免疫調(diào)節(jié)性納米制劑的研究進展

李成龍 ，陳小燕，孫遜*

（1.四川大學華西藥學院 靶向藥物及釋藥系統(tǒng)教育部重點實驗室，四川 成都 610061；2.德陽市人民醫(yī)院藥劑科，四川 德陽 618000）

1 自身免疫性疾病概況

自身免疫性疾?。╝utoimmune diseases，ADs）是一類復雜的具有器官特異性或全身性的炎癥性疾病，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）、1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）等，這類疾病通常是慢性的、難治愈的，并可能危及生命，因此嚴重影響患者生活質(zhì)量[1]。ADs的顯著特征是免疫系統(tǒng)自身耐受紊亂與自我攻擊加強，即機體免疫系統(tǒng)無法正確區(qū)分“自我”與“非我”[2]。流行病學統(tǒng)計顯示，29種ADs的全球總發(fā)病率為7.6% ～ 9.4%[3]。目前，臨床上尚無治愈ADs的方法，藥物治療以降低疾病活動度、改善患者生活質(zhì)量為目標。傳統(tǒng)的廣譜、非疾病特異性的抗炎或免疫抑制類藥物的疾病響應性低、不良反應多，即使是近10年涌現(xiàn)出來的非抗原特異性的、作用于細胞因子或免疫細胞信號通路的生物或小分子靶向分子，其緩解自身免疫反應的機制也是以削弱機體對抗感染和腫瘤的免疫力為代價，通常伴隨危及生命的嚴重并發(fā)癥[4]，并無法真正糾正免疫紊亂。因此，以 ADs的病理機制為著力點，開發(fā)高效低毒的治療新策略已成為迫切需求。

2 誘導免疫耐受新策略

抗原特異性免疫耐受，是指機體免疫系統(tǒng)對具有免疫原性的靶抗原表現(xiàn)出應答缺失或不應答的現(xiàn)象。并且，對特定抗原產(chǎn)生耐受的機體，在中止抗原刺激后，其仍能維持對該抗原的免疫耐受，但免疫系統(tǒng)對其他抗原仍具有正常的免疫應答能力。誘導抗原特異性免疫耐受以阻斷免疫系統(tǒng)對自身或同種抗原的異常免疫響應，同時保持機體免疫系統(tǒng)的完整性，為ADs治療的終極目標。為此，過去數(shù)十年間，研究者一直在探索能特異性抑制組織或器官自身免疫反應的高效低毒策略。盡管進展緩慢，但新思路的出現(xiàn)仍然令人興奮，比如基于納米技術(shù)的免疫調(diào)節(jié)性納米制劑有助于誘導高效的抗原特異性免疫耐受發(fā)生[5-6]，這也為從根本上為治愈ADs帶來了曙光[7]。

適應性免疫應答的核心環(huán)節(jié)是抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC）攝取、加工、處理并將抗原信號提呈給T細胞，而APC具有捕獲病毒樣顆粒（納米級）的固有能力[8]，這些粒子將被過濾并富集于外周免疫器官中，包括淋巴結(jié)、脾以及肝等[9]。研究表明，粒徑在0.05 ～ 1 μm的各種合成粒子很容易被APC吞噬，且體內(nèi)生物分布在很大程度上依賴于粒子尺寸與給藥途徑[10]。比如，經(jīng)皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)和黏膜給藥的納米粒（nanoparticles，NPs）易與淋巴系統(tǒng)發(fā)生相互作用，粒徑較小（10 ～100 nm）的粒子通常經(jīng)毛細淋巴管遷移至淋巴結(jié)[11]；較大的粒子（500 ～ 2000 nm）需借助皮下等部位的APC將其搬運到淋巴結(jié)中[12]；而小于10 nm的粒子則在到達淋巴結(jié)后逃逸，不易蓄積[11]。經(jīng)靜脈注射的NPs則更傾向于聚集在脾、骨髓、肝、肺等器官，小于100 nm的粒子能夠逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reticuloendothelial system，RES）的清除[13]；而粒徑在5.5 nm以下的粒子則被腎臟過濾后經(jīng)尿液排出[14]。此外，粒子尺寸還能影響與其發(fā)生相互作用的APC類型，一般認為DC優(yōu)先攝取粒徑較小的粒子，而巨噬細胞則傾向于吞噬較大的顆粒[13]。另外，與表面帶負電的粒子相比，荷正電的NPs更容易被APC攝取，但可能具有較高的細胞毒性[15]；棒狀的金NPs在細胞中的攝取效率要高于球形與立方形粒子[16]。T細胞接受APC提呈的抗原信號后，其表型則決定了免疫反應的類型——免疫活化或免疫耐受。因此，基于納米技術(shù)的免疫療法旨在通過影響共刺激分子的表達水平以及抗原信號的傳遞方式誘導產(chǎn)生具有免疫調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg），恢復Treg對正向免疫應答的優(yōu)勢，從而重塑免疫穩(wěn)態(tài)并遏制ADs炎癥（見圖1）。

