高效廣譜復(fù)合光催化抗菌劑Ag-AgVO3/BiVO4的設(shè)計(jì)合成及抗菌機(jī)制

邵文惠，胡欣，尚靜，林峰，金黎明，權(quán)春善，張艷梅，李軍

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,大連 116600；2.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所催化基礎(chǔ)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,大連 116023；3.大連民族大學(xué)物理與材料學(xué)院,大連 116600）

致病細(xì)菌感染對(duì)公眾健康造成了巨大威脅.雖然抗生素是控制細(xì)菌感染的最有效藥物，但抗生素濫用導(dǎo)致的全球耐藥性問題使細(xì)菌感染的治療更加困難.因此，亟需開發(fā)新型的抗菌劑和抗菌方法對(duì)抗細(xì)菌感染［1～5］.光催化抗菌是利用半導(dǎo)體催化劑在光照下產(chǎn)生高活性的活性氧物種（ROS）破壞并穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞內(nèi)的生物活性分子，如蛋白質(zhì)、DNA等，從而殺死細(xì)菌的技術(shù)，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生.與傳統(tǒng)的化學(xué)法相比，光催化抗菌具有能耗低、效率高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，有望取代傳統(tǒng)的化學(xué)抗菌方法來消除微生物對(duì)環(huán)境的污染［6～13］.

在眾多的半導(dǎo)體材料中，BiVO4是近年來發(fā)展起來的一種鉍基半導(dǎo)體光催化材料，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、可見光活性好、可重復(fù)使用、性價(jià)比高和無毒等特點(diǎn)［14～23］.但是由于載流子傳輸效率低，擴(kuò)散長(zhǎng)度短，光生電子和空穴易復(fù)合，光催化效率低，阻礙了其在光催化和抗菌中的應(yīng)用.將其與其它半導(dǎo)體構(gòu)建異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)光生電荷與空穴的快速分離，是提高其光催化性能的有效途徑［24～29］.在多種異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)中，Z型光催化體系由于能有效地分離光生電子和空穴而具有優(yōu)異的光催化活性和穩(wěn)定性.

在銀基光催化劑中，p型半導(dǎo)體AgVO3以其優(yōu)異的光電性質(zhì)和催化性能引起了人們的廣泛關(guān)注，在抗菌領(lǐng)域也顯示出巨大的潛力［30～34］.然而，由于光生電荷載體的快速復(fù)合和光腐蝕問題，使得單一AgVO3的光催化活性相對(duì)較低，極大地限制了其實(shí)際應(yīng)用.為了提高AgVO3的光催化性能和穩(wěn)定性，目前已開發(fā)了多種基于BiVO4和AgVO3異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料［35～40］.

本文合成了一種具有樹葉狀形貌的Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合光催化劑用于光催化抗菌.研究結(jié)果表明，合成的樹葉狀形貌的Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合光催化抗菌劑不僅表現(xiàn)出優(yōu)異的光響應(yīng)類氧化酶活性，而且能有效殺滅金黃色葡萄球菌和大腸桿菌.抗菌機(jī)制研究結(jié)果表明，在可見光照射下，Ag-AgVO3/BiVO4所產(chǎn)生的光生電子與O2反應(yīng)生成的·O2-可以破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，造成細(xì)胞內(nèi)容物的流出，從而殺滅多種革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌和真菌.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

五水合硝酸鉍（BiNO3·5H2O）和十二水合正釩酸鈉（Na3VO4·12H2O），分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3），分析純，西隴化工股份有限公司；2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙酸鈉、冰乙酸、無水乙醇、25%戊二醛、異丙醇（IPA）和三乙醇胺，分析純，阿拉丁科技（中國(guó)）有限公司；1，4-苯醌，分析純，北京百靈威科技有限公司；重鉻酸鉀（K2Cr2O7），分析純，江蘇聯(lián)科化學(xué)科技有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、碘化丙啶（PI）和BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司.

