基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡-白芍治療MDD作用機(jī)制

張冠英，張洪財，王文姌

(1.哈爾濱工程大學(xué)醫(yī)院，哈爾濱 150096；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用重點實驗室，哈爾濱 150040)

抑郁癥(MDD)是常見的一種慢性精神類疾病，以心境低落、悲觀失望為主要臨床特征.復(fù)發(fā)的可能性隨著發(fā)作次數(shù)的增加而增加，嚴(yán)重影響了人們的生活[1].近年來，中醫(yī)藥抗抑郁癥在臨床取得了較好的效果，逐漸受到人們的關(guān)注.

柴胡是常用中藥, 早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載，謂其:“主心腹, 去腸胃中結(jié)氣, 飲食積聚, 寒熱邪氣, 推陳致新, 久服輕身明目益精”.其性微寒, 味苦、辛, 歸肝膽經(jīng), 具有退熱、疏肝、升陽的功效[2].在《神農(nóng)本草經(jīng)》中白芍被列為中品，其曰:“主邪氣腹痛,除血痹,破堅積,治寒熱疝瘕,止痛,利小便,益氣.”其味苦且酸，性微寒，歸肝脾經(jīng)，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng),斂陰止汗,柔肝止痛,平抑肝陽[3].

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過對靶點分析，適合于中藥中多成分、多靶點、多途徑作用機(jī)制的研究.本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，旨在為闡明柴胡白芍治療抑郁癥的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù).

1 內(nèi)容與方法

1.1 內(nèi)容

基網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，采用TCMSP數(shù)據(jù)庫收集柴胡白芍的有效成分以及對應(yīng)的靶標(biāo)，采用TTD、Genecards、OMIM收集MDD疾病相關(guān)靶標(biāo)，通過分析，找出藥物發(fā)揮作用的核心成分與核心靶標(biāo)，通過string數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，然后進(jìn)行GO與KEGG Pathways富集分析，結(jié)合“藥物-核心成分-核心靶標(biāo)-相關(guān)通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖，通過數(shù)據(jù)庫尋找其潛在的作用機(jī)制.

1.2 柴胡白芍有效成分和靶點的收集

利用以上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索獲得柴胡白芍的主要成分后根據(jù)OB和DL兩個屬性對化合物進(jìn)行篩選.選擇 OB>30%、DL>0.18 同時滿足的化學(xué)成分作為為候選化合物的.將物種限定為人，獲取候選化合物對應(yīng)的的靶點.

1.3 MDD相關(guān)基因的獲得

利用Genecards數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞 “Parkinson’s Disease”，在Genecards檢索到714個靶點，TTD檢索到56個靶點，OMIM檢索到172個靶點，刪除重復(fù)基因，共收集到與抑郁癥相關(guān)靶點777個.

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)( PPI) 的構(gòu)建及分析

將收集的MDD靶點與柴胡白芍作用靶點進(jìn)行Venn分析，篩選出兩者共同的靶點.然后將篩選的共同靶點上傳至在線String軟件，將蛋白質(zhì)種類設(shè)置為" Homo Sapiens”、作用閾值設(shè)置為“mediumconfidence”、其他條件保持默認(rèn)設(shè)置等進(jìn)行操作，摸清靶點蛋白之間的相互作用，構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型.再通過將化合物ID和其對應(yīng)的基因?qū)隒ytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化分析，利用“Network Analysis”功能進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯鶕?jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選關(guān)鍵靶蛋白.通過計算網(wǎng)絡(luò)里的betweenness分布，degree分布等基本屬性，可以對網(wǎng)絡(luò)的整體性質(zhì)進(jìn)行評價.選擇degree 前十位的靶點，認(rèn)為是柴胡白芍作用的關(guān)鍵靶蛋白.

1.5 GO生物過程與KEGG通路富集分析

DAVID 數(shù)據(jù)庫(http://david.niaid.nih.gov)是集基因注釋、可視化和整合發(fā)現(xiàn)等功能為一體的在線數(shù)據(jù)庫，為基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合生物功能注釋信息.用篩選得到的共同靶點進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析.GO分析包含細(xì)胞組分、分子功能和生物過程三方面，KEGG數(shù)據(jù)庫通過對通路的研究將基因、基因組信息以及更高層次的功能信息相結(jié)合，對基因的功能進(jìn)行系統(tǒng)化分析.選擇對應(yīng)的物種 “Homo Sapiens”，以P<0.05為閾值，從中篩選柴胡白芍散治療抑郁癥顯著的生物學(xué)過程和信號通路，為進(jìn)一步闡明柴胡白芍治療MDD機(jī)制提供依據(jù).

