酸性乳糖酶活測定及對奶粉中 乳糖水解條件的研究

何愛紅，李雪飛,王義哲，趙喜紅

（1.北京世紀(jì)盛名醫(yī)學(xué)科技有限公司，北京 100000；2.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢 430205）

乳糖在乳糖酶的作用下能被分解為半乳糖和葡萄糖。母乳中的乳糖是嬰幼兒的重要能量來源，其被分解的半乳糖對嬰幼兒智力發(fā)育尤為重要。當(dāng)人體乳糖酶缺乏或乳糖酶活性較低時，乳糖不能被完全消化吸收，會引起腸道氣多、腸鳴、腹脹腹痛或非感染性腹瀉等消化道癥狀，稱之為乳糖不耐受癥，這在很大程度上影響了乳制品營養(yǎng)成分吸收和市場普及。據(jù)相關(guān)研究顯示，中國人的乳糖不耐受癥在全世界范圍內(nèi)處于高位趨勢，乳糖酶缺乏發(fā)生率在80%～95%[1]。由于乳糖不耐癥，有很多人無法充分利用牛乳，這對牛乳的生產(chǎn)及消費的增長具有較大的阻礙作用。

乳糖酶按國際酶學(xué)委員會的命名法，稱為β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，簡稱β-半乳糖苷酶。乳糖酶可以水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖的混合物。乳糖酶廣泛用于食品工業(yè)，特別是乳品工業(yè)，在牛奶中添加乳糖酶可水解乳糖，緩解乳糖不耐受癥，提高乳糖的消化吸收利用率。

惠華英等[2]認(rèn)為檢測乳糖酶活性是臨床診斷乳糖酶缺乏癥的常用手段。乳糖酶活性定量檢方法主要有小腸黏膜活檢法、ONPG試驗法（1950年Seidman和Link制備出了鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷）、穩(wěn)定同位素法、高效液相色譜法及糞便還原糖測定法。不同的酶原，乳糖酶水解特性、緩沖體系以及pH值不同。美國《食品化學(xué)法典》（5版）[3]中,乳糖酶活性的測定方法分為中性乳糖酶活性測定方法和酸性乳糖酶活性測定方法。趙華梅等[4]比較了《食品化學(xué)法典》（5版）和《酶應(yīng)用手冊》中測定乳糖酶活性的方法，參照美國食品藥品法典第五版，對國內(nèi)外測定條件進(jìn)行了逐項實驗的研究，建立了乳糖酶活力測定的方法。

本文參照美國食品藥品法典第五版選用酸性乳糖酶活性測定方法測定了產(chǎn)品中酸性乳糖酶的酶活性，然后分析了市售兩款奶粉中的乳糖在不同溫度、不同水解時間、不同的pH值環(huán)境中的乳糖分解率，探討了該乳糖酶在體外模擬條件下分解乳糖的最優(yōu)條件。期望通過探討最優(yōu)乳糖分解條件，能為通過外加酸性乳糖酶緩解乳糖不耐受的消費者提供更科學(xué)的食用方法指導(dǎo)，提高所攝入的奶液中的乳糖消化吸收利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為兒歌乳糖酶水解蛋白調(diào)制乳粉，由北京世紀(jì)盛名醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

1.2 試劑

2-硝基苯-β-D-半乳糖苷（ONPG）、鄰硝基苯酚（ONP），分析純，上海阿達(dá)瑪斯公司。

1.3 儀器設(shè)備

可見分光光度計v-5100，上海元析儀器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；智能數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；精密pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；高效液相色譜儀，安捷倫科技（中國）有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 酶活力測定試劑配制

①鄰硝基苯酚溶液（2.0 mmol·L-1）：取139.0 mg鄰硝基苯酚，置于500 mL容量瓶中，用10 mL的95%酒精溶解渦旋，再用1%碳酸鈉溶液稀釋至刻度線。②底物溶液：取370.0 mg的2-硝基苯基-β-D-半乳糖苷，置于100 mL容量瓶中，加50 mL醋酸緩沖液渦旋溶解，稀釋至刻度線。

1.4.2 乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

①乳糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液（20 mg·mL-1）：稱取在95 ℃烘箱中干燥2 h的乳糖標(biāo)樣2 g（精確至0.1 mg），溶于水中，用水稀釋至100 mL容量瓶中；②乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取乳糖標(biāo)準(zhǔn)貯備液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和2.5 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。配成乳糖標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，濃 度 分 別 為0 mg·mL-1、1 mg·mL-1、2 mg·mL-1、 3 mg·mL-1、4 mg·mL-1和5 mg·mL-1。

