古代經(jīng)典名方芍藥甘草湯基準樣品的制備工藝研究

湯春花，梁鳳友，林碧珊，高永堅，曾杉

（國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305）

經(jīng)典名方芍藥甘草湯出自東漢張仲景的《傷寒論·辨太陽病脈證并治》第29條：“傷寒脈浮，自出汗，小便數(shù)，心煩，微惡寒，腳攣急……若厥愈足溫者，更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸”。原處方為：白芍藥、甘草（炙，各四兩），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服[1]。張仲景的芍藥甘草湯被歷代醫(yī)家推崇，其加減組方一直沿用至今[2]，是國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中的經(jīng)典名方之一。主治津液受損、陰血不足、筋脈失濡所致諸證。方中芍藥酸寒，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痛；甘草甘溫，健脾益氣，緩急止痛。二藥相伍，酸甘化陰，調(diào)和肝脾，有柔筋止痛之效。根據(jù)文獻論著可知[3-8]，芍藥甘草湯基準樣品的現(xiàn)代制備工藝為：取白芍、炒甘草飲片各12 g，加水600 mL，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮至煎液約300 mL，過濾，即得。

據(jù)文獻報道[9]，芍藥甘草湯含量測定指標主要是芍藥苷、甘草苷、甘草酸等成分，且均已被證實為該方的藥效成分。本研究在前人考證的基礎(chǔ)上，通過試驗考察確定浸泡時間、煎煮容器材質(zhì)、煎煮時間、過濾方式對芍藥甘草湯基準樣品制備工藝的影響，以出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量作為評價指標，確定最佳制備工藝并進行了工藝驗證，為芍藥甘草湯進一步開發(fā)為復方顆粒提供依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

H-class UPLC色譜儀（PDA二極管陣列檢測器，Waters公司）；500瓦陶瓷鍋（深圳市一枚王電子商務有限公司）；不銹鋼鍋；SY-901多功能電磁爐（中山市南菱電子科技有限公司）；HH-4型水浴鍋（常州奧華儀器有限公司）；HN101型電熱鼓風干燥箱（上海蘇進儀器設(shè)備廠）；AL104型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ5200DA型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ST 16型高速離心機（Thermo）。

1.2 試藥

芍藥苷（批號：110736-201741）、甘草苷（批號：111610-201607）、甘草酸銨（110731-201720）由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙腈為HPLC級，實驗用其他試劑均為AR級。

1.3 藥材

生白芍（安徽亳州，批號：H-BS01Y）、甘草（甘肅酒泉，批號：H-ZGC01Y），由廣東一方制藥有限公司鑒定分別為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖，按2020年版《中國藥典》[10]檢驗均合格。白芍飲片、炒甘草飲片分別按2020年版《中國藥典》[10]和2008年版《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[11]炮制而得。

2 試驗方法

2.1 樣品的制備方法

取白芍、炒甘草飲片各12 g，加水600 mL，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮至煎液約300 mL，過濾，即得。

2.2 出膏率測定

取芍藥甘草湯煎液10 g，精密稱定，水浴蒸干后，105℃烘箱干燥3 h，置干燥器中放冷，精密稱重，測得干固物質(zhì)量，計算固含率（%）和出膏率（%），公式如下：

2.3 浸出物含量測定

取芍藥甘草湯煎液50 g，精密稱定，置分液漏斗中，加水飽和正丁醇萃取3次，每次50 mL，合并正丁醇層，置已稱重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干溶劑，并在105℃烘箱中烘干3 h，取出放置于干燥器中放冷，精密稱定，計算浸出物含量，公式如下：

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18柱（1.7 μm，2.1×100 mm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～7 min，5%→15%A；7～15 min，15%→50%A；15～18 min，50%→100%A）；流速為0.25 mL/min；柱溫為30℃；進樣量1 μL；檢測波長為230 nm。

2.4.2 對照品溶液制備

取芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含芍藥苷80 μg、甘草苷20 μg、甘草酸銨200 μg的混合溶液，即得。

