龍膽苦苷對CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠保護(hù)作用及機(jī)制研究

黃燕，余淑貞，于小華，黎忠良，饒品德，曹娟，湯小林

（江西省兒童醫(yī)院，南昌 330006）

肝纖維化是由慢性非自限性肝損傷產(chǎn)生的一種以細(xì)胞外基質(zhì)過量沉積為特征的損傷修復(fù)反應(yīng)[1]。過度纖維化可導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生，預(yù)防或及時逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)展是保護(hù)肝臟的重要策略[2-3]。中醫(yī)理論認(rèn)為肝臟多“陽常有余陰常不足”，肝病機(jī)理多屬“體陰而陰不足”，治療方面，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抗肝纖維化方面展示了其獨(dú)特優(yōu)勢[4-5]。

龍膽草是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療肝臟疾病的常用藥物，性寒，具瀉肝膽實(shí)火、清熱除燥等功效[4]。其主要活性成分龍膽苦苷是一種活性較強(qiáng)的裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)[5]。據(jù)報(bào)道龍膽苦苷具有逆轉(zhuǎn)肝損傷、治療酒精性肝炎及肝內(nèi)膽汁淤積等藥理活性，但藥理機(jī)制尚未明確，多認(rèn)為與抑制炎癥、抗氧化等有關(guān)[6-8]?；诖耍狙芯繑M構(gòu)建肝纖維化大鼠模型，探討龍膽苦苷對肝功能、肝纖維化的保護(hù)作用及其機(jī)制，為龍膽苦苷的進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 清潔級SD 大鼠，雄性，180 g～220 g，購自南昌大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。龍膽苦苷(含量＞95%) 購自南京道斯夫生物科技公司，批號：181116A。四氯化碳（99%）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）及丙二醛（MDA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、透明質(zhì)酸（HA）及膠原蛋白-III（COL III）檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司；谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、羥脯氨酸（Hyp）、超氧化物歧化酶（SOD）均購自Sigma 公司。

1.2 主要儀器 7020 型全自動生化分析儀（日本日立）、BT125D 電子分析天平（德國賽多利斯）、CX-31 光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS）、UV-2550 紫外分光光度計(jì)（日本島津）、FSH-2A 高速組織勻漿機(jī)（華城潤華）、低溫高速離心機(jī)(美國賽默飛)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 選取60 只SD 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)均分為對照組、模型組、干預(yù)組，各20 只。模型組大鼠每隔一天腹腔注射15% CCL4的油溶液（劑量：0.80 mL/kg），首劑量加倍。干預(yù)組大鼠腹腔注射CCL4的油溶液后，給予灌胃服用60 mg/kg 劑量龍膽苦苷。對照組大鼠給予等劑量PBS腹腔注射。三組大鼠分組處理8 周，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肝組織外觀觀察 實(shí)驗(yàn)大鼠處死后，迅速剖腹，將完整的肝臟取出后仔細(xì)觀察，主要包括肝臟外觀形態(tài)、色澤變化、組織彈性，及是否出現(xiàn)明顯病變等。

1.4.2 血清中AST、ALT、ALB、GGT 含量測定 分組處理后大鼠心臟穿刺取血3 mL，離心后取血清，使用全自動生化分析儀分析血清中ALT、AST、ALB、GGT 含量，具體操作依據(jù)設(shè)備使用說明。

1.4.3 血清中TGF-β1、HA、COL III 含量測定 取大鼠血清，依據(jù)TGF-β1、HA、COL III 檢測試劑盒步驟處理樣本，于450 nm 波長處測定吸光度，換算得到TGF-β1、HA 及COL III 值。

1.4.4 肝組織勻漿MDA、SOD 和Hyp 含量測定大鼠分組處理后取定量肝右葉組織，置生理鹽水中漂洗干凈，精密吸取3 mL 低滲鹽水（濃度：0.86%）加入燒杯，快速將肝右葉組織剪碎，使用高速組織勻漿機(jī)勻漿，用低溫離心機(jī)離心處理分離上清液，按照試劑盒步驟處理樣品，于特定波長處進(jìn)行測定，計(jì)算肝組織勻漿中MDA、SOD 和Hyp含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以()表示，組間比較用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織形態(tài)觀察 觀察各組大鼠肝組織形態(tài)，對照組大鼠肝組織呈均勻暗紅色，表面有光澤，形態(tài)正常，組織富有彈性。模型組大鼠肝組織呈灰黃色，顏色不均勻，欠光滑，且有局部白色斑塊，偏硬。干預(yù)組大鼠肝組織顏色不均，整體呈現(xiàn)紅色，色澤和彈性均好于模型組，但較干預(yù)組仍較差。

2.2 大鼠肝功能指標(biāo)情況 比較各組大鼠分組處理后肝功能指標(biāo)情況，模型組和干預(yù)組大鼠血清AST、ALT、ALP、GGT 均明顯高于對照組（P 均＜0.05）；干預(yù)組大鼠血清AST、ALT、ALP、GGT 均明顯低于模型組（P 均＜0.05），見表1。

