混合磷酸鹽法制備螺旋藻磷酸酯多糖的研究※

●李淑玲 崔 晶 雷 婕 鄧猛猛 張喜峰，2※※

（1.河西學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅 張掖 734000；2.甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室 甘肅 張掖 734000）

多糖廣泛分布于動物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁，是構(gòu)成生命的四種基本物質(zhì)之一。多糖具有抗氧化、抗癌和抗病毒等多種生物活性[1-3]，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[4-5]。多糖的開發(fā)利用是目前生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。

大量研究表明，多糖的生物活性與聚合物的分子特性密切相關(guān)，如單糖組成、分子量、溶液構(gòu)象等[6]。此外，多糖通過化學(xué)修飾改變了多糖分子性質(zhì)和生物活性，修飾后多糖的分子量和鏈構(gòu)象將受到帶電基團(tuán)的影響[7]。磷酸化是多糖支鏈中的羥基被游離磷酸基取代的過程。磷酸化多糖具有顯著的抗氧化、抗腫瘤和抗凝活性[8]，證明磷酸化方法無毒、無害[9]，并能提高生物活性。螺旋藻多糖是螺旋藻中的重要活性成分之一，然而有關(guān)其改性修飾的研究相對較少。因此，本研究以螺旋藻多糖為材料，采用混合磷酸鹽法制備磷酸酯多糖，旨在為螺旋藻多糖及其衍生物的深度開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻多糖（分子量為3.597×104），純度為86.17%，由本實驗室自制。KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、尿素、鉬酸銨、抗壞血酸、濃硫酸、濃鹽酸、硝酸等試劑為分析純，購自煙臺市雙雙化工有限公司。

1.2 主要儀器

722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DKB-501型數(shù)顯超級恒溫水浴鍋，揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司；JA2003型萬分之一精密電子天平，上海研豐電子科技有限公司；FTIR-650S型傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 螺旋藻多糖磷酸酯制備方法取一定量螺旋藻多糖，按照1∶50質(zhì)量比加入蒸餾水，制備多糖溶液，加入一定量質(zhì)量比為3∶1的NaH2PO4與Na2HPO4，加入相應(yīng)量的尿素，混合均勻，在一定溫度下反應(yīng)一段時間后，透析48 h，冷凍干燥后獲得粉末狀螺旋藻磷酸酯多糖。

1.3.1.1 反應(yīng)時間對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響設(shè)置混合磷酸鹽用量為螺旋藻多糖用量的30%，尿素用量為螺旋藻多糖用量的5%，反應(yīng)溫度為60℃，考察不同反應(yīng)時間（3，4，5，6，7 min）對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響。

1.3.1.2 反應(yīng)溫度對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響設(shè)置混合磷酸鹽用量為螺旋藻多糖用量的30%，尿素用量為螺旋藻多糖用量的5%，反應(yīng)時間為5 min，考察不同反應(yīng)溫度（40，50，60，70，80℃）對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響。

1.3.1.3 尿素用量對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響設(shè)置混合磷酸鹽用量為螺旋藻多糖用量的30%，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時間為4 min?？疾觳煌蛩赜昧浚?%，10%，15%，20%，25%）對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響。

1.3.1.4 磷酸鹽用量對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響設(shè)置反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時間為4 min，尿素用量為螺旋藻多糖用量的15%。考察不同混合磷酸鹽用量（30%，40%，50%，60%，70%）對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響。

1.3.2 螺旋藻磷酸酯多糖取代度的測定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取磷酸二氫鉀0.5 g，用蒸餾水溶解后稀釋，充分振蕩混勻，并定容于100 mL的容量瓶中，為5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液。精密吸取配制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備液0，1，2，3，4，5，6，7，8 mL，分別移入9個50 mL容量瓶中，依次分別加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%的硫酸溶液、5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的鉬酸銨溶液、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的抗壞血酸溶液， 振蕩使其混合均勻，沸水浴加熱 10 min，立即用冷水迅速冷卻，并定容至50 mL，得到濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 的工作液。將磷酸二氫鉀溶液在820 nm波長處測定吸光度值，并根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此得到回歸方程：

其中，y是吸光度值，x是所對應(yīng)的磷酸二氫鉀的質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3.2.2 總磷的測定取0.1 g螺旋藻磷酸酯多糖樣品，加入H2SO4-HNO3混合液（硝酸∶硫酸=5∶2）進(jìn)行消化，直至液體清亮后冷卻定容。吸取上述液體1 mL加入容量瓶中，并依次加入10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26%的H2SO4溶液、5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的鉬酸銨溶液、2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的抗壞血酸溶液，充分振蕩混勻，加熱后顯色，立即用冷水冷卻至室溫，最后定容至50 mL，在820 nm處測定吸光值。

1.3.2.3 游離磷的測定取0.1 g制得的多糖磷酸酯樣品，加入10 mL濃度為2 mol/L HCl溶解后定容至50 mL。吸取上述溶液1 mL加到50 mL容量瓶中，依次加入26%的H2SO4溶液10 mL、2%的鉬酸銨溶液5 mL、5%的抗壞血酸溶液2 mL，震蕩混勻，加熱后顯色，之后迅速冷卻至室溫，最后定容至50 mL，在820 nm處測定吸光值。

