基于網(wǎng)絡藥理學探究筋痛靈膏外用治療肩關節(jié)周圍炎的作用機制

任濤 張開偉

1貴州中醫(yī)藥大學，貴陽 550025；2貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科，貴陽 550001

肩關節(jié)周圍炎是一種以肩部疼痛、關節(jié)僵硬和運動功能障礙為主要特征的肩部周圍軟組織疾病，患者肩部疼痛，夜間疼痛為甚，嚴重影響患者的生活質量［1-2］。肩關節(jié)周圍炎的發(fā)病率為2%～5%，約占肩部疾病的42%［3-5］。因此，迫切需要找到治療該病的方法。目前，西醫(yī)治療肩關節(jié)周圍炎的主要方法有口服藥物、局部麻醉、局部阻斷治療、物理治療和手術治療等［4］。手術治療適應證有限，費用高，風險大［6］。雖然還有很多其他的治療方法，但只能暫時緩解癥狀，遠期效果不佳，且西藥口服有一定的不良反應［7］。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，其在治療肩關節(jié)周圍炎中具有顯著優(yōu)勢，膏藥不良反應小、使用簡便［8］，對治療肩關節(jié)周圍炎具有重要的臨床意義。

既往研究表明，膏藥具有溫陽活血的作用，對于寒凝血瘀型肩周炎的止痛效果好［9］。筋痛靈膏是張開偉教授根據(jù)貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院沈馮君名老中醫(yī)“以筋為先，筋骨并重，筋病及骨”的學術思想整理而得，其是張開偉教授在臨床上長期外用治療肩關節(jié)周圍炎、肌筋膜炎的經(jīng)驗用方，由川烏、半夏、天南星、乳香、沒藥5種藥物組成，對肩關節(jié)周圍炎，肌筋膜炎的臨床療效顯著，方中君藥為川烏，臣藥為天南星，佐藥為半夏，使藥為乳香、沒藥，全方具有散寒除濕、舒筋活血、通絡止痛的作用。

網(wǎng)絡藥理學是一門基于疾病基因藥物靶標網(wǎng)絡的新興學科，通過網(wǎng)絡相互作用研究中醫(yī)藥的基礎生物學知識，幫助我們闡明生物分子水平中藥有效成分的藥理作用機制。本研究基于網(wǎng)絡藥理學，預測筋痛靈膏治療肩關節(jié)周圍炎的藥理作用機制，為后期實驗研究提供理論依據(jù)。

資料與方法

1、數(shù)據(jù)處理軟件與數(shù)據(jù)庫

所用數(shù)據(jù)庫及軟件包括：中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）（https：∕∕old.tcmsp-e.com∕tcmsp.php）、Uniprot（http：∕∕www.uniprot.org∕）、GeneCards（https：∕∕www.genecards.org∕）、PharmGkb（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）、TTD（http：∕∕db.idrblab.net∕ttd∕）、DrugBank（https：∕∕www.drugbank.ca∕）、OMM（https：∕∕omim.org∕）、Cytoscape（http：∕∕cytoscape.org∕）、STRING（https：∕∕string-db.org∕）、PubChem（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）、RCSB PDB（https：∕∕www.rcsb.org）、OpenBabel軟件、R軟件、PyMOL、Autodock vina。

2、筋痛靈膏活性成分及其靶點的篩選

筋痛靈膏藥物的主要成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫來檢索，選擇口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為篩選指標。篩選后獲取篩選藥物有效成分和靶點，去除重復靶點，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫查找對應靶點和靶基因名稱。

3、肩關節(jié)周圍炎靶點獲取

通過數(shù)據(jù)庫（GeneCard、OMIM、pharmGkb、TTD、DrugBank）檢索關鍵詞“periarthritis of shoulder”，獲取疾病靶點。然后，整理并刪除重復項，運用Venny2.1.0平臺得出藥物和疾病靶點的交集，從而獲得筋痛靈膏治療肩關節(jié)周圍炎的作用基因靶點并繪制韋恩圖。