圖1 免疫調(diào)節(jié)性納米制劑的設(shè)計及其誘導免疫耐受的機制Figure 1 Design strategies and tolerogenic mechanisms of immunomodulatory nano-preparation

3 免疫調(diào)節(jié)納米制劑用于誘導免疫耐受

通常，將包載耐受性抗原或共載耐受性抗原與免疫調(diào)節(jié)劑的納米給藥系統(tǒng)稱為免疫調(diào)節(jié)性納米制劑或“致耐受性”納米粒（tolerogenic nanoparticles，tNPs）。用于構(gòu)建載體的材料需同時滿足生物相容性良好、無毒、易于制備等特點，包括用有機材料制備的脂質(zhì)體[17]、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）與聚乳酸等聚合物NPs[18]，以及以金[19]、硅[20]等無機材料所設(shè)計的載體，同時還有基于仿生納米技術(shù)的遞送策略。根據(jù)不同的分類依據(jù)，可將tNPs分為多種類型。依據(jù)免疫耐受發(fā)生的機制可以分為[8]：1）單載自身抗原的tNPs借助于免疫系統(tǒng)的天然響應過程誘導耐受；2）單載自身抗原的tNPs通過作用于APC表面的共抑制信號受體發(fā)揮作用；3）tNPs共載自身抗原與免疫調(diào)節(jié)劑，免疫調(diào)節(jié)劑通過影響特定的信號通路促進免疫系統(tǒng)針對特定抗原產(chǎn)生免疫耐受。按照靶細胞的不同，可以分為：1）靶向并誘導免疫原性的APC轉(zhuǎn)變?yōu)槟褪苄缘腁PC（tolerogenic antigen-presenting cell，tAPC），伴隨Treg細胞增加；2）直接靶向并誘導初始T細胞分化為Treg[21]；3）通過靶向并作用于B細胞而發(fā)揮作用。而根據(jù)不同的給藥途徑，誘導免疫耐受的方式有口服、鼻腔黏膜、皮膚、靜脈、淋巴結(jié)以及肌肉途徑等[1]。本綜述以不同的給藥途徑為依據(jù)，分類介紹各類tNPs的研究現(xiàn)狀。

3.1 口服途徑誘導免疫耐受

口服耐受對于維持機體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，有助于平衡飲食中的外源性抗原、微生物以及自身抗原所引起的免疫反應。報道稱，人類小腸黏膜的面積高達300 m2，每平方米約含1×1012個淋巴細胞[22]。M細胞是黏膜免疫系統(tǒng)中與上皮細胞緊密相間的一種特殊的扁平細胞，專職抗原轉(zhuǎn)運，能夠?qū)⒛c腔中的抗原攝取并運輸至腸系淋巴組織中，交由其他免疫細胞處理[23]?？诜乖?，腸絨毛上皮間的M細胞識別并攝取抗原，然后遷移至腸道相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphoid tissues，GALTs）—— 派爾集合淋巴結(jié)（peyer’s patche，PP）、孤立淋巴濾泡（isolated lymphoid follicle，ILF）以及腸系膜淋巴結(jié)（mesenteric lymph nodes，mLN）等，隨后誘導產(chǎn)生高表達歸巢分子C-C趨化因子受體9（C-C chemokine receptor 9，CCR9）與α4β7整合素 的Treg，并遷移至固有層引起免疫耐受?？诜坞x形式的抗原易被胃腸道的酸堿破壞，且GALTs中的低抗原濃度難以引起有效的免疫應答，耐受效果不佳。采用納米載體對抗原進行包載后遞送，不僅能保護抗原免遭胃腸酸堿環(huán)境降解破壞，還可以提高抗原靶向遞送至GALTs中的效率。天然或合成的高分子聚合物是構(gòu)建這類載體的常用納米料材，包括殼聚糖以及PLGA等。