表1 大鼠血清肝功能指標(biāo)比較()

表1 大鼠血清肝功能指標(biāo)比較()

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.3 大鼠肝纖維化指標(biāo)情況 比較大鼠分組處理后血清肝纖維化指標(biāo)水平，模型組和干預(yù)組大鼠血清TGF-β1、HA、COL III 均明顯高于對照組（P均＜0.05）；干預(yù)組大鼠血清TGF-β1、HA、COL III均明顯低于模型組（P 均＜0.05），見表2。

表2 大鼠血清肝纖維化指標(biāo)比較()

表2 大鼠血清肝纖維化指標(biāo)比較()

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.4 大鼠肝氧化應(yīng)激指標(biāo)情況 比較大鼠分組處理后肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，模型組和干預(yù)組大鼠MDA 和Hyp 均高于對照組，SOD 低于對照組（P 均＜0.05）。干預(yù)組大鼠MDA 和Hyp 均低于模型組，SOD 高于模型組（P 均＜0.05），見表3。

表3 大鼠肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)比較()

表3 大鼠肝組織勻漿氧化應(yīng)激指標(biāo)比較()

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

3 討論

肝纖維化是組織損傷的自我修復(fù)反應(yīng)，也是多種慢性肝病的重要病理特征和進(jìn)展過程[9]。早期肝纖維化是可逆的，也是預(yù)防慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的關(guān)鍵策略，中醫(yī)則以氣虛和血瘀的證候表現(xiàn)為辨證要點(diǎn)[10]。龍膽草歸肝、膽經(jīng)，具有瀉肝膽火、清熱燥濕作用，也是多種肝膽方劑的主藥。多研究表明其主要成分龍膽苦苷具有逆轉(zhuǎn)肝損傷、治療肝炎作用，但作用機(jī)制有待明確[11]。

本研究經(jīng)CCL4誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，肝組織觀察可見明顯異常，提示已發(fā)生病理病變；血清肝功能指標(biāo)AST、ALT、ALP、GGT均明顯增高，表明CCL4會明顯影響肝功能。AST 多在肝細(xì)胞線粒體內(nèi)分布、ALT 主要存在于肝細(xì)胞漿中，當(dāng)肝細(xì)胞受損或壞死時，AST、ALT、ALP、GGT 的含量可靈敏反映肝細(xì)胞受損情況[12-13]。給予龍膽苦苷則可以明顯緩解CCL4誘導(dǎo)的肝組織病變及血清指標(biāo)變化，提示具有抗肝功能損傷作用。

肝細(xì)胞受損時細(xì)胞外基質(zhì)中膠原代謝異常、纖維結(jié)締組織增生并形成了纖維化[14]。本研究大鼠經(jīng)CCL4誘導(dǎo)血清TGF-β1、HA、COL III 水平均顯著提高，表明發(fā)生肝纖維化病變。TGF-β1 是肝纖維化關(guān)鍵細(xì)胞因子，可經(jīng)多途徑刺激肝星狀細(xì)胞活化促進(jìn)肝纖維化；HA 可反映肝內(nèi)生成纖維量及受損情況；COL III 水則是纖維化重要基質(zhì)[15-16]。因此TGF-β1、HA、COL III 水平可反應(yīng)肝纖維化進(jìn)展情況。研究顯示龍膽苦苷可明顯抑制TGF-β1、HA、COL III 的升高，表明可明顯緩解CCL4誘導(dǎo)引起的肝纖維化水平。

肝纖維化的誘發(fā)及影響因素復(fù)雜，高水平的氧化應(yīng)激在肝纖維化進(jìn)展中有重要作用，可刺激成纖維細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞，促進(jìn)膠原的合成及沉積，加速肝纖維化的進(jìn)程；因此抗氧化損傷是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的一個研究熱點(diǎn)[17]。研究表明，龍膽苦苷具有一定抗氧化應(yīng)激活性，可降低膿毒血癥模型小鼠肝組織一氧化氮水平，并誘導(dǎo)髓過氧化物酶活性發(fā)揮護(hù)肝作用[18]。在爆發(fā)性肝損傷模型小鼠中也可緩解谷胱甘肽含量的降低，并改善過氧化水平[19]。本研究中，龍膽苦苷可明顯緩解CCL4誘導(dǎo)引起的肝組織MDA 和Hyp 水平增高，及SOD 的降低，表明龍膽苦苷具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用。這與已有研究一致，可能是保護(hù)肝功能、抗纖維化活性的一個重要機(jī)理。

綜上，本研究明確龍膽苦苷具有肝保護(hù)作用，能抑制肝纖維化進(jìn)展，可能與抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，明確機(jī)制有待進(jìn)一步研究。