2 實驗結(jié)果

2.1 活性成分篩選

共檢索到柴胡白芍治療抑郁癥的候選成分共29個.白芍13個，柴胡16個.

2.2 化合物靶點檢索與疾病靶點檢索

TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到215個不同的化合物作用靶點.Genecards、TTD和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到777個與MDD相關(guān)不重復(fù)的疾病靶點，與柴胡白芍相重合的靶點共52個.

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將前面篩選得到的交叉靶點輸入String軟件構(gòu)建了柴胡白芍治療抑郁癥相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，可以顯示蛋白質(zhì)分子之間的間接功能相關(guān)性和蛋白質(zhì)分子之間直接的物理相互作用.我們基于數(shù)據(jù)庫 0.95 置信度進(jìn)行構(gòu)圖.PPI網(wǎng)絡(luò)中涵蓋了number of nodes52個nodes，number of edges367條edges，該網(wǎng)絡(luò)的平均介數(shù)(betweenness )local clustering coefficient為0.664、平均度值average node degree(degree)為14.1，結(jié)果見圖1.經(jīng)過分析度值高于其平均值的有22個靶點，分別為：NOS3、AHR、IL2、CAT、AKT1、NOS2、TP53、ICAM1、EP300、IL1B、PTGS2、CXCL8、VEGFA、IL10、ESR1、TGFB1、MPO、IFNG、CRP、EGF、SOD1、HIF1A.提示柴胡白芍治療抑郁癥可能是通過作用于以上靶點.

圖1 柴胡白芍作用于抑郁癥靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Figure 1 The protein interaction network of Bupleurum and Baishao on depression targets

2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將化合物ID和對應(yīng)的基因?qū)隒ytoscape 軟件進(jìn)行進(jìn)一步的可視化處理，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的Degree值與重要性成正比.篩選出Degree值≥10的靶點，構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析可以看出，靶點和成分并不是一一對應(yīng)的，完全體現(xiàn)了柴胡白芍多成分、多靶點的作用機(jī)制.經(jīng)分析可知活性成分靶點-蛋白網(wǎng)絡(luò)共建中擁有244個節(jié)點與908個相互作用連線，對于化合物，槲皮素(quercetin)的連接度最高，能與145個靶點蛋白發(fā)生相互作用; 對于靶點，GABRA1的Degree 最高為62.如圖2.

圖2 化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(圓形-化合物； 正方形-靶點； 菱形-疾病靶點)Figure 2 Compound-target-disease network diagram(pink circle-compound blue square-target purple diamond-disease target)

2.5 候選靶標(biāo)基因功能分析

將候選靶基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因分析，得到候選靶標(biāo)具有的功能信息313條,用P<0.05對其進(jìn)行篩選，GO富集分析所得236條功能關(guān)系，顯示參與生物學(xué)過程(biological process，BP)174個，主要涉及對雌二醇反應(yīng)、對脂多糖應(yīng)答、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對藥物反應(yīng)等.細(xì)胞組成(cellular component，CC)26個,主要涉及細(xì)胞外空間、等離子膜、線粒體、后突觸膜等.分子功能(molecular function，MF)36個， 主要涉及酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、細(xì)胞因子活性等.對前幾個進(jìn)行可視化分析，如圖3.

圖3 GO富集分析Figure 3 GO enrichment analysis

2.6 KEGG 通路富集分析

以P<0.05對KEGG通路進(jìn)行篩選，得到67條信號通路，有神經(jīng)活性配體-受體相互作用、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、鈣信號通路、甲狀腺激素信號通路、癌癥途徑、尼古丁成癮、多巴胺能突觸、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用.對前幾個進(jìn)行可視化處理，如圖4.