表達凝血因子8（coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ）的DNA（FⅧ-DNA）是一種帶負電的生物大分子，殼聚糖是陽離子聚合物，二者可以通過靜電相互作用自組裝生成NPs，能有效防止FⅧ-DNA口服后被胃腸液消化。Dharwar等[24]利用該原理經(jīng)簡單的制備過程合成了殼聚糖-FⅧ-DNA NPs，0.02%的殼聚糖可制備成含DNA為300 mg · L-1的NPs溶液。動物實驗顯示，多次經(jīng)口給藥顯著抑制了小鼠體內(nèi)FⅧ特異性抗體的產(chǎn)生，可以在體內(nèi)持續(xù)檢測到有活性的FⅧ蛋白。同樣，Goldmann等[25]將能編碼卵清蛋白的DNA質(zhì)粒（ovalbumin-encoding plasmid-DNA，OVA/pcDNA3）硫酸鈉溶液與殼聚糖醋酸溶液在55 ℃按照1：1的體積比例混合，強力攪拌30 s后，成功制備出了能編碼OVA蛋白的殼聚糖-DNA NPs。多次經(jīng)口給藥后，該策略顯著抑制了BALB/c小鼠體內(nèi)OVA蛋白特異性抗體的產(chǎn)生以及過敏反應的發(fā)生，體外脾細胞增殖率也顯著降低。細胞因子結(jié)果表明，殼聚糖-DNA NPs能有效促使1型輔助T細胞（T-helper 1，Th1）反應向Th2與Th3型轉(zhuǎn)化。

PLGA是經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準使用的一種生物可降解大分子聚合物。以PLGA為材料制備的NPs對疏水小分子、親水多肽與蛋白等大分子均具有較強的包載能力，且具有緩釋作用，被廣泛應用于各類藥物遞送的研究[26]。Kim等[27]采用PLGA NPs包載二型膠原（typeⅡcollagen，CⅡ），1次經(jīng)口給藥，就能顯著降低膠原誘導型關(guān)節(jié)炎（collageninduced arthritis，CIA）小鼠模型的發(fā)病率與嚴重程度。免疫指標顯示，接受治療的小鼠血清中的CII特異性IgG顯著減少，且淋巴結(jié)中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）相 關(guān) 信 使RNA（messenger RNA，mRNA）表達增加，而腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNFα）相關(guān)mRNA則表達減少。Lee等[28]用PLGA NP包載交聯(lián)PEG的CⅡ表位肽CⅡ256-270（NP/PEG-pep），于第0天采用球頭灌胃針胃內(nèi)給予DBA/1小鼠。結(jié)果顯示，與模型組或空白NPs組相比，NP/PEG-pep免疫的小鼠（PP）中，白細胞介素4（interleukin 4，IL-4）陽性CD4+T（IL-4+CD4+T）與IL-10+CD4+T細胞的比例顯著增加，與經(jīng)6次CII全蛋白免疫的小鼠相當，并伴隨產(chǎn)生了對RA的遏制作用。

口服tNPs以誘導免疫耐受的特點是安全、患者順應性好，但目前仍以臨床前研究為主，相關(guān)的臨床試驗很少。

3.2 鼻腔黏膜途徑誘導免疫耐受

鼻咽部淋巴組織是指由扁桃體、淋巴結(jié)和淋巴濾泡互相通連構(gòu)成的淋巴環(huán)，又被稱為瓦爾代爾（Waldeyer）淋巴環(huán)，是鼻咽道黏膜免疫發(fā)生的主要場所。在嚙齒類動物中，鼻咽相關(guān)淋巴組織（nasopharynx-associated lymphoid tissue，NALT）[29]的生理功能與人類Waldeyer環(huán)相似[30]。與胃腸道中的M細胞功能相似，經(jīng)鼻黏膜免疫后，抗原顆?？赡芙?jīng)由M細胞主動轉(zhuǎn)運給樹突狀細胞（dendritic cell，DC）與巨噬細胞以進行處理和呈遞，進而誘導產(chǎn)生正向黏膜免疫應答或免疫耐受[30]。研究人員通常以PLGA、納米乳（nanoemulsions，NEs）等為載體構(gòu)建經(jīng)鼻腔黏膜途徑誘導免疫耐受的tNPs。

Keijzer等[31]發(fā)現(xiàn)PLGA NPs經(jīng)鼻黏膜給藥具有免疫調(diào)節(jié)作用，其NALT和頸部淋巴結(jié)中Foxp3的表達顯著增加。藥效實驗中，包載OVA的PLGA NPs能有效抑制OVA特異性的由Th1介導的免疫反應；載有熱休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）表位肽的PLGA NPs經(jīng)鼻免疫后，關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥得到了有效緩解。

