新型根管封閉劑HiFlow 抗菌性能的體外研究

邢 陽 馮立新 徐 穎 王 戈 李芷萱

完美的根管充填材料應(yīng)該能夠?qū)Ω芟到y(tǒng)實(shí)現(xiàn)三維空間的、嚴(yán)密的充填，同時(shí)將根管與其周圍的根尖周組織交通隔斷。AH plus 根管封閉劑具有良好的物理性質(zhì)以及化學(xué)性質(zhì)，已作為“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用于熱牙膠充填的臨床應(yīng)用中[1]。iRoot SP 根管封閉劑是一種新型的硅酸鹽生物陶瓷類根管封閉劑，無鋁成分，其理化特性與無機(jī)三氧化聚合體(Mineral trioxide aggregate，MYA)相似，具有良好的X 線阻射性、生物相容性、抗菌抑菌性，不存在凝固收縮或者膨脹，粘接性及封閉性良好，已受到臨床廣泛的重視[2]，但由于其受熱后可能產(chǎn)生變性，因此目前對(duì)于其在高溫狀態(tài)下的根尖封閉性能及抗菌性尚存在爭(zhēng)議[3]。HiFlow 根管封閉劑是一種專門為熱牙膠垂直加壓充填法而設(shè)計(jì)的硅酸鈣基類預(yù)混合根管封閉劑，其主要化學(xué)成分與iRoot SP 根管封閉劑相似，僅粒度分布不同，有研究報(bào)道稱其具有良好的生物相容性、生物活性，易于滲透入牙本質(zhì)小管內(nèi)，從而提高其抑菌性能、粘接強(qiáng)度及封閉性能，此外HiFlow 根管封閉劑還具有低收縮性以及X 線阻射性[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇AH plus 根管封閉劑與iRoot SP 根管封閉劑兩種經(jīng)典的根管封閉劑與HiFlow 根管封閉劑進(jìn)行體外抗菌性能的比較，從而對(duì)HiFlow 根管封閉劑的體外抗菌性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.材料與方法

1.1 材料及器械 Endo Sequnce RC Sealer Hi Flow 根管封閉劑(Rrasseler USA，美國)；AH Plus根管封閉劑(Dentsply，瑞士)；iRoot SP 根管封閉劑(Innovative RioceramixInc，Vancouver，加拿大)；復(fù)合樹脂Z350(3M，美國)；Protaper Universial機(jī)用鎳鈦銼(登士柏，瑞士)；熱牙膠充填系統(tǒng)(SybronEndo，美國)；0.06 錐度牙膠尖(北京達(dá)雅鼎，中國)；垂直加壓器(SybronEndo，美國)；UV 1800 紫外可見分光光度儀(Shimadzu,日本)；糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株AYCC29212(壇墨質(zhì)檢，中國)。

1.2 方法

1.2.1 直接接觸實(shí)驗(yàn)(direct contact test,DCY)[5]將標(biāo)準(zhǔn)菌糞腸球菌(AYCC29212)制備成濃度為106CFU/ mL 的菌懸液。

取100 個(gè)1.5mL 的經(jīng)無菌處理的離心管，按照選擇的根管封閉劑材料的不同，將其共分為5 組，分別為AH Plus 組、iRoot SP 組、Hi Flow 組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組，各組20 個(gè)樣本。各組封閉劑的使用均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，將各組封閉劑分別注入離心管的底部，高度均約1cm，陽性對(duì)照組則注入同等高度的凡士林，陰性對(duì)照組為無菌空白管。將各組離心管均放置于37℃、相對(duì)濕度＞95%的恒溫箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

分別于根管封閉劑應(yīng)用后的20min、1d、7d、14d，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從各組樣本中取出5 個(gè)離心管樣本，各實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組的離心管內(nèi)均被注入10μL 的糞腸球菌菌液，陰性對(duì)照組內(nèi)加入10μL的無菌去離子水。待各組于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)24h 后，將各組的所得細(xì)菌懸液進(jìn)行濃度稀釋，將各濃度的菌液分別取50μL 接種于RHI 瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧下培養(yǎng)24h 后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，最終結(jié)果合算成每毫升CFU，計(jì)數(shù)結(jié)果取均值。