圖4 KEGG富集分析Figure 4 KEGG enrichment analysis

3 討 論

中醫(yī)藥是我國未來創(chuàng)新藥行業(yè)發(fā)展的重點，其多成分、多靶點、多途徑的復(fù)雜特征，成為我國的中醫(yī)藥走向國際和現(xiàn)代化的巨大障礙[4].網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運用各種數(shù)學(xué)手段分析藥物在網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點和節(jié)點間的關(guān)系，加速了藥物靶點的確認(rèn)以及發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，由原來的尋找單一靶點轉(zhuǎn)向綜合網(wǎng)絡(luò)分析.本研究采用TCMSP平臺篩選出柴胡白芍活性成分29個，作用于抑郁癥的潛在靶點蛋白52個.在化合物研究方面，quercetin(槲皮素)可以減輕大鼠腹腔內(nèi)注射LPS引起的抑郁癥樣行為，LPS挑戰(zhàn)的老鼠不僅表現(xiàn)出抑郁樣的行為和學(xué)習(xí)和記憶的損傷，SPT中SIP的增加和FST中固定時間的縮短，還呈現(xiàn)TREM1表達(dá)的減少和TREM2在海馬和PFC中表達(dá)的增加，槲皮素可以逆轉(zhuǎn)這些變化，其抗抑郁作用的機(jī)理可能與其調(diào)節(jié)海馬和PFC中Copine 6和其他突觸可塑性相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的BDNF相關(guān)不平衡的能力和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥有關(guān)，同時Quer可以防止抗氧化酶的損傷，同時調(diào)節(jié)血清和膽堿神經(jīng)遞質(zhì)，產(chǎn)生抗抑郁作用，并在小鼠2h固定應(yīng)激后增強記憶力[5-6].Paeoniflorin(芍藥苷)可以緩解患有CUMS的老鼠的抑郁，明顯增加糖的偏好指數(shù)、總運動距離和中央運動時間，并減少CUMS模型大鼠FST的不動時間，芍藥苷可以顯著提高ERK1、ERK2和CREB mRNA表達(dá)水平，在CUMS暴露大鼠的海馬體中，ERK、p-ERK、CREB和p-CREB蛋白表達(dá)水平可以顯著提高，改善了海馬體神經(jīng)細(xì)胞的病理損傷，表明海馬體神經(jīng)細(xì)胞的抗抑郁作用和保護(hù)作用可以通過ERK-CREB信號通路(BDNF的下游路徑)進(jìn)行調(diào)解，同時還抑制了GSDMD的增強表達(dá)和脂多糖( LPS )和腺苷三磷酸酯( ATP )誘發(fā)的皮質(zhì)疏松癥在體內(nèi)的 Murine N9 微膠質(zhì)，通過抑制 CASP - 11 ， NLRP3 ， CASP - 1 以及 IL - 1+ 的表達(dá)證明了這一點，數(shù)據(jù)表明，PF發(fā)揮抗抑郁作用，通過抑制CASP-11依賴性脊柱側(cè)彎，減輕神經(jīng)炎癥，信號傳遞由過度激活的微膠質(zhì)在海馬中誘導(dǎo)的，激活微膠質(zhì)中的GSDMD介制的脊柱側(cè)彎是一種新的抑郁癥炎癥機(jī)制，在PF管理下是緩解抑郁癥的獨特治療機(jī)會[7-9].beta-sitosterol(β-谷甾醇)可顯著減少FST和TST的不動時間表明抗抑郁效果，可顯著增加5-HIAA水平，表明減少5-HT新陳代謝，中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE和DA的調(diào)節(jié)在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起著一定的作用.單胺神經(jīng)遞質(zhì)的代謝紊亂被認(rèn)為是抑郁癥的主要生化原因，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的單胺神經(jīng)遞質(zhì)水平可以減輕抑郁癥的癥狀.此抗抑郁作用可能通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT和NE的增加來調(diào)停[10-11].