NEs具有粒徑可調(diào)、比表面積大、抗原包封率高等特點，因此，NEs常被用于遞送自身抗原以對抗ADs[32]。Wang等[33]開發(fā)了一種基于大豆油的新型NEs，并探索了其作為遞送載體經(jīng)鼻腔給藥誘導免疫耐受的潛力。在實驗性小鼠自身免疫性甲狀腺炎模型上，與對照組相比，包載小鼠甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，mTg）的NEs（mTg+NEs）能有效富集于鼻腔和胸腺中，且該組的甲狀腺炎癥明顯較輕。機制實驗表明，mTg+NEs顯著降低了mTg抗體與IFN-γ的水平，而顯示免疫耐受程度的IL-10、TGF-β以及Treg水平則明顯升高，表明該策略成功誘導模型小鼠產(chǎn)生了免疫耐受。

經(jīng)鼻腔黏膜途徑免疫，具有抗原用量小，能引起黏膜以及系統(tǒng)性免疫應答等優(yōu)點[34]，且還有利于藥物的腦內(nèi)遞送以對抗MS等疾病。

3.3 皮下給藥誘導免疫耐受

生理學上，皮膚由表皮、真皮以及皮下組織3部分構(gòu)成，其中，表皮中含有專職APC——郞格罕細胞（Langerhans, cell，LC）。一方面，LC能有效防御皮膚接觸的外源病原微生物與危險信號，誘導正向免疫應答；另一方面，LC可誘導免疫耐受，維持免疫穩(wěn)態(tài)。tNPs經(jīng)皮下注射后，一般通過兩種途徑到達淋巴結(jié)并引起免疫耐受：tNPs經(jīng)組織間液進入淋巴管，經(jīng)淋巴回流至淋巴結(jié)；tNPs在注射部位被外周組織中的LC、巨噬細胞等攝取，隨后歸巢返回淋巴結(jié)。用于這一策略的常見納米載體有PLGA、脂質(zhì)體以及基于無機材料（氧化鐵）的表面修飾等。

機體內(nèi)，抑炎細胞因子能夠拮抗由炎性細胞因子產(chǎn)生的促炎反應，二者共同維持著機體的免疫穩(wěn)態(tài)。采用納米技術(shù)共遞送抑炎細胞因子與ADs自身抗原肽，理論上可以加強免疫耐受發(fā)生的速度與程度。Cappellano等[35]將重組IL-10蛋白與髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白表位肽（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG35-55）共同裝載于PLGA NPs中，經(jīng)2次皮下給藥來治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠。結(jié)果顯示，PLGA共載藥治療組小鼠的EAE疾病狀況顯著輕于單載治療組，在預防性與治療性藥效中均顯示出了強效的抑炎能力。說明IL-10的加入增強了MOG35-55誘導免疫耐受的能力，聯(lián)用產(chǎn)生了協(xié)同效應。

Cho等[36]合成了兩種不同尺寸的PLGA粒子，其中800 nm的NPs用于包載MOG35-55，同時制備了包載維生素D3（vitamin D3，VD3）、TGF-β1與GM-CSF的粒徑約55 nm的粒子。研究中，攜帶抗原的NPs被DC攝??；而55 nm的載藥粒子則在細胞外釋放VD3、TGF-β1以及GM-CSF以維持局部的耐受性微環(huán)境，其中VD3與GM-CSF能夠誘導DC分化成未成熟的狀態(tài)，且持續(xù)微量的GM-CSF刺激能維持DC的未成熟狀態(tài)。藥效實驗中，皮下注射后，雙重微粒遞藥系統(tǒng)有效下調(diào)了EAE相關(guān)引流淋巴結(jié)中的CD86+MHCⅡ+DC水平，最終通過誘導抗原特異性的免疫耐受而遏制了EAE模型炎癥的發(fā)展。然而，這類策略所涉及的遞送系統(tǒng)制備過程繁瑣，并且可能存在較強免疫原性。

除了抗原聯(lián)合抑炎性細胞因子外，還可以采用NPs同時包載并遞送抗原與小分子免疫調(diào)節(jié)分子。1α，25-二羥VD3（骨化三醇）是VD3的活性形式，能顯著上調(diào)CD4+T細胞表面抗炎分子CD39、CD73的水平，并能增強TGF-β的活性[37]。昆士蘭大學的Galea等[38]構(gòu)建了共載蛋白聚糖表位肽（Aggrecan89-103）與骨化三醇的脂質(zhì)體，皮下注射用于治療蛋白聚糖誘導的RA小鼠。結(jié)果顯示，該方法通過抑制效應T細胞的增殖與功能、誘導抗原特異性Treg的產(chǎn)生，顯著降低了RA小鼠的發(fā)病率與嚴重程度。