1.2.2 抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn) 取濃度為3×108CFU/ mL的糞腸球菌懸液50μL，以玻璃棒于培養(yǎng)皿上涂開，于37℃厭氧培養(yǎng)箱中厭氧下培養(yǎng)，觀察細(xì)菌當(dāng)達(dá)到不完全融合生長(zhǎng)時(shí)，取出培養(yǎng)皿，在同一培養(yǎng)皿上放置帶有3 個(gè)圓形鏤空的濾紙，鏤空直徑均為5mm，鏤空之間保持一定間隔。將3 個(gè)鏤空分別標(biāo)記為A、R、C 三組，分別涂布AH Plus 根管封閉劑、iRoot SP 根管封閉劑、Hi Flow 根管封閉劑，另放置一個(gè)直徑5mm 含有蒸餾水的濾紙作為D 組，每組設(shè)置5 個(gè)RHI 培養(yǎng)皿。將各組培養(yǎng)皿置于37℃、100%濕度的厭氧培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，分別于1d、3d、7d 時(shí)取出培養(yǎng)皿，測(cè)量各組的抑菌環(huán)直徑，每組重復(fù)測(cè)量3 次，結(jié)果取均值記錄。

1.2.3 糞腸球菌感染根管模型實(shí)驗(yàn)(infected root canal model，IRCM)

(1)離體牙的采集與處理：收集因牙周炎或正畸治療需要而拔除的單直根管恒牙140 顆，納入標(biāo)準(zhǔn)：①牙齒發(fā)育形態(tài)正常，牙根完好，根尖孔發(fā)育完全，無齲壞，未經(jīng)過牙髓治療，顯微鏡下觀察未見隱裂及外吸收；②X-ray 片顯示根管均為單根管恒牙，不存在根管內(nèi)吸收；③牙根長(zhǎng)度正常，釉牙骨質(zhì)界距離根尖超過11mm；④根管通暢，無鈣化；⑤經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①根尖孔不完整，已有吸收或破壞；②為多根管或根管系統(tǒng)存在解剖變異。將所拔除的牙齒流水沖洗干凈后，以齦下刮治器刮除牙根表面的牙周膜、肉芽及牙石，再以流水沖洗干凈后將離體牙置于0.9%生理鹽水中，4℃冰箱冷藏備用。

(2)根管預(yù)備：以金剛砂車針沿釉牙骨質(zhì)界將離體牙進(jìn)行截冠。冠向下法進(jìn)行根管預(yù)備，將預(yù)備好的離體牙樣本浸泡于去離子水中，進(jìn)行高溫高壓滅菌后備用。

(3)糞腸球菌感染根管模型的建立：向制備好的根管模型內(nèi)注射濃度為108CFU/ mL 的糞腸球菌懸液并置于含有1ml 此懸液的1.5ml 離心管內(nèi)，于厭氧培養(yǎng)箱(37℃、100%濕度)中厭氧培養(yǎng)3w，感染根管模型建立完成，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(4)根管充填及分組：將根管預(yù)備完成的離體牙隨機(jī)分為7 組，每組20 個(gè)樣本。分別為A 組：AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組；R 組：AH Plus根管封閉劑單尖組；C 組：iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組；D 組：iRoot SP 根管封閉劑單尖組；E組：Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組；F 組：Hi Flow 根管封閉劑單尖組；G 組：熱牙膠對(duì)照組，為僅充填熱牙膠，未使用根管封閉劑。根管充填后，以樹脂封閉髓腔，全程均在無菌操作下進(jìn)行。