LabX XRD-6000型X射線衍射儀（XRD），日本島津國(guó)際貿(mào)易公司；S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會(huì)社；Escalab Xi+型X射線光電子能譜儀（XPS），美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；UV-2600型紫外-可見漫反射吸收光譜儀（UV-Vis-DRS），日本島津公司；FS5一體化穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀（PL光譜），英國(guó)愛丁堡公司；H1型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；IX71型倒置熒光顯微鏡，德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)公司；PLS-SEX300D/300DUV型氙燈，北京泊菲萊科技有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 樹葉狀BiVO4的合成 參考文獻(xiàn)［41］的合成方法并進(jìn)行了輕微的修改來合成樹葉狀BiVO4.首先，將60 mg BiNO3·5H2O分散在40 mL去離子水中，超聲5 min至完全溶解，然后在攪拌下加入100 mg Na3VO·412H2O，攪拌30 min后得到均勻的橙黃色溶液.將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL反應(yīng)釜中，于160℃反應(yīng)8 h，待冷卻至室溫后，用去離子水和無水乙醇分別洗滌3次，將固體在60℃的真空干燥箱中干燥12 h，得到黃色粉末，即為樹葉狀BiVO4.

1.2.2 Ag-AgVO3/BiVO4異質(zhì)結(jié)光催化劑的合成 參考文獻(xiàn)［35～41］方法合成Ag-AgVO3/BiVO4異質(zhì)結(jié)光催化劑.首先，在超聲條件下將0.324 g（1 mmol）BiVO4分散于50 mL去離子水中，10 min后在分散液中加入0.17 g（1.2 mmol）AgNO3，在黑暗條件下攪拌30 min，然后將溶解在50 mL去離子水中的0.074 g（0.4 mmol）Na3VO4·12H2O緩慢滴加到上述分散液中，在黑暗條件下繼續(xù)攪拌3 h，反應(yīng)結(jié)束后，將溶液用去離子水和無水乙醇分別洗滌3次，干燥后得到Ag-AgVO3/BiVO4.Ag-AgVO3則是在不添加BiVO4的條件下按照相同流程合成得到.

1.2.3 Ag-AgVO3/BiVO4的光響應(yīng)類氧化酶活性 以TMB為底物，檢測(cè)Ag-AgVO3/BiVO4及相關(guān)材料的類氧化酶活性［42～44］.反應(yīng)在室溫下的24孔板中進(jìn)行，總體積為2 mL.將0.1 mL樣品分散液（2 mg/mL）、0.1 mL TMB溶液（5 mmol/L，DMSO）和1.8 mL乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.0）充分混合，避光/光照5 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定652 nm處的吸光度來測(cè)定其類氧化酶活性.在最佳反應(yīng)條件下，通過改變底物TMB的濃度進(jìn)行了TMB的穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn).Michaelis-Menten參數(shù)利用Lineweaver-Burk方法作圖計(jì)算得出.

式中：V（mol·L-1·s-1）和Vma（xmol·L-1·s-1）分別代表初始速度和最大速度；［S］（mol/L）為TMB的濃度；Km（s-1）為Michaelis常數(shù).

1.2.4 Ag-AgVO3/BiVO4的光催化抗菌活性 選擇最常見的兩種細(xì)菌病原體，金黃色葡萄球菌（S.aureus，ATCC 6538）和大腸桿菌（E.coli，CICC 10003）作為模型菌株，使用梯度稀釋法和平板計(jì)數(shù)法研究了制備的光催化抗菌劑的抗菌活性［45］.實(shí)驗(yàn)中使用的玻璃器皿均經(jīng)過高壓滅菌，所有實(shí)驗(yàn)在無菌條件下進(jìn)行.將凍存的細(xì)菌接種在Luria-Bertani培養(yǎng)基中，于37℃，180 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)10 h，以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期.將細(xì)菌用pH=7的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol/L）梯度稀釋至106CFU/mL備用.在已滅菌的玻璃瓶中，依次加入1.5 mg制備的光催化劑、2.97 mL PBS緩沖液和30 μL已經(jīng)稀釋好的菌懸液.冷卻裝置設(shè)置為23℃以保證實(shí)驗(yàn)在恒溫的條件下進(jìn)行，使用配備紫外線截止濾光片（λ＞420 nm）的300 W氙燈，光源位于反應(yīng)溶液20 cm處.打開光源并開始計(jì)時(shí)，分別在0，2 min時(shí)吸取10 μL菌懸液，用490 μL PBS進(jìn)行稀釋后，取50 μL菌懸液進(jìn)行涂布，于37℃培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)基上的菌落數(shù).作為對(duì)比，在光催化實(shí)驗(yàn)的同時(shí)進(jìn)行暗對(duì)照（無光照）和空白對(duì)照（無光催化劑）實(shí)驗(yàn)，并添加萬古霉素作為陽性對(duì)照，濃度與反應(yīng)時(shí)間均與材料一致（0.5 mg/mL，避光/光照2 min），所有實(shí)驗(yàn)均平行操作3次.利用下式計(jì)算光催化抗菌率（Antibacterial rate，%）.

