柑橘皮中低極性PMFs提取工藝的初步探究

趙 莎

（西安培華學院，陜西西安 710065）

柑橘為蕓香科柑橘屬植物，主要含有兩大類黃酮類成分，一類為黃酮苷類，主要為二氫黃酮類成分，如橙皮苷等；另一類是多甲氧基黃酮類，主要有川陳皮素、橘皮素等[1]。多甲氧基黃酮（Polymethoxyflavonoids，PMFs）多存在于柑橘類水果中，因其含有甲氧基數(shù)大于或等于4且極性較低而命名。PMFs因含有多種羥基、多甲氧基和糖苷而具有廣泛的生物活性[2]。目前，離體實驗及活體實驗研究均表明多甲氧基黃酮幾乎無毒性，脂溶性好、機體利用率高，能較好地改善人體健康。其中含量較高的PMFs是橘皮素和川陳皮素，具有降膽固醇、抗炎、抗癌、抗氧化、抗誘變和抗動脈粥樣硬化等 作用[3]。

我國柑橘類水果產(chǎn)量非常豐富，一般以鮮食為主，少部分加工成罐頭等商品。作為柑橘類水果加工的副產(chǎn)物，每年會產(chǎn)生1 600多萬t柑橘類果皮，其中95%被廢棄，從而引起環(huán)境污染和浪費資源等社會問題[4]。PMFs在柑橘類果皮中的含量較高，極具提取和利用價值，因其具有抗腫瘤、抗炎等生物活性而受到重視[5-6]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘鮮果（采購于西安市朱雀批發(fā)市場）取果皮干燥后粉碎。川陳皮素，純度＞98%；桔皮素，純度＞98%；乙醇、吡啶、石油醚、甲醇，分析純；乙腈，色譜純。以上試劑均采購于西安潤德生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Mettler Toleddo AB135-S電子天平（其林貝爾儀器有限公司）、KQ-250B數(shù)控超聲波清洗器（上海森信儀器有限公司）、100 mL離心管（西安潤德生物技術有限公司）、TD25-WS低速離心機（其林貝爾儀器有限公司）、E-201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申安醫(yī)療器械廠）、DZF-6090D 真空干燥箱（上海申安醫(yī)療器械廠）、LC-10AT 型高效液相分析儀（上海同田生物技術股份有限公司）、高速組織搗碎機（上海申安醫(yī)療器械廠）和LM61-350033 型恒溫水浴鍋（國華電器公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取5 g柑橘皮利用真空干燥箱于50 ℃烘干，于電子天平稱重，高速組織搗碎機粉碎后過篩待用。于100 mL離心管中加入稱量好的1 g柑橘皮粉碎物，再加入乙醇-吡啶（90∶30）的混合溶液 30 mL，將制備好的試劑于90 ℃恒溫水浴鍋水浴1 h待用。取出試劑于超聲儀提取30 min冷卻至室溫。將試劑置于低速離心機以4 000 r·min-1離心 3 min，取上清溶液，再使用超純水將上清溶液定容至80 mL，利用微孔濾膜進行過濾處理后，采用高效液相色譜分析。

1.3.2 色譜實驗設計

（1）色譜條件。色譜柱：Diamonsil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；進樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（20∶80）；檢測波長：283 nm；流速：1 mL·min-1。

（2）標準曲線的繪制。使用電子天平分別稱取 5 mg川陳皮素標準品、桔皮素標準品，將標準品分別使用甲醇試劑結(jié)合超聲輔助技術溶解于20 mL容量瓶中，再進行定容后配制成0.5 mg·mL-1標準溶液備用。移取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和 2.5 mL 5個梯度溶液于容量瓶中，利用甲醇定容得到標準溶液（50～250 μg·mL-1）過濾后經(jīng)高效液相色譜分析，再進行柑橘皮PMFs含量的測定。

1.3.3 單因素實驗設計

通過單因素實驗探究在不同的實驗條件下多甲氧基黃酮的提取率，探究PMFs的最佳提取工藝條件。

（1）料液比對提取率的影響。分別稱取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40，吡啶比例20%，溫度65 ℃，超聲波輔助提取20 min，按1.3.1步驟測定PMFs含量，計算提取率。

