(jù)，通過(guò)預(yù)防種植體周?chē)装l(fā)生，以提高牙種植效果。