對于疾病靶點分析，PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，復(fù)方主要通過調(diào)控GABRA1、PTGS2、TNFRSF1A、AHR、HTR2A、AKT1、CHRM2等靶點達(dá)到抗MDD作用.伽馬-氨基丁酸(GABA)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)與情緒障礙的發(fā)病機(jī)制有關(guān),GABRA1為基因編碼GABA-A受體的子單位之一，位于人類染色體5q34-q35上，據(jù)報道，該染色體與情緒障礙有關(guān).同時在酒精成癮的模型下，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 和 +1 γ-氨基丁酸 A 受體 (Gabra1) 的表達(dá)在前額皮層 (PFC) 中都減少了，進(jìn)一步的相關(guān)分析表明，減少的Adlercreutzia spp.與酒精偏好呈正相關(guān)，與焦慮行為和PFC中的BDNF/Gabra1變化呈負(fù)相關(guān).綜合起來研究表明，在長期飲酒期間腸道微生物群發(fā)育不良與酒精誘發(fā)的神經(jīng)精神病行為和BDNF/Gabra1表達(dá)密切相關(guān)，這為理解酒精成癮的基本機(jī)制提供了新的視角[12-14].AKT1編碼的血清素/三氨基激酶，在幾個正常和病理細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用，其最著名的就是糖原合成酶激酶-3(GSK3)，鋰的主要目標(biāo)，BD的一線療法[15-16].TNFRSF1A基因編碼腫瘤壞死因因子受體1(TNFR1)，而TNFRSF1A表達(dá)的放松管制可能是導(dǎo)致中風(fēng)后抑郁癥發(fā)展的原因,因此，快速細(xì)胞核刺激有可能通過miR-29c和TNFRSF1A信號通路抑制大腦中的炎癥.在中風(fēng)后抑郁癥的鼠模型中，TNFRSF1A mRNA的相對水平顯著提高，快速核刺激治療可以在一定程度上減少TNFRSF1A mRNA的表達(dá)，快速細(xì)胞核刺激組的TNFRSF1A mRNA水平大于假細(xì)胞和中風(fēng)組.此外，在中風(fēng)后抑郁癥的老鼠模型中，包括TNF-α、IL-6和IL-1+在內(nèi)的炎癥細(xì)胞因子水平都有所增加，并且通過快速細(xì)胞核刺激的治療而降低，在正常受試者和耐藥抑郁癥患者之間發(fā)現(xiàn)了不同水平的TNF、TNFRSF1A和TNFRSF1B基因表達(dá)，患有復(fù)發(fā)性抑郁癥的人在蛋白質(zhì)和mRNA水平(26-33)上增加了TNF、TNFRSF1A和TNFRSF1B基因的表達(dá)， TNF-α、TNFRSF1A 和 TNFRSF1B 的提升表達(dá)與認(rèn)知效率呈負(fù)相關(guān)[17-18].對于GO富集結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)藥物參與extracellular space、response to drug、response to lipopolysaccharide、signal transduction、enzyme binding等生物過程發(fā)揮抗MDD作用.大腦中的細(xì)胞外空間(ECS)是多種神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的另一種交流渠道.通過ECS進(jìn)行信號傳輸?shù)闹匾栽缫驯还J(rèn)，被稱為“突觸外傳輸”或“體積傳輸”，由于突觸溢出或遞質(zhì)-受體錯配，從封閉的突觸中逃逸的神經(jīng)遞質(zhì)和非囊泡轉(zhuǎn)運體通過囊泡填充的靜脈曲張釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和非囊泡轉(zhuǎn)運體進(jìn)行容積傳遞.這種信號傳遞模式通過突觸周圍的自身受體來微調(diào)突觸傳遞，是神經(jīng)元和維持健康的星形膠質(zhì)細(xì)胞之間雙向通訊的基礎(chǔ)，并與一種特定的大腦事件-皮層擴(kuò)散性抑制的傳播有關(guān).大腦中的許多生理和病理事件都伴隨著所涉及細(xì)胞的短暫腫脹.細(xì)胞膨脹改變了ECS基礎(chǔ)設(shè)施，進(jìn)而改變了所有細(xì)胞外信使的體積傳輸.反應(yīng)后腫脹的細(xì)胞可能會激活級聯(lián)的體積調(diào)節(jié)過程，以補償所引起的體積變化.