Clemente-Casares等[39]將結(jié)合多肽的主要組織相容性復合物Ⅱ分子共價連接在葡聚糖或聚乙二醇化的氧化鐵NPs表面（peptides bound to major histocompatibility complex classⅡ，pMHCⅡ-NPs），皮下注射給予不同的ADs小鼠模型。結(jié)果顯示，pMHCⅡ-NPs能在不損害免疫系統(tǒng)情況下，有效觸發(fā)具有免疫調(diào)節(jié)功能的抗原特異性調(diào)節(jié)性1型CD4+T細胞（antigen-specific regulatory CD4+T cell type 1，TR1）的生成與增殖，并產(chǎn)生對攜帶相同自身抗原APC的抑制作用，促進B細胞分化為具有疾病抑制能力的調(diào)節(jié)性B細胞?；趐MHCⅡ的納米制劑屬于全新的策略，可能有助于促使以抗原特異性的方式治療各類ADs。

皮下注射是傳統(tǒng)疫苗的常用給藥途徑之一，免疫效果好。tNPs經(jīng)皮下給藥，可實現(xiàn)較好的淋巴結(jié)靶向，但該法時常受限于較小的給藥劑量。

3.4 淋巴結(jié)內(nèi)注射誘導免疫耐受

淋巴結(jié)是最重要的外周免疫器官之一，大量免疫細胞寄居于其中，是適應性免疫反應發(fā)生的主要場所，同時也是T細胞發(fā)生極化的部位。研究發(fā)現(xiàn)小鼠的大腦中存在能與外周淋巴系統(tǒng)相互聯(lián)系的淋巴管網(wǎng)絡[40-41]，意味著中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中的抗原可能通過該通路遷移至外周引流淋巴結(jié)并引起免疫應答，而外周引流淋巴結(jié)也同時決定著遷移致病灶中的T細胞類型——促炎或調(diào)節(jié)表型。因此，淋巴結(jié)內(nèi)注射可能會對CNS類ADs產(chǎn)生更加直接的治療作用，且有助于進一步了解局部信號整合與全身免疫耐受之間的特異性聯(lián)系。

MS在解剖學上與其他ADs的發(fā)病部位不同，該病主要累及腦、脊髓等CNS。馬里蘭大學的Tostanoski等[42]就采用淋巴結(jié)內(nèi)注射的策略成功地在EAE小鼠上誘導出了抗原特異性免疫耐受。其制備了共包載自身抗原MOG35-55與調(diào)節(jié)信號雷帕霉素的PLGA微粒，在疾病高峰期只經(jīng)1次腹股溝淋巴結(jié)內(nèi)注射，就能永久性逆轉(zhuǎn)EAE小鼠的癱瘓癥狀。同時伴隨著Treg增加以及T細胞浸潤減少，最終通過重塑淋巴結(jié)內(nèi)局部免疫微環(huán)境驅(qū)動系統(tǒng)性的抗原特異性免疫耐受發(fā)生。但淋巴結(jié)內(nèi)給藥存在操作復雜、技術(shù)難度大、不確定性多等缺點，限制了這一策略向臨床的轉(zhuǎn)化。

3.5 靜脈給藥誘導免疫耐受

經(jīng)靜脈注射多肽抗原誘導免疫耐受的研究可以追溯到20世紀20年代[43]，在臨床前研究中，能有效誘導外周免疫耐受。以NPs作為載體經(jīng)靜脈途徑遞送自身抗原或抗原與免疫調(diào)節(jié)劑，能增加藥物的靶向能力、延長作用時間并減小毒性[44]。靜脈注射后，NPs經(jīng)血液轉(zhuǎn)運至右心室，并經(jīng)肺毛細血管返回左心室，然后富集于微血管滲透性高的器官與組織中，例如肝、脾、腎、腫瘤以及炎癥病灶等[45]。值得一提的是，在腫瘤或炎癥病灶中，通常會形成由多種免疫細胞聚集而成的淋巴細胞簇，又被稱為異位淋巴結(jié)構(gòu)（ectopic lymphoid structure，ELS），ELS屬于外周免疫組織的一部分，承擔著病灶部位的部分免疫響應[46-47]。因此，tNPs富集于ELS[48]、脾等外周免疫器官，將有助于治療分子與免疫細胞發(fā)生充分作用，誘導免疫耐受發(fā)生。經(jīng)靜脈途徑誘導免疫耐受是近年來的研究熱點，納米載體的構(gòu)建也呈現(xiàn)出多樣性，常用的有PLGA、NEs、脂質(zhì)納米粒（lipid nanoparticles，LNP）、脂質(zhì)體以及外泌體等。