2.4.3 供試品溶液制備

取相當于0.12 g干固物的芍藥甘草湯煎液，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）20 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 含量測定方法學考察

2.4.4.1 專屬性考察精密吸取供試品溶液（批號：SG200531）、混合對照品溶液與白芍、甘草陰性樣品溶液各1 μL，按“2.4.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，陰性樣品溶液在供試品溶液色譜圖相應位置上無對應色譜峰出現(xiàn)，說明該方法專屬性較好。

圖1 專屬性考察Figure 1 Exclusivity investigation

2.4.4.2 線性考察分別精密稱定芍藥苷對照品21.08 mg（純度96.8%）、甘草苷對照品10.19 mg（純度95.0%）、甘草酸銨對照品20.87 mg（純度96.2%），置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成每1 mL含芍藥苷408.11 μg、甘草苷193.61 μg、甘草酸銨401.54 μg的對照品溶液。

分別精密量取芍藥苷、甘草苷和甘草酸銨對照溶液適量，逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為50%、25%、12.5.%、6.25%、3.125%的溶液，按照“2.4.1”項中色譜條件測定，記錄不同質(zhì)量濃度（x）對照品的色譜峰面積（y），擬合得到線性回歸方程為：芍藥苷y=2 731.5x-5 538.7（r=0.999 6）、甘草苷y=4 777x-1 205.5（r=0.999 9）、甘草酸銨y=787x-487.3（r=0.999 9），結(jié)果表明芍藥苷、甘草苷、甘草酸銨分別在12.75～408.11、6.05～193.61、12.55～401.54 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4.3 精密度試驗精密吸取供試品溶液（批號：SG200531），按“2.4.1”項下色譜條件重復進樣6次，測定芍藥苷、甘草苷、甘草酸的峰面積和含量，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.81%～4.85%、1.39%～1.41%、1.75%～1.78%，RSD分別為0.46%、0.54%和0.77%，表明精密度良好。

2.4.4.4 穩(wěn)定性試驗精密吸取供試品溶液（批號：SG200531），按“2.4.1”項下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h進樣，測定芍藥苷、甘草苷、甘草酸的峰面積和含量，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別為4.82%～4.84%、1.39%～1.42%、1.72%～1.76%，RSD分別為0.27%、0.78%和0.85%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.5 重復性試驗分別取相當于0.06、0.12、0.18 g干固物的芍藥甘草湯煎液（批號：SG200531），精密稱定，制備3種不同濃度的供試品溶液，每種濃度平行3份。按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.78%～4.91%、1.38%～1.43%、1.72%～1.78%，RSD分別為0.76%、1.01%和1.03%，表明該分析方法的重復性良好。

2.4.4.6 中間精密度考察由本項目組其他分析人員在不同日期和不同色譜儀下操作。分別取相當于0.06、0.12、0.18 g干固物的芍藥甘草湯煎液（批號：SG200531），精密稱定，制備3種不同濃度水平的供試品溶液，每種濃度平行3份。按“2.4.1”項下色譜條件分析測定芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍RSD分別為0.76%、0.66%、0.90%，表明中間精密度良好。

2.4.4.7 加樣回收試驗分別取相當于0.03、0.06、0.09 g干固物的芍藥甘草湯煎液（批號：SG200531），精密稱定，分別加入50%、100%和150%濃度的芍藥苷、甘草苷、甘草酸對照溶液，制備成供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，計算芍藥苷、甘草苷、甘草酸回收率（n=9）分別為97.76%、98.57%、98.63%，RSD分別為1.22%、0.86%、2.23%，均滿足2020年版《中國藥典》[10]要求。

2.4.4.8 耐用性考察

①不同色譜柱考察

精密吸取供試品溶液（批號：SG200531），按“2.4.1”項下色譜條件，分別考察了5種不同類型的色譜柱Agilent SB C18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）、Waters BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、Agilent Bonus RP C18柱（1.7μm，2.1 mm×100 mm）、Waters CSH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、YMC Triart C18柱（1.9 μm，2.1 mm×100 mm）對芍藥苷、甘草苷、甘草酸色譜峰的分離情況，見圖2。結(jié)果顯示，Waters BEH C18色譜柱分離效果最佳，故選擇Waters BEH C18色譜柱進行研究。