1.3.2.4 取代度的計算根據(jù)所得到的磷的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程即式（1）算出樣品當(dāng)中所含總磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及游離磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。而結(jié)合磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按照式（2）計算：

取代度DS按式（3）去計算：

式中：162是單糖的摩爾質(zhì)量（g/mol）；31是磷的摩爾質(zhì)量（g/mol）；3.32是游離磷能夠換算成結(jié)合磷酸酯基團(tuán)的系數(shù)；P是所算出的結(jié)合磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析研缽中加入比例為1∶100的尿素和KBr，將其研磨，成粉末狀后，取一定量將其放在專用模具上，制樣；將樣品在波長 4 000~400 cm-1 范圍進(jìn)行光譜掃描（1 min掃描，KBr分束器，DTGS檢測器，4 cm-1光譜分辨率），重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時間對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響

不同反應(yīng)時間下螺旋藻磷酸酯多糖取代度，見圖1。

圖1 不同反應(yīng)時間下螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由圖1中可得，隨著反應(yīng)時間增加，螺旋藻多糖磷酸酯取代度（DS）就增加，反應(yīng)時間越長，磷酸化反應(yīng)越充分，在反應(yīng)時間達(dá)到 4 min時，取代度達(dá)到最大值，隨后取代度有所下降，分析原因可能是因為反應(yīng)時間過長，引起螺旋藻磷酸酯多糖的降解。因此，確定最佳反應(yīng)時間為4 min。

2.2 反應(yīng)溫度對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響

不同反應(yīng)溫度下螺旋藻磷酸酯多糖取代度，見圖2。

圖2 不同反應(yīng)溫度下螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由圖 2可知，隨著溫度的升高螺旋藻磷酸酯多糖的取代度快速增加，而對于酯化反應(yīng)，溫度的升高有利于反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時，螺旋藻磷酸酯多糖的取代度最高，在此基礎(chǔ)之上繼續(xù)提高反應(yīng)溫度，取代度會降低，說明較高的反應(yīng)溫度可能會造成原來多糖的結(jié)構(gòu)破壞，從而影響多糖的取代度，因此，確定最佳反應(yīng)溫度為 60 ℃。

2.3 尿毒用量對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響

不同尿毒用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度，見圖3。

圖3 不同尿素用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由圖3可知，隨著尿素用量增加，取代度（DS）增加，當(dāng)尿素用量為螺旋藻多糖用量的15%時，取代度最高，之后取代度下降，原因可能是因為尿素用量的增多使得反應(yīng)體系的堿性增強(qiáng)，從而造成了螺旋藻磷酸酯多糖的水解，確定最合適的尿素用量為螺旋藻多糖用量的15%。

2.4 磷酸鹽用量對螺旋藻磷酸酯多糖取代度的影響

不同磷酸鹽用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度，見圖4。

圖4 不同磷酸鹽用量螺旋藻磷酸酯多糖取代度

由圖4可知，隨著混合磷酸鹽用量的增加，螺旋藻多糖磷酸酯化的取代度快速增加，這說明較大的質(zhì)量比有利于多糖接觸到更多的混合磷酸鹽，有利于反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)混合磷酸鹽用量達(dá)到螺旋藻多糖用量的50%時，螺旋藻磷酸酯多糖的取代度最高，隨后取代度逐漸下降。在以上最優(yōu)條件下，平均取代度為0.728，以螺旋藻多糖計，螺旋藻磷酸酯多糖得率為26.84%。

2.5 紅外光譜

經(jīng)檢測得到螺旋藻多糖和螺旋藻磷酸酯多糖的紅外光譜（圖5）。

圖5 樣品的紅外光譜圖

螺旋藻磷酸酯多糖典型的吸收峰存在于4000～1000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，然而，在3300 cm-1附近處有一個強(qiáng)吸收峰，查閱資料可以得出這是螺旋藻多糖分子中O-H的伸縮振動峰，而在2929 cm-1處所出現(xiàn)的峰則屬于CH2和CH3的C-H拉伸所導(dǎo)致[10]。螺旋藻磷酸酯多糖在1337～1246 cm-1出現(xiàn)了新的弱峰，這是P-O的伸縮振動引起的，而在936 cm-1處的一個弱峰是由P-O-C的伸縮振動引起的，此結(jié)果與趙鵬等[8]制備磷酸酯多糖結(jié)果基本相符，說明得到的產(chǎn)品確定為螺旋藻磷酸酯多糖。

3 結(jié)論與討論

采用混合磷酸鹽法制備螺旋藻磷酸酯多糖最佳工藝參數(shù)為反應(yīng)時間4 min，反應(yīng)溫度60℃，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，混合磷酸鹽用量為螺旋藻多糖總量的50%，在此條件下平均取代度為0.728，以螺旋藻多糖計，螺旋藻磷酸酯多糖得率為26.84%。紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，螺旋藻磷酸酯多糖1337~1246 cm-1出現(xiàn)了新的弱峰，這是P-O的伸縮振動引起的，而在936 cm-1處的一個弱峰是由P-O-C的伸縮振動引起的。

在今后研究中，將進(jìn)一步探討通過其他合成方式來提高反應(yīng)效率，并對其生物學(xué)活性進(jìn)行修飾前后的比較研究，為螺旋藻多糖的進(jìn)一步利用和其他多糖的磷酸化深入研究提供思路。