1.4.3 酶活力測定

酶活力測定按照美國食品藥品法典第五版酸性乳糖酶活性測定方法，步驟如下。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。選用合適的分光光度計，將波長調(diào)整至420 nm處，分別測定0.10 mmol·L-1、 0.14 mmol·L-1、0.18 mmol·L-1和0.22 mmol·L-1鄰 硝基苯酚的吸光值。

（2）檢測樣品。吸取2.0 mL的底物液置于 25 mm×150 mm的干凈試管中，在37 ℃水浴平衡 10 min，然后迅速吸取0.5 mL待測樣品和空白水對照組加入平衡好的底物中，快速渦旋1 s，立即將試管放回水浴。反應(yīng)15 min后取出迅速加入10%碳酸鈉2.5 mL，渦旋終止反應(yīng)，加水至25 mL， 混勻。

（3）用水作為空白校準(zhǔn)調(diào)零儀器，將樣品轉(zhuǎn)移至玻璃皿中，在420 nm處測定吸光值和空白樣品的吸光值，并取其平均值，酶活力計算公式為

式中：OD420為樣品反應(yīng)后，在420 nm處的平均吸光度；n為稀釋倍數(shù)；4.6為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率； 15為反應(yīng)時間；0.5為樣液體積；w為樣品質(zhì)量，g。

1.4.4 奶粉中乳糖含量的測定

乳糖含量測定嚴(yán)格按照國標(biāo)GB 5413.5—2010中高效液相色譜法測定食品中乳糖，步驟如下。

（1）試樣處理。稱取固態(tài)試樣1 g或液態(tài)試樣2.5 g（精確到0.1 mg）于50 mL容量瓶中，加15 mL 50～60 ℃水溶解，于超聲波振蕩器中振蕩10 min，用乙腈定容至刻度，靜置數(shù)分鐘，過濾。取5.0 mL過濾液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，通過0.45 μm濾膜過濾，濾液供色譜分析。

（2）色譜柱條件。色譜柱：Shodex NH2P-50-4E， 4.6 mm×250 mm，5 μm；流動相∶乙腈∶水=70∶ 30；流 速：1 mL·min-1；柱 溫：35 ℃；進(jìn) 樣 量： 10 μL；示差折光檢測器條件：溫度：35 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器條件，飄移管溫度：70 ℃；氣流量： 320 KPa；撞擊器：關(guān)。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。將乳糖標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應(yīng)的峰面積或峰高，以峰面積或峰高為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（4）樣品檢測。將試樣溶液注入高效液相色譜儀中，測定峰面積或峰高，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得試樣溶液中的乳糖濃度。

（5）乳糖含量計算。乳糖含量的計算公式為

式中：X為試樣中糖的含量，g/100 g；c為樣液中糖的濃度，mg·mL-1；V為試樣定容體積，mL；n為樣液稀釋倍數(shù)；m為試樣的質(zhì)量，g。

1.4.5 乳糖水解率的測定與酶解條件優(yōu)化

利用高效液相色譜法測定乳糖酶水解反應(yīng)前后奶粉中乳糖的含量變化，計算乳糖分解效率，其高效液相法操作參照1.4.4。①取4平勺奶粉（每平勺奶粉約4.3 g），加入120 mL水沖調(diào)，攪拌均勻。②利用高效液相色譜法測量沖調(diào)后的牛奶中的乳糖含量，并做好記錄。③向牛奶中加入一包兒歌乳糖酶（每包含量1.5 g）并攪拌均勻。④取5支試管分別加入5 mL混合液，分別測定40 ℃、45 ℃、 50 ℃、55 ℃和60 ℃下的乳糖分解效率，設(shè)置pH為7，酶解時間為10 min，確定最優(yōu)酶解溫度。⑤確定最優(yōu)酶解溫度后，另取5支試管分別加入5 mL混合液。在最優(yōu)酶解溫度下，依次酶解10 min、20 min、30 min、60 min、120 min、180 min和240 min測定分解效率，確定最優(yōu)酶解時間。⑥在最優(yōu)酶解溫度和時間條件下，取5支試管，分別設(shè)置pH為4、5、6、7和8，測定乳糖分解效率，確定最優(yōu)pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳糖酶活力測定結(jié)果

由圖1可知，乳糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=4.600 6x，其中R2=0.999 9，斜率為4.600 6。隨機(jī)挑取5個不同批次的商品化乳糖酶產(chǎn)品，測定所含酸性乳糖酶的酶活力。結(jié)果表明，5批次乳糖酶的酶活分別為 6 818 ALU·g-1、7 332 ALU·g-1、7 050 ALU·g-1、 7 441 ALU·g-1和8 050 ALU·g-1。乳糖酶活力穩(wěn)定，且最大酶活力值為8 050 ALU·g-1。