圖2 不同色譜柱的考察Figure 2 Investigation of different chromatographic columns

②不同柱溫考察

精密吸取供試品溶液（批號：SG200531），按“2.4.1”項下色譜條件，分別在不同柱溫（25、30、35℃）平行進樣2次，考察對芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量測定的影響。實驗顯示，25、30、35℃柱溫下，芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.82%～4.85%、1.39%～1.42%、1.71%～1.75%，RSD值分別為0.31%、0.86%、0.94%，表明不同柱溫對指標含量的影響較小，本實驗選擇柱溫30℃。

③不同流速考察

精密吸取供試品溶液（批號：SG200531），按“2.4.1”項下色譜條件，分別在不同流速（0.20、0.25、0.30 mL/min）平行進樣2次，考察對芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量測定的影響。結(jié)果顯示三種流速下芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量范圍分別是4.84%～4.85%、1.37%～1.40%、1.72%～1.76%，RSD分別為0.17%、0.76%、0.81%，表明流速對含量測定影響較小，本實驗選擇流速0.25 mL/min。

3 基準樣品制備工藝研究

3.1 預實驗（得液量的考察）

取同一批白芍、炒甘草飲片各12 g，分成兩組，每組平行6份，置陶瓷鍋中，加水600 mL，浸泡30 min，武火煮沸后，第一組選用功率200 W分別煎煮20、40、60 min，第二組選用功率300 W分別煎煮20、40和60 min，趁熱過濾考察得液量，結(jié)果見表1。結(jié)果表明功率200 W煎煮60 min和300 W煎煮40 min，得液量在300 mL±10%之間，符合試驗目標。

表1 得液量考察Table 1 Investigation of decoction volume

3.2 浸泡時間的考察

取同一批白芍、炒甘草飲片各12 g，平行6份，分別浸泡30 min和60 min，同法煎煮、過濾。按照“2.2”“2.3”“2.4”項下的方法測定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見表2。結(jié)果表明不同浸泡時間對出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均無明顯影響。為提高效率，選擇浸泡30 min。

表2 浸泡時間考察Table 2 Investigation of soaking time w/%

3.3 煎煮器具的考察

取同一批白芍、炒甘草飲片各12 g，平行6份，分別置陶瓷鍋和不銹鋼鍋，同法煎煮，所得煎液約300 mL，趁熱過濾。按照“2.2”“2.3”“2.4”項下的方法測定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示陶瓷鍋基準樣品出膏率和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量優(yōu)于不銹鋼鍋，故采用陶瓷鍋作為煎煮容器。

表3 煎煮器具的考察Table 3 Investigation of decoction utensils w/%

3.4 煎煮時間的考察

取同一批白芍、炒甘草各12 g，平行6份，置陶瓷鍋中，加水600 mL，浸泡30 min，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮，其中三份功率300 W煎煮40 min，另三份功率200 W煎煮60 min，趁熱過濾。按照“2.2”“2.3”“2.4”項下的方法測定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示不同煎煮時間的出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均無明顯差異。為提高煎煮效率，選擇煎煮時間40 min。

表4 煎煮時間的考察Table 4 Investigation of decoction time w/%

3.5 過濾方式的考察

取同一批白芍、炒甘草飲片各24 g，置陶瓷鍋中，加水1 200 mL，浸泡30 min，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮40 min，所得煎液約600 mL，分成平行5份，分別采用不同的過濾方式：①趁熱用紗布過濾；②趁熱過200目篩網(wǎng)；③趁熱過350目篩網(wǎng)；④趁熱過680目篩網(wǎng)；⑤離心，取上清液。分別按照“2.2”“2.3”“2.4”項下的方法測定出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果見表5。結(jié)果表明五種過濾方式的出膏率、浸出物和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均無顯著差異，而紗布和200目網(wǎng)篩過濾濾液渾濁，350目篩網(wǎng)易過濾且濾液澄清，故采用350目網(wǎng)篩。