(5)細(xì)菌計(jì)數(shù)：將根管充填后的樣本均置于無菌RHI 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔2d 更換一次新鮮培養(yǎng)液，分別于根管充填20min、1d、7d、14d 時(shí)，對(duì)各組樣本進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。具體方法如下：將牙根截成根尖3mm、根中1/ 3、根冠1/ 3，應(yīng)用GG 鉆將根管內(nèi)根充材料磨除，將收集到的所有磨除的根充材料及牙本質(zhì)碎屑移入2ml 離心管內(nèi)，其內(nèi)加入2mlPRS 緩沖液，均勻震蕩1min 后，對(duì)細(xì)菌懸液進(jìn)行濃度稀釋，方法同1.2.1 的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，全部取樣工作均在無菌操作下進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件23.0版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，各組間的菌落數(shù)、抑菌環(huán)直徑比較均采用ANOVA 分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊者采用LSD-t 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊者采用塔姆黑尼Y2 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 直接接觸實(shí)驗(yàn)各組根管封閉劑抑菌效果的比較 各組在與細(xì)菌混合培養(yǎng)不同時(shí)間后，除陽性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其余各組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落數(shù)均逐漸增多，各組不同時(shí)間點(diǎn)間菌落數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

各組根管封閉劑在新鮮混合20min、1d 后，AH Plus 組、iRootSP 組、Hi Flow 組三組的菌落數(shù)均低于同時(shí)間點(diǎn)的陽性對(duì)照組(P＜0.05)，且20min、1d 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的三組間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各實(shí)驗(yàn)組根管封閉劑在混合7d 后，抗菌性均有所下降，以AH Plus 組下降最為明顯，但三組菌落數(shù)仍低于陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，iRootSP 組與Hi Flow 組的菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，均低于AH Plus 組(P＜0.05)。各實(shí)驗(yàn)組根管封閉劑在混合14d 后，AH Plus 組的抗菌性進(jìn)一步降低，與陽性對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。iRootSP 組與Hi Flow 組的抗菌性也在降低，但兩者間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而與陽性對(duì)照組及AH Plus 組的菌落數(shù)均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。具體見表1，圖1。

圖1 各組根管封閉劑混合1d 后菌落數(shù)比較

表1 各組根管封閉劑混合不同時(shí)間后菌落計(jì)數(shù)的比較(Log10 CFU/ mL，)

注：相同字母表示在同一時(shí)間點(diǎn)組間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 三組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較 三組根管封閉劑作用于糞腸球菌1d、3d、7d 后，各組的抑菌環(huán)直徑遞減，各組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)間除1d 與3d間的抑菌環(huán)直徑無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P＞0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)間比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。根管封閉劑作用于糞腸球菌1d 時(shí)，三組間的抑菌環(huán)直徑iRootSP 根管封閉劑組最大，AH Plus 根管封閉劑組最小，但三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。3d 時(shí)，各組抑菌環(huán)直徑均略有縮小，抑菌作用在減弱，但三組間仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。7d 時(shí)，各組抑菌環(huán)直徑縮小明顯，iRootSP 根管封閉劑組與Hi Flow 根管封閉劑組抑菌環(huán)直徑無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，且均高于AH Plus 根管封閉劑組(P＜0.05)。對(duì)照組蒸餾水作用于細(xì)菌后，任何時(shí)間均無抑菌環(huán)形成。具體見表2，圖2。

表2 各組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較(mm，)

表2 各組根管封閉劑抑菌環(huán)直徑的比較(mm，)

圖2 不同根管封閉劑不同時(shí)間的抑菌環(huán)效果

2.3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較 各組根管封閉劑作用于感染根管20min后，AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組三組的菌落數(shù)均低于熱牙膠對(duì)照組(P＜0.05)，三組之間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。其余各組菌落數(shù)與熱牙膠對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管1d 后，AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組四組的菌落數(shù)均低于熱牙膠對(duì)照組(P＜0.05)，四組之間菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。其余各組菌落數(shù)與熱牙膠對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管7d 后，各實(shí)驗(yàn)組的抗菌性仍存在，菌落數(shù)均低于熱牙膠對(duì)照組(P＜0.05)。iRoot SP 根管封閉劑單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組，與其1d 時(shí)相比，菌落數(shù)更少，抗菌性更強(qiáng)(P＜0.05)。iRoot SP 根管封閉劑+熱牙膠組與其1d 時(shí)相比，菌落數(shù)增加，抗菌性減弱(P＜0.05)。各組根管封閉劑作用于感染根管14d 后，AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組、iRoot SP 根管封閉劑單尖組、Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組三組的抗菌性仍良好，均優(yōu)于其余各組(P＜0.05)，且iRoot SP 根管封閉劑單尖組與Hi Flow 根管封閉劑+熱牙膠組的菌落數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，均優(yōu)于AH Plus 根管封閉劑+熱牙膠組(P＜0.05)。具體見表3。