式中：N0和Nt分別代表未經(jīng)光照和光照一段時(shí)間后的活菌落數(shù).

1.2.5 活性物種的檢測(cè) 為了研究在光催化抗菌過程中起關(guān)鍵作用的活性物種，分別在反應(yīng)體系中添加濃度為1 mmol/L的IPA、0.5 mmol/L的1，4-對(duì)苯醌、1 mmol/L的K2Cr2O7和1 mmol/L的三乙醇胺，分別作為羥基自由基（·OH）、超氧陰離子（·O2-）、電子（e-）和空穴（h+）的捕獲劑［46］，具體操作過程與1.2.4節(jié)一致.同時(shí)，為了消除捕獲劑的毒性作用，進(jìn)行了在光照條件下單獨(dú)捕獲劑與細(xì)菌反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照.

1.2.6用于SEM觀測(cè)的細(xì)菌樣品的制備 反應(yīng)結(jié)束后，離心收集沉淀并用PBS清洗3次.在4℃下，使用2.5%的戊二醛溶液對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行固定.12 h后，離心收集沉淀，通過梯度分級(jí)的乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)25%、50%、75%、100%）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫水.最后，將樣品用100%的乙醇溶液重懸，滴到硅晶片上，自然風(fēng)干后表面噴金，并使用SEM進(jìn)行觀察、拍攝圖像［47］.

1.2.7 Live/Dead熒光染色實(shí)驗(yàn) 使用Live/Dead試劑盒檢測(cè)Ag-AgVO3/BiVO4的抗菌活性［48］.先用Ag-AgVO3/BiVO4處理細(xì)菌后，再將細(xì)菌用DAPI和PI在黑暗中染色30 min.用PBS洗滌細(xì)菌細(xì)胞，并使用倒置熒光顯微鏡觀察樣品.

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定 熒光探針DCFH-DA在ROS存在下可被氧化生成具有綠色熒光的2′，7′-二氯熒光素（DCF），綠色熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比，因此可以通過測(cè)定綠色熒光的強(qiáng)度來測(cè)定細(xì)胞內(nèi)部ROS的水平［49］.反應(yīng)結(jié)束后，取1 mL反應(yīng)液離心，用PBS洗滌沉淀3次，加入終濃度為10 μmol/L的DAFH-DA，于37℃避光孵育30 min，使用倒置熒光顯微鏡拍攝.并用酶標(biāo)儀檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm.

1.2.9 細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物含量的測(cè)定 因細(xì)菌內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)含量較少，且處理時(shí)會(huì)有損失，故加大了材料的濃度、菌濃度與反應(yīng)時(shí)間.具體為：將3 mL細(xì)菌懸液（OD600nm=0.6）離心并用PBS洗滌沉淀3次，使用3 mL催化劑溶液（2 mg/mL）將其重懸.反應(yīng)條件及過程與1.2.4節(jié)一致，光照時(shí)間為2 h.

細(xì)胞外核酸含量的測(cè)定：通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)Ag-AgVO3/BiVO4處理前后細(xì)菌胞內(nèi)核酸含量的變化［50］.反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液離心，取上層清液，使用紫外分光光度計(jì)記錄其在260 nm處的吸光度.

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)：采用BCA法對(duì)Ag-AgVO3/BiVO4處理前后的細(xì)菌胞內(nèi)蛋白含量進(jìn)行研究［51］.反應(yīng)結(jié)束后，離心收集沉淀并用PBS清洗3次.將沉淀用1 mL PBS重懸后，置于冰水浴中，使用超聲破碎儀裂解細(xì)菌.細(xì)胞破碎后，將混合物在4℃下以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上層清液，用蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定上層清液中的蛋白質(zhì)含量.