在SD的例子中，細(xì)胞外K+和谷氨酸的大量釋放和間質(zhì)擴(kuò)散被認(rèn)為是神經(jīng)元去極化和活動抑制的波狀傳播的原因，盡管細(xì)胞內(nèi)繁殖的機(jī)制也被假設(shè)[19].抑郁癥社會信號轉(zhuǎn)導(dǎo)理論是一種生物學(xué)上合理的多層次理論，它描述了神經(jīng)、生理、分子和基因組機(jī)制，將社會環(huán)境逆境的經(jīng)驗與驅(qū)動抑郁癥發(fā)病機(jī)理、維持和復(fù)發(fā)的內(nèi)部生物過程聯(lián)系起來.這一理論的核心是，涉及社會威脅(例如社會沖突、評估、拒絕、隔離和排斥)的人際壓力因素會加劇炎癥過程，這些炎癥過程可誘發(fā)若干抑郁癥狀，包括悲傷情緒、厭氣、疲勞、精神運動遲鈍和社會行為戒斷.大腦區(qū)域在處理社會和身體威脅痛苦發(fā)揮作用.將其反過來投射到低級區(qū)域，通過幾個非相互排斥的途徑，包括交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)，下丘腦-垂體腎上腺(HPA)軸，迷走神經(jīng)，和腦膜淋巴血管，這種對社會威脅的多層次神經(jīng)生物學(xué)反應(yīng)，以前稱之為對逆境的保存轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其特點是免疫系統(tǒng)資源有系統(tǒng)地轉(zhuǎn)移到增加親炎和減少抗病毒(即I型干擾素反應(yīng))狀態(tài)，稱為細(xì)胞因子的小可溶性蛋白質(zhì)在這種反應(yīng)中起著核心作用，對于理解抑郁癥和抑郁癥相關(guān)身體疾病狀態(tài)的發(fā)病機(jī)制具有極其重要的作用，因為它們具有許多生理、認(rèn)知和行為效應(yīng)，可以強烈地影響疾病風(fēng)險[20].KEGG通路分析顯示，藥通過參與Neuroactive ligand-receptor interaction、Pathways in cancer、Calcium signaling pathway、Estrogen signaling pathway信號通路等多種疾病通路發(fā)揮其抗MDD作用.抑郁癥 (MDD) 在癌癥患者中很常見，患者通常顯示血漿色氨酸水平下降和基努寧量的增加，同時Th1型免疫活化標(biāo)記新肽升高.在抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中，親炎性細(xì)胞因子干擾素伽馬(IFN-γ)誘導(dǎo)兩者，酶因多胺2，3-二氧酶(IDO)降解色氨酸酶和酶GTP-環(huán)氫酶I形成新肽，血液中新肽含量高以及基努他寧與色氨酸比(Kyn/Trp)增加，沿基努寧通路的炎癥介質(zhì)色氨酸催化與疲勞和貧血以及抑郁癥和固體腫瘤患者的QoL減少有關(guān).事實上，增強色氨酸分解可能大大有助于癌癥患者的貧血、疲勞和抑郁癥的發(fā)展.而且癌癥中的社會心理壓力因素包括炎癥和氧化/硝基應(yīng)激、免疫素量下降和 自主神經(jīng)系統(tǒng)和下丘腦垂動軸功能失調(diào)的激活都有可能加重抑郁癥的風(fēng)險[21-22].報告顯示，MDD患者的癥狀過程與荷爾蒙波動期之間有很高的關(guān)聯(lián)，在分子水平上，與健康受試者相比，MDD的GPER水平有所提高，據(jù)報告顯示，雌激素通過在腦血流中具有調(diào)節(jié)作用來促進(jìn)葡萄糖代謝，并可以增強電子傳輸鏈活動，為神經(jīng)元提供更多能量，此外，雌激素還通過抗炎作用，提供神經(jīng)保護(hù)，它們調(diào)節(jié)和促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)素的合成，如大腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，這是一種高度牽連到各種精神疾病的分子，因為它在神經(jīng)元生存、分化和突觸可塑性方面具有相關(guān)作用，而且雌激素和雌激素信號在調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(如多巴胺、血清和谷胱甘肽)方面液發(fā)揮著相關(guān)作用，并積極參與認(rèn)知功能，雌激素和雌激素信號在多種精神疾病中被破壞，不同程度的干擾影響不同的下游細(xì)胞級聯(lián)[23].綜上所述，推測柴胡白芍可能通過作用上述受體及對應(yīng)信號通路來治療抑郁癥.