表5 過濾方式的考察Table 5 Investigation of filter method w/%

4 工藝驗證

綜上所述，芍藥甘草湯基準樣品的制備工藝為：取白芍、炒甘草飲片各12 g，置陶瓷鍋中，加水600 mL，浸泡30 min，武火煮沸轉(zhuǎn)文火煎煮40 min，所得煎液約300 mL，趁熱過350目篩網(wǎng)，即得。

按上述方法，平行制備6批標準煎液，按照“2.2”“2.3”“2.4”項下的方法測定其出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量，結(jié)果如表6所示，說明所建立的芍藥甘草湯基準樣品制備工藝穩(wěn)定可行，重復性好。

表6 工藝驗證結(jié)果Table 6 Results of process validation w/%

5 討論

經(jīng)典名方是至今仍廣泛應用、療效確切、具有明顯特色與優(yōu)勢的古代中醫(yī)典籍所記載的方劑。2018年5月，國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定》明確指出經(jīng)典名方復方制劑開發(fā)必須首先進行物質(zhì)基準（基準樣品）研究，為其后的制劑開發(fā)提供依據(jù)。在兩千多年的歷史發(fā)展過程中，經(jīng)典名方的藥物基原、炮制、劑量、煎煮法、功能主治等歷經(jīng)變化，莫衷一是，因此關(guān)鍵信息考證是經(jīng)典名方開發(fā)利用的關(guān)鍵性、源頭性問題?！秱摗穂1]記載的芍藥甘草湯“白芍藥甘草（炙，各四兩），上二味，以水三升，煮取一升五合，去滓，分溫再服”，據(jù)文獻考證[8]，原方芍藥基原為芍藥科多年生草本植物芍藥Peaonia lactifloraPall.的根；甘草基原為烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.。而對于原文所述“炙甘草”經(jīng)過考證應該是炒甘草，同時原文所述“白芍藥”即生用白芍藥。計量方面，原方的一兩合今3 g、一升合今200 mL[3-4]。

在“遵古”的基礎(chǔ)上充分考慮當前臨床和生產(chǎn)實際是經(jīng)典名方開發(fā)的主要原則[8]，本文在前人考證的基礎(chǔ)之上，通過試驗考察浸泡時間、煎煮容器材質(zhì)、煎煮時間、過濾方式對出膏率、浸出物以及芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量的影響，從而確定基準樣品最佳現(xiàn)代制備工藝。

根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[12]要求，煎煮前飲片的浸泡時間應不少于30 min。本文考察了浸泡30 min和浸泡60 min對評價指標的影響，結(jié)果顯示兩者差異不大，為提高效率選擇浸泡30 min。傳統(tǒng)的煎藥器皿主要以砂鍋、陶瓷鍋為主，現(xiàn)代煎藥多采用金屬不銹鋼容器進行煎煮，研究顯示陶瓷鍋煎煮在指標性成分濃度及出膏率上優(yōu)于砂鍋[13]，因此本文考察了陶瓷鍋和不銹鋼鍋對芍藥甘草湯煎煮的影響，結(jié)果顯示陶瓷鍋制得的基準樣品出膏率和芍藥苷、甘草苷、甘草酸含量均高于不銹鋼鍋，故采用陶瓷鍋作為煎煮容器。由于古籍記載古代煎藥多“常令文火小沸”[14]，故考察了文火煎煮40 min和煎煮60 min對煎液的影響，結(jié)果無明顯差異，為提高效率選擇煎煮時間40 min。文中還考察了5種不同過濾方式對煎液的影響，結(jié)果提示彼此無明顯差異，最終采用趁熱過350目篩網(wǎng)。還通過工藝驗證證明了制備工藝的穩(wěn)定可行，為芍藥甘草湯進一步開發(fā)為復方顆粒提供了科學依據(jù)。