3.5.1 納米類誘導固有免疫耐受磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）是細胞膜磷脂的成分之一，位于細胞膜內(nèi)，當細胞發(fā)生凋亡時，膜內(nèi)的PS翻轉(zhuǎn)至膜外，隨后向體內(nèi)具有吞噬作用的細胞發(fā)送請求被清除的信號，或者通過促進抗炎細胞因子TGF-β1的分泌而激活PS受體與巨噬細胞c-mer酪氨酸激酶（macrophage c-mer tyrosine kinase，MERTK）受體，該系列過程并不會觸發(fā)機體免疫系統(tǒng)的正向應答，而更類似于啟動了免疫耐受程序[49-51]。通過模擬機體自身凋亡細胞喚醒機體固有免疫耐受的程序，Roberts等[52]將PS連 接 在PLGA NPs上 形 成PSPLGA，靜脈注射后，成功誘導EAE模型產(chǎn)生了固有免疫耐受，顯著抑制了中樞炎癥的發(fā)展。

3.5.2 mRNA疫苗誘導免疫耐受 采用LNP遞送mRNA以預防或治療疾病的技術(shù)在近兩年發(fā)展迅猛。該技術(shù)不僅有助于結(jié)束新冠肺炎的大流行，Krienke等[53]的工作顯示，其還可以誘導MS小鼠模型產(chǎn)生抗原特異性免疫耐受。該團隊采用LNP遞送可以編碼EAE模型疾病相關(guān)抗原MOG35-55的mRNA（nanoparticle-formulated 1 methylpseudouridinemodified messenger RNA，m1Ψ mRNA），這是一種無佐劑的mRNA LNP遞送技術(shù)。靜脈注射后，m1Ψ mRNA靶向脾臟中的CD11c+DC，引起效應T細胞減少，而抗原特異性的Treg數(shù)量顯著上升，并對促進疾病發(fā)展的Th1與Th17細胞產(chǎn)生了抑制作用，從而有效遏制了針對MOG35-55的特異性免疫反應。在MS小鼠模型中，該技術(shù)顯著降低了MS的發(fā)病率與嚴重程度，而并沒有產(chǎn)生全身免疫抑制的相關(guān)癥狀。m1ψmRNA技術(shù)具有高度的靈活性，且成本低廉，這將使通過設(shè)計含有不同自身抗原序列的個體化疫苗治療ADs的設(shè)想成為可能。

3.5.3 外泌體誘導免疫耐受髓鞘來源蛋白是MS的主要疾病相關(guān)自身抗原，因此，靜脈注射觸發(fā)EAE的確定髓鞘抗原能誘導免疫耐受，但由于目前尚無法確證MS患者中涉及的具體免疫原，以及可能存在的個體化差異，使得相關(guān)研究成果的轉(zhuǎn)化受阻。

Casella等[54]研究發(fā)現(xiàn)，少突膠質(zhì)細胞衍生的細胞外囊泡（oligodendrocyte-derived extracellular vesicles，Ol-EVs）含有多種髓鞘抗原，這些囊泡的粒徑約為240 nm。接著，他們將Ol-EVs靜脈注射給予由不同髓鞘抗原誘導的EAE模型，通過誘導小鼠體內(nèi)的免疫抑制性單核細胞生成以及自身反應性CD4+T細胞凋亡，成功恢復了模型的免疫耐受狀態(tài)，在預防性和治療性實驗中均顯示出了良好的安全性與治療效果。更重要的是，研究者發(fā)現(xiàn)人源少突膠質(zhì)細胞也能釋放EVs，且亦含有與MS緊密相關(guān)的自身抗原，為該技術(shù)在臨床上的應用奠定了基礎(chǔ)。這一策略的便捷之處在于，它在沒有確定靶抗原的情況下，仍然有機會以抗原特異性的方式治療MS。

3.5.4 單載抗原的“致耐受性”納米粒誘導免疫耐受體內(nèi)凋亡細胞及其碎片易被外周免疫器官中高表達膠原結(jié)構(gòu)樣巨噬細胞受體（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO）的巨噬細胞攝取，并以免疫耐受的方式處理掉。因此，基于自然機制清除凋亡細胞碎片的機制，連接脾白細胞的自身抗原能誘導發(fā)生抗原特異性免疫耐受[55]，而惰性合成粒子則有可能通過模擬凋亡細胞而誘導免疫耐受。Getts等[56]將PLP139-151通過碳二亞胺（ethylene carbodiimide，ECDI）化學反應連接在粒徑約500 nm的聚苯乙烯或PLGA NPs表面，于造模前第7天靜脈給藥1次，就能顯著抑制EAE小鼠的相關(guān)癥狀，且療效優(yōu)于皮下給藥。機制研究表明，這一療效與“清道夫”受體MARCO表達增加、Treg水平升高以及誘導T細胞無能有關(guān)。此外，將供體小鼠脾細胞裂解后的混合蛋白抗原通過ECDI反應連在PLGA NPs表面，經(jīng)靜脈注射，能有效拮抗異體胰島移植引起的受體排異反應[57]。