表3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較(Log10 CFU/ mL，)

表3 建立感染根管模型各組根管封閉劑抑菌效果的比較(Log10 CFU/ mL，)

3.討論

根管是一個(gè)比較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它存在很多根管預(yù)備器械很難到達(dá)的結(jié)構(gòu)，比如根管的峽部、側(cè)支根管以及根尖分歧、根尖分叉等部位。同樣的，在根管充填時(shí)，單純依靠牙膠尖等核材料也無法實(shí)現(xiàn)對(duì)這些部位的嚴(yán)密充填，對(duì)于根尖部位的充填不嚴(yán)密，往往會(huì)導(dǎo)致根尖微滲漏出現(xiàn)的幾率增加。因此，根管充填若要保持一個(gè)長(zhǎng)期且穩(wěn)定的嚴(yán)密封閉效果，則必須有根管封閉劑的加入，根管封閉劑可進(jìn)入這些復(fù)雜結(jié)構(gòu)內(nèi)，以保證根尖部位的封閉效果，從而能夠更好地降低根管內(nèi)再感染的風(fēng)險(xiǎn)。AH Plus 作為樹脂類根管封閉劑中的代表，它能夠通過固化反應(yīng)時(shí)分解的雙酚a-二縮水甘油醚以及甲醛從而達(dá)到抗菌的目的，其中的甲醛含量揮發(fā)極少，降低了細(xì)胞毒性，同時(shí)又兼具抗菌抑菌性，根尖封閉效果好，但AH Plus 對(duì)于根尖周組織有少量的刺激性作用[6-7]。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，與其它各類的根管封閉劑相比，硅酸鹽生物陶瓷類材料無論在生物活性、理化性能以及提高根尖密合性等方面表現(xiàn)更出色一些[8-9]。iRoot SP 根管封閉劑作為其中的代表，可以促進(jìn)骨組織的再生以及根尖孔的閉合，同時(shí)凝固時(shí)不產(chǎn)生收縮，充填完成后降低了根尖再感染的發(fā)生[10]。HiFlow 根管封閉劑屬于硅酸鈣基類根管封閉劑的一種，與iRoot SP 的化學(xué)成分相似，其預(yù)混合而成，不需要調(diào)拌，直接注入根管內(nèi)即可，表現(xiàn)出較理想的生物相容性，很小的遺傳毒性，致癌性小，術(shù)后疼痛反應(yīng)輕，生物活性亦較好，可促進(jìn)成骨分化及礦化，根尖組織耐受，可與牙本質(zhì)形成良好的化學(xué)粘接力[11-12]，同時(shí)可用于高溫下熱牙膠的根管內(nèi)充填，現(xiàn)已逐漸受到口腔臨床工作者的關(guān)注。