1.2.10 抑菌譜 為了驗(yàn)證Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合物的廣譜抗菌性能，選取7種常見致病菌，包括5種革蘭氏陰性菌：鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium，CICC 21484）、副溶血性弧菌（V.parahemolyticus，CGMCC 11616）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa，PAO1）、克雷白氏肺炎桿菌（K.pneumoniae，BNCC 186113）和鮑曼不動(dòng)桿菌（A.baumannii，BNCC 194496）；1種革蘭氏陽性菌：屎腸球菌（E.faecium，BNCC 186113）；1種真菌：白色念珠菌（C.albican，CMCC 52201），進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)方法、材料濃度、菌濃度均與1.2.4節(jié)一致.

1.2.11 統(tǒng)計(jì)分析 所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.P值小于0.05的結(jié)果被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*代表P＜0.05，**代表P＜0.01，***代表P＜0.001）.

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料的形貌和晶體結(jié)構(gòu)表征

首先通過XRD分析3種納米材料的晶體結(jié)構(gòu).如圖1所示，在Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料的XRD譜中同時(shí)觀察到BiVO4和AgVO3的特征峰［16，35］，表明BiVO4和Ag-AgVO3成功復(fù)合.圖2是3種納米材料的SEM和TEM照片.可見，單獨(dú)的BiVO4長(zhǎng)約2 μm，具有樹葉狀形貌；而單獨(dú)的Ag-AgVO3是由長(zhǎng)棒、絲狀納米線和納米顆粒組成的復(fù)合結(jié)構(gòu).在Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料中，在樹葉狀BiVO4表面可以觀察到由納米線和納米顆粒組成的Ag-AgVO3復(fù)合材料.

利用XPS進(jìn)一步表征了Ag-AgVO3/BiVO4的元素組成及價(jià)態(tài).圖3（A）是Ag-AgVO3/BiVO4的XPS全掃描譜圖，可以觀察到Ag，V，Bi，O和C 5種元素的信號(hào)，其中，C的信號(hào)來源于儀器中不確定的碳［52］.圖3（B）是Bi4f的高分辨率XPS譜圖，159.2和164.5 eV處的2個(gè)強(qiáng)峰分別對(duì)應(yīng)Bi4f7/2和Bi4f5/2的內(nèi)層電子［53］，證實(shí)了Ag-AgVO3/BiVO4中鉍的價(jià)態(tài)是Bi3+.圖3（C）是O1s的高分辨率XPS譜圖，529.9，530.4和532.2 eV處的峰分別來自Ag-AgVO3和BiVO4中的O元素以及吸附在材料表面的O［54］；V2p能級(jí)的結(jié)合能是隨著V離子的氧化態(tài)增加而增加的，因此XPS可以測(cè)定含V材料的價(jià)態(tài).從V2p的高分辨率XPS光譜［圖3（D）］中可以看出，由于兩種材料中V2p的化學(xué)環(huán)境不同，與V2p相關(guān)的V2p1/2和V2p3/2峰處于不同的位置，對(duì)峰形進(jìn)行擬合后，Ag-AgVO3在517.5和524.3 eV處產(chǎn)生V2p1/2和V2p3/2的峰，516.8和524.1 eV處的峰則歸屬于BiVO4［38］.圖3（E）是Ag3d的高分辨率XPS譜圖，圖中367.8和373.8 eV處的峰分別對(duì)應(yīng)于Ag3d5/2和Ag3d3/2的結(jié)合能，對(duì)2個(gè)峰進(jìn)行分峰擬合，367.6和373.7 eV的峰來自Ag-AgVO3中的Ag+，而368.3和374.3 eV的峰來自于Ag0，說明在復(fù)合物Ag-AgVO3/BiVO4中存在單質(zhì)銀［36］.

Fig.1 XRD patterns of materials

Fig.2 SEM(A—D)and TEM(A′—D′)images of BiVO4(A,A′),Ag-AgVO3(B,B′)and Ag-AgVO3/BiVO4(C,C′,D,D′)

Fig.3 XPS spectra of Ag-AgVO3/BiVO4

2.2 Ag-AgVO3/BiVO4的類氧化酶活性

TMB溶液呈無色透明狀，當(dāng)其被ROS氧化成ox-TMB后，溶液由無色變?yōu)樗{(lán)色，在652 nm處有最大吸收峰［55］，因此，可以通過檢測(cè)OD652nm來測(cè)定Ag-AgVO3/BiVO4的光響應(yīng)類氧化酶活性.通過一系列對(duì)照實(shí)驗(yàn)探索了Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合物的光響應(yīng)類氧化酶活性.如圖4（A）所示，在光照條件下，Ag-AgVO3/BiVO4具有優(yōu)異的類氧化酶活性，且表現(xiàn)出比單一Ag-AgVO3或BiVO4更強(qiáng)的類氧化酶活性.這可能是因?yàn)樾纬蓮?fù)合物后，復(fù)合物中各單組分之間產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng).