（2）提取時間對提取率的影響。分別稱取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶30，吡啶比例20%，溫度65 ℃，進行超聲輔助提取5 min、10 min、15 min、20 min和25 min，按1.3.1步驟測定PMFs含量，計算提取率。。

（3）提取溫度對提取率的影響。分別稱取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶30，吡啶比例為20%，分別在溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃的條件下超聲波輔助提取20 min，按1.3.1步驟測定PMFs含量，計算提取率。

（4）吡啶比例對提取率的影響。分別稱取1 g柑橘皮5份，按料液比1∶30，溫度65 ℃，吡啶分別為15%、25%、35%、45%和55%，超聲波輔助提取20 min，按1.3.1步驟測定PMFs含量，計算提取率。。

1.3.4 正交實驗設計

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，設計4因素3水平正交實驗，確定最佳提取工藝條件。正交實驗因素水平如表1所示。

表1 正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對提取效果的影響

如圖1所示，在一定條件下，PMFs提取率隨液料比的增加而不斷增加，但在料液比為1∶35左右達到峰值后提取效果減弱。由此得出，料液比為1∶35時，提取效果最優(yōu)。

圖1 料液比對提取率的影響

2.2 提取時間對提取效果的影響

如圖2所示，在一定條件下，PMFs提取率隨提取時間的增加而不斷增加，當超聲提取時間達到 20 min時，溶劑的穿透力達到較高的水平，因此能夠達到最高提取率。隨著超聲時間的增加，多甲氧基黃酮提取率會逐漸增加，但超過一定的范圍，提取率卻逐漸降低，發(fā)生這種情況的原因可能是黃酮類化合物不穩(wěn)定。

圖2 提取時間對提取率的影響

2.3 吡啶比例對提取效果的影響

如圖3所示，在一定條件下，隨著乙醇和吡啶混合溶劑中吡啶比例的上升，多甲氧基黃酮提取率先增加后減小。實驗結(jié)果顯示，在吡啶比例達到25%時，PMFs提取率最高。

圖3 吡啶比例對提取率的影響

2.4 提取溫度對提取效果的影響

如圖4所示，在一定條件下，隨著溫度的升高，PMFs提取率逐漸增加，但提取溫度超過70℃后提取率會逐漸減小。

圖4 溫度對提取率的影響

2.5 正交實驗結(jié)果

基于單因素實驗結(jié)果，選擇為4個因素的3個水平進行正交實驗設計。由表2可知，乙醇-吡啶溶劑結(jié)合超聲波輔助提取PMFs的最優(yōu)組合為A3B3C2D1，提取率的影響順序為C＞A＞B＞D，即提取溫度＞料液比＞吡啶比例＞提取時間，即料液比例為1∶40，吡啶比例為35%，溫度為70 ℃，時間為15 min，在此條件下PMFs提取效果最好，提取率為2.880%。

表2 正交實驗設計及結(jié)果

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助法提取低極性PMFs，選取乙醇和吡啶混合溶劑為提取溶劑，探究吡啶比例、料液比、提取溫度和提取時間對PMFs提取效果的影響。正交實驗確定了乙醇-吡啶溶劑結(jié)合超聲波輔助提取PMFs的最優(yōu)組合為A3B3C2D1，即料液比例為1∶40，吡啶比例為35%，溫度為70 ℃，時間為 15 min，在此條件下PMFs提取效果最好。相對于索氏提取法的煩瑣工藝，采用乙醇-吡啶溶劑超聲浸提法具有可有效保留活性成分、操作簡便、節(jié)省時間、效率高及重復性好等特點，有益于綜合開發(fā)利用柑橘皮這一可再生資源[7]。本研究為探索簡便、高效、經(jīng)濟的PMFs提取方法提供理論依據(jù)，在醫(yī)藥、食品領域等有重大的經(jīng)濟及社會效益。