圖1 乳糖酶活力測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 奶粉中乳糖測定結(jié)果

由圖2可知，乳糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.03×106x-1.35×106，R2=0.998 4，具有良好的線性關(guān)系。

圖2 乳糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 乳糖酶水解率單因素優(yōu)化

2.3.1 酶解溫度優(yōu)化

由圖3可知，乳糖酶在40 ℃、45 ℃和50 ℃時，乳糖酶水解效率逐漸增加，由55%提升至60%，酶解效率升高較明顯；乳糖酶在55 ℃時，酶解效率最高，為64%；超過55 ℃后，由于酶受熱超過閾值，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)損壞，使酶解效率大幅降低；當(dāng)酶解溫度升高至60 ℃時，酶解效率降至34%。

圖3 不同酶解溫度下的乳糖酶水解效率

2.3.2 酶解時間優(yōu)化

由圖4可知，當(dāng)酶解時間為10 min時，酶解效率最低為54%，240 min時乳糖酶水解效率最高為88%。總體趨勢表現(xiàn)為隨著酶解時間的增加，酶解效率也在正向增加，酶解時間與酶解效率呈正比關(guān)系。在酶解時間為20～120 min時，酶解效率提升速率最快，超過120 min后，酶解效率提升趨勢逐漸變緩，這可能與酶活衰減有關(guān)，所以最優(yōu)酶解時間為 120 min。

圖4 不同酶解時間下的分解效率

2.3.3 酶解pH值優(yōu)化

在酶解溫度55 ℃，酶解時間120 min的條件下探究最優(yōu)pH值，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在pH值為4時，乳糖酶對奶粉中的乳糖表現(xiàn)出了較好的水解效率，達(dá)91%；當(dāng)pH值升至5時，酶解效率降低為89%，pH為6時，乳糖的水解效率為90%。當(dāng)酶解pH值超過6時，酶解效率出現(xiàn)了顯著性下降，總體趨勢表現(xiàn)為pH與酶解效率呈負(fù)相關(guān)。因此，當(dāng)酶解pH為4時，該乳糖酶分解乳糖的效率最佳。

圖5 不同pH值對酶解效率的影響

3 結(jié)論與討論

（1）乳糖酶的水解效率在55 ℃時迎來拐點，溫度較低和溫度過高時均不利于乳糖酶發(fā)揮作用。溫度偏低，乳糖酶不能發(fā)揮最高效的分解能力，在40～55 ℃時，酶解效率由55%提升到了64%。當(dāng)溫度為55～60 ℃時，乳糖酶的分解效率由64%降低至34%，出現(xiàn)了明顯下降，說明超過55 ℃后不利于乳糖酶的作用發(fā)揮，而本研究這一結(jié)果與黃磊的實驗結(jié)果相似[5]，這可能與溫度過高導(dǎo)致酶出現(xiàn)失活效應(yīng)有關(guān)。

（2）在乳糖酶活力測定的眾多方法中，高效液相色譜法雖然費用高，但精確度最高。此外，乳糖酶的穩(wěn)定性是本實驗3因素優(yōu)化條件探討的前提保障。實驗表明，本文選用的5個不同批次的乳糖酶產(chǎn)品的酶活力具有較好的穩(wěn)定性，且最高酶活力為 8 050.00 ALU·g-1。另外，本次實驗用的奶粉屬市場隨機(jī)購買，雖然市場上奶粉品牌覆蓋率有限，批次也僅僅是一個品牌的一個批次，但通過測試奶粉中所含乳糖的含量得知，所購奶粉中碳水化合物含量在其標(biāo)識范圍內(nèi)，選用的乳糖酶也是市場成熟產(chǎn)品，實驗探討的乳糖酶用量、乳糖酶的水解條件對消費者的理性消費有一定指導(dǎo)意義。指導(dǎo)消費者選用合適的乳糖酶，科學(xué)地使用乳糖酶，進(jìn)而滿足乳糖不耐癥對奶制品的消費需求，持續(xù)增強(qiáng)消費者對含乳糖的奶制品的消費舒適度，有助于多方位滿足社會公眾對優(yōu)質(zhì)蛋白的攝入需求。β-半乳糖苷酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用，在乳糖分子的半乳糖一側(cè)連接1～4個半乳糖，生成低聚半乳糖（Galactooligosaccharide，GOS）[6]。因受限于GOS的測試條件，本實驗沒有測定酶解反應(yīng)后體系中是否有GOS生成。此外，乳糖的水解率較低的原因以及乳糖酶是否發(fā)揮了半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用，需要進(jìn)一步探討。