為了進(jìn)一步確認(rèn)Ag-AgVO3/BiVO4為具有光響應(yīng)類氧化酶活性的納米材料，進(jìn)行了穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，通過固定Ag-AgVO3/BiVO4的濃度，改變TMB的濃度，得到了典型的Michaelis-Menten曲線［圖4（B）］，將數(shù)據(jù)進(jìn)行Lineweavere-Burk擬合后，發(fā)現(xiàn)其具有較高的吻合度［圖4（C）］.通過計(jì)算可以得出光響應(yīng)類氧化酶Ag-AgVO3/BiVO4對(duì)TMB的米氏常數(shù)Km為0.11 mmol/L，最大反應(yīng)速度vmax為10.62×10-8mol·L-1·s-1.

Fig.4 Oxidase-like activity(A),steady-state kinetic assays of photocatalytic activity for Ag-AgVO3/BiVO4(B)and the corresponding double reciprocal plots of TMB(C)

2.3 光學(xué)特性分析

通過UV-Vis DRS測(cè)定了納米材料的光吸收特性.如圖5（A）所示，Ag-AgVO3與BiVO4復(fù)合后，吸收邊出現(xiàn)明顯紅移，增強(qiáng)了對(duì)可見光的吸收，說明Ag-AgVO3與BiVO4復(fù)合可以提高BiVO4的光吸收性能.對(duì)于晶體半導(dǎo)體來說，半導(dǎo)體的禁帶寬度（Eg）可結(jié)合UV-Vis-DRS的數(shù)據(jù)通過公式ahυ=A（hυ-Eg）n/2得出，其中，a為吸收系數(shù)，h為普朗克常數(shù)，υ為入射光頻率，Eg為禁帶寬度，A為常數(shù)［56］.如圖5（B）所示，由（ahυ）2-hυ曲線可估算出BiVO4和Ag-AgVO3/BiVO4的禁帶寬度分別為2.50和2.42 eV.以上結(jié)果表明，復(fù)合后的Ag-AgVO3/BiVO4禁帶寬度減小，對(duì)光的吸收范圍增大，使其在可見光照射下的光催化中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.圖5（C）顯示了BiVO4、Ag-AgVO3和Ag-AgVO3/BiVO4的PL光譜，Ag-AgVO3/BiVO4的熒光強(qiáng)度明顯低于BiVO4和Ag-AgVO3.結(jié)果表明，Ag-AgVO3和BiVO4復(fù)合后，光生電子和空穴復(fù)合效率顯著降低［41］.

Fig.5 UV-Vis DRS spectra(A),(ahυ)2-hυ plots(B)and PL spectra of the as-prepared photocatalysts(C)

2.4 Ag-AgVO3/BiVO4的抗菌活性

S.aureus和E.coli是革蘭氏陽性菌和陰性菌的典型代表致病菌株.本實(shí)驗(yàn)以這兩種細(xì)菌為研究對(duì)象，探究了Ag-AgVO3/BiVO4納米抗菌劑的光催化抗菌性能.選擇0.5 mg/mL的濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度，通過混合細(xì)菌的懸浮液和光催化劑，在可見光照射下評(píng)估了抗菌效率，結(jié)果如圖6所示.首先，單獨(dú)光照的抗菌效率小于5%.在光照下，Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料的抗菌率高于單獨(dú)的BiVO4和Ag-AgVO3.光照2 min后，Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌率可達(dá)到99%以上，對(duì)大腸桿菌的抗菌率可達(dá)到86%（延長(zhǎng)時(shí)間至4 min時(shí)可達(dá)到99%以上），比單獨(dú)的BiVO4的抗菌效率提高近4倍.由于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有差異，造成了在許多抗菌實(shí)驗(yàn)中對(duì)二者的抗菌效率差異較大.Li等［57］研究發(fā)現(xiàn)，相比于E.coli，光敏劑TCPP對(duì)S.aureus的抗菌效果極佳，這是因?yàn)殛栃跃募?xì)胞壁成分大多為具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的肽聚糖，ROS更易穿透相對(duì)多孔的陽性菌.為了提高對(duì)E.coli的抗菌效果，作者使用三氨基氯胍（TG）對(duì)其進(jìn)行修飾，合成了穩(wěn)定性好的陽離子型TCPP-TG NPs，帶正電的TCPP-TG NPs可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的有效黏附，縮短了ROS作用的距離，從而提高了對(duì)E.coli的抗菌效果.而本實(shí)驗(yàn)制備的Ag-AgVO3/BiVO4對(duì)兩種細(xì)菌均具有較高的抗菌效果，這表明具有異質(zhì)結(jié)結(jié)構(gòu)的Ag-AgVO3/BiVO4可以有效分離空穴和電子，在光照瞬間產(chǎn)生的大量ROS足以殺死兩種細(xì)菌，具有優(yōu)異的光催化抗菌性能.