除了脾，肝也是一個針對大量抗原發(fā)生免疫耐受反應的場所[58]，肝竇內(nèi)皮細胞（sinusoidal endothelial cells，LSEC）是肝APC體系中的重要一員。Liu等[59]在約230 nm的PLGA NPs表面修飾上能靶向LSEC上甘露糖受體或“清道夫”受體的配體，靜脈注射后，能有效抑制OVA特異性IgE反應以及Th2型細胞因子分泌。除了能被用于呼吸系統(tǒng)過敏性疾病的預防外，LSEC靶向PLGA NPs在ADs的治療領(lǐng)域也有廣闊的應用前景。

3.5.5 共載抗原與免疫調(diào)節(jié)劑的“致耐受性”納米粒誘導免疫耐受一些小分子化合物能在體內(nèi)外炎性微環(huán)境中誘導產(chǎn)生耐受性DC（tDC）[60-61]。據(jù)此，將體外誘導生成的自體tDC過繼輸入至患者體內(nèi)能夠產(chǎn)生對某些疾病的治療作用，但高昂的費用以及苛刻的生產(chǎn)條件是這類個體化細胞療法得以推廣的最大障礙。值得一提的是，NPs作為一種理想的藥物遞送載體，可以通過實現(xiàn)靶抗原與免疫調(diào)節(jié)分子在體內(nèi)的共同遞送，以誘導內(nèi)源性tDC的產(chǎn)生。截至目前，研究較多的兩類小分子免疫調(diào)節(jié)劑分別是作用于核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路的化合物，二者常被用于構(gòu)建各類tNPs。

NF-κB是細胞內(nèi)調(diào)控炎癥與細胞存活相關(guān)基因的主要因子。Capini等[62]研究表明，脂質(zhì)體共遞送抗原與不同的NF-κB抑制劑（如姜黃素、槲皮素以及Bay11-7082），可以誘導產(chǎn)生高效的抗原特異性免疫耐受，從而遏制RA模型炎癥發(fā)展。靜脈注射后，載藥脂質(zhì)體被外周免疫器官中的MHCⅡ+APC攝取，通過抑制APC中的NF-κB信號通路，誘導產(chǎn)生含有特定抗原信號的tAPC，伴隨誘導產(chǎn)生抗原特異性的Treg。此外，將這些Treg通過靜脈過繼輸入Naive小鼠，可以對受體小鼠產(chǎn)生保護作用。mTOR是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以通過整合環(huán)境信號來調(diào)節(jié)細胞代謝與分化。雷帕霉素最早從吸水鏈霉菌的分泌產(chǎn)物中分離得到，在體內(nèi)通過與FK506結(jié)合蛋白結(jié)合形成復合物而抑制mTOR信號通路，該藥于1999年被美國FDA批準用于預防腎移植產(chǎn)生的排異反應。雷帕霉素具有強大的抑制T細胞增殖與免疫系統(tǒng)的能力[63]，F(xiàn)ischer等[64]還發(fā)現(xiàn)該藥在體外可以誘導產(chǎn)生tDC。

Selecta Biosciences公司（SELB）的研究人員等通過篩選大量的小分子免疫調(diào)節(jié)劑，最終發(fā)現(xiàn)包載雷帕霉素的生物可降解PLGA NPs在體內(nèi)外具有很強的免疫耐受誘導能力[8,65-66]，且同時包載雷帕霉素與蛋白或多肽抗原的tNPs能誘導機體產(chǎn)生持久的抗原特異性免疫耐受。機制研究表明，皮下、靜脈或淋巴結(jié)內(nèi)注射后，tNPs優(yōu)先被脾、淋巴結(jié)、異位淋巴結(jié)構(gòu)等外周免疫器官中的APC選擇性優(yōu)先攝取[42,48,65]，隨后誘導產(chǎn)生tAPC與Treg，伴隨抑制效應CD4+或CD8+細胞生成[67]。因此，這種包載抗原與雷帕霉素的tNPs能有效糾正由T細胞介導的多類異常免疫應答，尤其在治療EAE的實驗中，tNPs能有效逆轉(zhuǎn)小鼠模型疾病高峰期的癱瘓癥狀[42,65]。并且，取已發(fā)生免疫耐受的供體小鼠體內(nèi)的Treg，過繼輸入受體小鼠體內(nèi)，將有助于受體小鼠建立針對特定抗原的免疫耐受[68]。