目前公認(rèn)的根管治療理論表明，根管充填不應(yīng)單單只為了達(dá)到密閉根管的效果，更應(yīng)通過根管內(nèi)的充填材料(核材料以及根管封閉劑)對(duì)根管進(jìn)行穩(wěn)定長(zhǎng)久地殺菌抑菌作用，控制甚至完全清除根管內(nèi)的殘余細(xì)菌，促使根尖周組織加速痊愈[13]。HiFlow根管封閉劑屬于新型硅酸鈣基類封閉劑，可耐高溫，與iRoot SP 均屬于預(yù)合成的親水性生物陶瓷類封閉劑。區(qū)別在于，HiFlow 根管封閉劑在150℃～220℃的高溫下，仍能保持高流動(dòng)性及粘接性，高溫下理化性質(zhì)穩(wěn)定，而iRoot SP 根管封閉劑在140℃時(shí)已發(fā)生了變性，因此不適用于熱牙膠的充填[14]。DCY 是檢測(cè)藥物抑菌性能的幾種方法之一。有實(shí)驗(yàn)人員將DCY 改進(jìn)后，證實(shí)i Root SP 根管封閉劑、AH Plus 根管封閉劑及HiFlow 根管封閉劑三種根管封閉劑對(duì)糞腸球菌均有一定地抑菌性，但材料的抑菌性能隨著固化時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸衰弱[15]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，各組根管封閉劑在新鮮混合20min、1d 后，AH Plus 組、iRootSP 組、Hi Flow 組均有抗菌性，菌落數(shù)均低于陽性對(duì)照組，但三組間抗菌性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組根管封閉劑在混合7d 后，各組仍有抗菌性，且iRootSP 組與Hi Flow 組的抗菌性優(yōu)于AH Plus 組。各組根管封閉劑在混合14d 后，AH Plus 組抗菌性極低，而iRootSP 組與Hi Flow 組仍能保持抗菌性。抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，三組根管封閉劑作用于糞腸球菌1d、3d、7d 后，各組的抑菌環(huán)直徑遞減，說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌作用都逐漸在減弱。此外，本實(shí)驗(yàn)還建立了感染根管模型，研究了各組根管封閉劑在常溫下及熱牙膠充填時(shí)的高溫作用后的抗菌性。結(jié)果表明，各組根管封閉劑表現(xiàn)出了良好的抗菌抑菌性，在根管充填14 天后，iRootSP 根管封閉劑+熱牙膠組，因高溫使其理化性質(zhì)有所改變，抗菌性降低，但其單尖充填后的抗菌性與Hi Flow 根管封閉劑的抗菌效果優(yōu)于AH Plus 根管封閉劑，與直接接觸實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以上均說明，三組封閉劑對(duì)糞腸球菌均有抗菌效果，且其抗菌性能與其固化狀態(tài)、時(shí)間有關(guān)，但Hi Flow 根管封閉劑與iRootSP 根管封閉劑的抗菌效果在實(shí)驗(yàn)中未見差異，分析其原因：iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑的主要化學(xué)成分基本相同，均含有硅酸鈣、氧化鋯、磷酸鈣、氫氧化鈣，其中后兩者反應(yīng)產(chǎn)生堿式磷酸鈣(Hydroxyapatite，HAP)及水后，水促進(jìn)硅酸鈣發(fā)生水化，又生成氫氧化鈣及水化硅酸鈣(Hydrate calcium silicate，C-S-H)，從而水化反應(yīng)循環(huán)發(fā)生，使根管內(nèi)呈強(qiáng)堿性環(huán)境[16]，致使細(xì)菌的細(xì)胞膜或DNA 受損，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，因而iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑均能夠發(fā)揮其抑菌抗菌性，細(xì)菌很難生存。此外，iRootSP 根管封閉劑與Hi Flow 根管封閉劑的區(qū)別在于兩者的顆粒分布不同，后者在高熱狀態(tài)下表現(xiàn)出更好的低粘性、高流動(dòng)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明Hi Flow 根管封閉劑在高溫狀態(tài)下，其抗菌效果未發(fā)生改變，而AH Plus 根管封閉劑因其釋出具有抑菌成分的甲醛量較低，因而其抑菌性低于前兩者[17-18]。

綜上所述，Hi Flow 根管封閉劑其抑菌性與iRootSP 根管封閉劑相似，值得臨床推廣。但由于本實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的觀察時(shí)間尚短，而且是體外研究實(shí)驗(yàn)，不能完全模擬出口腔內(nèi)的真實(shí)環(huán)境，因此根管封閉劑的抗菌性仍需長(zhǎng)時(shí)間結(jié)合大量的臨床病例進(jìn)一步的研究。