Fig.6 Photocatalytic antibacterial rate for different photocatalysts in dark and irradiated by visible light for 2 min(A,B)and corresponding spread plate results of S.aureus and E.coli grown on different samples(C,D)

2.5 Ag-AgVO3/BiVO4的光催化抗菌機(jī)理

2.5.1 ROS檢測(cè)ROS是生物體內(nèi)新陳代謝過程中的副產(chǎn)物，參與整個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和凋亡的全過程.DCFH-DA本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光DCFH生成有綠色熒光的DCF.DCF不具有細(xì)胞通透性，會(huì)聚集在細(xì)胞內(nèi)，因此可以通過測(cè)定綠色熒光的強(qiáng)度來判斷細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平.納米材料通過與細(xì)菌的相互作用使細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激是其主要的抗菌機(jī)理之一，光催化劑產(chǎn)生的ROS不僅可以破壞細(xì)胞膜完整性，在進(jìn)入細(xì)胞后還會(huì)破壞線粒體膜通透性和細(xì)胞呼吸鏈，使細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂［58］.從圖7（A）和（B）中可以看出，未經(jīng)處理的細(xì)菌處于正常狀態(tài)，幾乎觀察不到綠色熒光，表明細(xì)菌內(nèi)的ROS水平極低；經(jīng)過BiVO4和AgVO3處理后，熒光強(qiáng)度比空白對(duì)照組略有增加；而經(jīng)Ag-AgVO3/BiVO4光照處理后的細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光最強(qiáng).說明在光照下Ag-AgVO3/BiVO4產(chǎn)生的ROS水平顯著上升，引起細(xì)菌內(nèi)ROS調(diào)節(jié)系統(tǒng)紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)菌的死亡.

Fig.7 Fluorescence images(A1—A4)and ROS intensities(B)of bacterial cells treated with different materials and antibacterial activity of Ag-AgVO3/BiVO4 in the absence(control)or presence of different scavengers against S.aureus(C)

2.5.2 活性物種分析ROS是由光催化劑受到光照時(shí)，與周圍環(huán)境中的H2O和O2發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的，通常被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)菌死亡的主要原因［59］.捕獲劑實(shí)驗(yàn)可以確定在光催化抗菌過程中起到主要作用的活性物種.如圖7（C）所示，當(dāng)反應(yīng)體系中加入異丙醇（捕獲·OH）和三乙醇胺（捕獲h+）時(shí)，抗菌效率略有下降；加入對(duì)苯醌（捕獲·O2-）和重鉻酸鉀（捕獲e-）后，抗菌效率顯著降低，說明在光照下，半導(dǎo)體表面的光生e-可以還原O2形成·O2-，攻擊細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)菌死亡［60］.

2.5.3 細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性 為了進(jìn)一步研究Ag-AgVO3/BiVO4的光催化抗菌機(jī)制，進(jìn)行了Live/Dead實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性.DAPI和PI都是可以對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA/RNA染色的熒光染料，但PI無法通過代謝活躍的健康細(xì)胞膜，因此只可以對(duì)受損細(xì)胞或死亡細(xì)胞的核酸物質(zhì)進(jìn)行染色［48］.如圖8所示，在空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，只有少數(shù)死細(xì)胞，表明細(xì)菌在沒有光催化劑存在的條件下照射仍然可以存活.與此形成鮮明對(duì)比的是，在光照下，經(jīng)Ag-AgVO3/BiVO4處理后，S.aureus和E.coli的細(xì)胞內(nèi)都呈現(xiàn)出比空白對(duì)照組更強(qiáng)的紅色熒光，說明Ag-AgVO3/BiVO4都能通過破壞細(xì)胞膜有效殺死細(xì)菌［61］.