近期，筆者所在團隊正在探索這一策略用于治療RA的潛力，并取得了部分進展。以新型NEs作為載體，共遞送雷帕霉素與瓜氨酸化的抗原肽至炎癥關(guān)節(jié)處的異位淋巴結(jié)構(gòu)中，成功在CIA與佐劑誘導型關(guān)節(jié)炎（adjuvant induced arthritis，AIA）小鼠模型上誘導出了免疫耐受，遏制了RA炎癥發(fā)展[48]；并且，還開發(fā)了一種共載雷帕霉素與瓜氨酸化的抗原肽的“致耐受性多肽疫苗”（tolerogenic polypeptide vaccine，TPvax），經(jīng)靜脈注射后，CIA大鼠模型體內(nèi)的Treg、IL-10顯著上調(diào)，而炎性細胞因子與抗體水平則下降明顯，重新在RA模型上建立了免疫平衡[69]。

此外，包載雷帕霉素和抗原的tNPs能抑制B細胞活化、生發(fā)中心形成以及抗體產(chǎn)生。因此，這類tNPs可以有效控制過敏模型中由IgE或IgG介導的過敏反應，并能遏制采用生物制劑治療時藥物特異性抗體的形成。例如，生物藥Advate聯(lián)合包載雷帕霉素的tNPs，能降低血友病A小鼠模型體內(nèi)的FⅧ特異性抗體水平，從而顯著提高Advate的生物利用度[70]；運用該法還能有效下調(diào)RA模型中人源TNF-α抑制劑阿達木單抗的特異性抗體水平[67]，并降低龐貝病模型中酸性α-葡萄糖苷酶的抗體濃度[71]。SELB開發(fā)的用于治療慢性難治性痛風由包載雷帕霉素的tNPs與聚乙二醇化重組尿酸氧化酶組成的聯(lián)合療法SEL-212，已于2020年7月在美國展開了Ⅲ期臨床研究（NCT04513366、NCT04596540）。

4 結(jié)語與展望

與早期采用游離抗原誘導免疫耐受以治療ADs的困境相似，免疫調(diào)節(jié)性納米制劑通常在動物模型上效果顯著，而相關(guān)的臨床試驗往往效果甚微[6]。這種差異是其臨床轉(zhuǎn)化面臨的最大挑戰(zhàn)，而可能的原因有以下幾方面：首先，ADs的動物模型不能完全模擬患者的病理機制。例如，EAE小鼠模型的建立是通過單次注射特定抗原而誘發(fā)的急性病理過程，而人類MS則是一種慢性的多誘因疾病。其次，人類ADs的疾病相關(guān)自身抗原尚未完全明確。例如，RA患者涉及的相關(guān)自身抗原包括二型膠原蛋白、熱休克蛋白、軟骨糖蛋白39、系列瓜氨酸化的蛋白/多肽以及病原微生物抗原等，參與抗原種類復雜。而廣泛用于臨床前研究的RA鼠科模型則采用特定的蛋白抗原與完全弗氏佐劑組成的混合物誘導而成，常用的有異源二型膠原蛋白、蛋白聚糖等[72]，抗原明確且單一。另外，納米藥物在動物與人體內(nèi)的分布差異可能會影響免疫耐受的效果。此外，相比于模型動物，人類MHC等位基因與TCR更具多態(tài)性，不同ADs患者所涉及的優(yōu)勢自身抗原表位可能存在差異，這是基于特定多肽的免疫療法療效有限的又一潛在原因[8]。

然而，挑戰(zhàn)即是機遇。隨著免疫學、藥劑學、材料學等學科的快速發(fā)展，將會有更適用于研究免疫耐受療法的動物模型、新型抗原、遞送載體被開發(fā)出來。目前，已有人源化的RA小鼠模型被用于臨床前研究[73]，這些模型一般通過兩種方式獲得：一種是含有人類RA相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，包括人類MHC分子、TCR以及自身抗原等；另一種是將人類細胞或組織植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，制備成小鼠-人類嵌合體模型。此外，髓鞘全抗原的應用正在突破由MS動物模型向臨床轉(zhuǎn)化的瓶頸[54]，用于預防新冠肺炎的Comirnaty與Spikevax在人群中的大規(guī)模接種進一步驗證了LNP技術(shù)的安全與有效性。這些技術(shù)的進步將促進免疫調(diào)節(jié)納米制劑的發(fā)展。相信在不久的將來，基于tNPs的平臺技術(shù)將會被成功用于治療ADs，與現(xiàn)有的治療策略形成互補，減輕患者痛苦，改善患者生活質(zhì)量。