Fig.8 Representative fluorescence images of live(blue)and dead(red)cells after treatment

2.5.4 SEM照片進(jìn)一步采用SEM直觀地分析細(xì)菌的形態(tài)變化.完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)菌細(xì)胞表面光滑平整是細(xì)菌生存的必要條件［62］.如圖9所示，在空白對(duì)照組的細(xì)菌中，E.coli細(xì)胞呈典型的棒狀結(jié)構(gòu)，S.aureus呈圓葡萄狀，兩種細(xì)菌表面光滑，說明此時(shí)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整.經(jīng)Ag-AgVO3/BiVO4處理后，可以觀察到細(xì)菌細(xì)胞表面凹陷和破損，說明具有強(qiáng)氧化性的ROS可以造成細(xì)胞膜的氧化損傷，讓其失去生物學(xué)功能，導(dǎo)致成細(xì)菌死亡［63］.這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了抗菌實(shí)驗(yàn)和ROS熒光檢測(cè)的結(jié)果.

Fig.9 SEM images of bacterial in different pretreated conditions

2.5.5 細(xì)胞外大分子含量的測(cè)定和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量檢測(cè)對(duì)Ag-AgVO3/BiVO4處理前后細(xì)菌胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)含量變化進(jìn)行了測(cè)定.由于核酸中含有嘌呤和嘧啶分子，二者具有共軛雙鍵，在260 nm處有最大吸收峰，因此可以通過檢測(cè)OD260nm來測(cè)定核酸的含量.如圖10（A）所示，處理后的E.coli和S.aureus在260 nm處的吸光度均高于空白組，表明Ag-AgVO3/BiVO4破壞了細(xì)胞膜后，導(dǎo)致核酸流失到細(xì)胞膜外［64］.采用BCA法測(cè)定細(xì)胞破碎后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的變化.在生命體中，蛋白質(zhì)通常參與中樞代謝、基因轉(zhuǎn)錄并存在于周質(zhì)、內(nèi)膜和外膜中，維持著生命體的正常生命活動(dòng).如圖10（B）所示，Ag-AgVO3/BiVO4處理后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量均低于未處理的，表明Ag-AgVO3/BiVO4使細(xì)胞膜破裂后，蛋白質(zhì)流失到細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量降低.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)含量明顯下降時(shí)，細(xì)菌就不能進(jìn)行正常的生命活動(dòng)［65］.

Fig.10 Changes of intracellular contents of bacterial before and after treated with Ag-AgVO3/BiVO4

2.6 廣譜抗菌性

為驗(yàn)證Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料的廣譜抗菌性能，選取7種常見致病菌進(jìn)行了抗菌實(shí)驗(yàn).結(jié)果（圖11）表明，Ag-AgVO3/BiVO4復(fù)合材料對(duì)這7種致病菌均具有良好的抗菌效果，具有廣譜抗菌性［66］.

Fig.11 Antibacterial properties of Ag-AgVO3/BiVO4 against seven common pathogens

3 結(jié) 論

通過水熱法和化學(xué)沉淀法制備了Ag-AgVO3/BiVO4納米抗菌劑.Ag-AgVO3/BiVO4具有優(yōu)異的光響應(yīng)類氧化酶活性.光催化抗菌實(shí)驗(yàn)表明，Ag-AgVO3/BiVO4具有較高的抗菌效率，經(jīng)過2 min的光照，對(duì)S.aureus和E.coli的抗菌率分別可以達(dá)到99%和86%.并且通過延長(zhǎng)光照時(shí)間，可使對(duì)E.coli的抗菌率達(dá)到99%.抗菌機(jī)理研究證明，Ag-AgVO3/BiVO4受到光照所產(chǎn)生的e-可以還原環(huán)境中的O2生成·O2-，從而使細(xì)菌發(fā)生氧化應(yīng)激，細(xì)胞膜破裂后細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)泄露，造成細(xì)菌死亡.此外，Ag-AgVO3/BiVO4對(duì)包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌在內(nèi)的9種微生物具有高效抗菌效果，說明其具有廣譜抗菌性能，有望在污水處理和抗菌涂層中得到應(yīng)用.