4、網(wǎng)絡的構建與分析

將藥物活性成分和疾病靶點輸入到Cytoscape3.7.2軟件中來構建復合靶點網(wǎng)絡。使用節(jié)點和節(jié)點之間的連接來分別表示網(wǎng)絡中的藥物活性成分∕靶標和相互作用。

5、蛋白質相互網(wǎng)絡（PPI）的構建

在STRING數(shù)據(jù)庫中輸入交集靶標進行PPI數(shù)據(jù)分析，將物種設置為“人類”，高置信水平設置為0.400。在Cytoscape3.7.2軟件中導入tsv格式，然后利用disgenet和CytoNCA插件來鑒定核心基因從而篩選出核心靶標。

6、基因本體論（GO）和京都基因與基因組大百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析

將交集基因導入metascape，并利用R軟件中的Bioconductor包進行GO和KEGG富集分析。

7、分子對接

在PubChem數(shù)據(jù)庫和PDB數(shù)據(jù)庫中分別下載小分子受體2D結構和蛋白受體，通過SailVina平臺進行Autodock vina分子對接，并利用Pymol2.3.4可視化處理。

結 果

1、筋痛靈膏活性成分及靶基因

通過檢索得到76個筋痛靈膏的活性成分，包括川烏3個，半夏13個，天南星7個，乳香8個，沒藥45個（表1）。

表1 筋痛靈膏的部分有效成分

2、靶點結果

通過在GeneCard、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank數(shù)據(jù)庫中得到肩周炎相關靶點3 411個，然后，將筋痛靈膏與肩關節(jié)周圍炎相關靶點通過Venny平臺進行交集，得到共有基因121個（圖1）。

圖1 筋痛靈膏藥物和疾病靶點交集基因韋恩圖

3、目標網(wǎng)絡及分析

活性成分分-靶標相互作用網(wǎng)絡由Cytoscape3.7.2軟件構建（圖2）。圓形節(jié)點代表了筋痛靈膏的活性成分，每條邊描述了功能成分與靶基因之間的關系。綠色表示沒藥的活性成分，紫色表示半夏的活性成分，粉紅色表示川烏的活性成分。由圖2中可以看出，連接到較多的靶標分別是槲皮素（MOL000098）、豆 甾 醇（MOL000449）、β-谷 甾 醇（MOL000358）和黃芩素（MOL002714）。

圖2 筋痛靈膏的活性成分-關鍵靶點網(wǎng)絡圖

4、PPI網(wǎng)絡分析

網(wǎng)絡構建和網(wǎng)絡拓撲分析，將筋痛靈膏的作用靶點導入Bisogenet中，限定研究物種為“Homo Sapiens”得到蛋白互相關系，并運用Cytoscape軟件中的插件CytoNCA，設置DC＞61和BC＞200。并 對degree取2倍 中 位 數(shù) 和 其 中Betweenness、Closeness、BC、LAC、CC、NC中位值打分獲得核心靶點：JUN（度值52）、ESR1（度值42）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）14（度值24）、MAPK1（度值18）、TP53（度值20）。篩選得到富集程度高的蛋白互作關系，構建PPI核心網(wǎng)絡圖。見圖3。

圖3 筋痛靈膏治療肩關節(jié)周圍炎蛋白質相互網(wǎng)絡圖

5、GO和KEGG分析

藥物和疾病基因通過R3.7.2軟件來進行GO和KEGG功能富集分析。共得到2 272個GO富集結果，包括2 029個生物過程（BP）、60個細胞組分（CC）以及183個分子功能（MF）。BP、CC和MF的前10項分別如圖4所示。BP主要富集在異生素刺激的反應、傷口愈合、細菌來源分子的反應和氧氣水平的反應等方面。CC主要涉及到膜微區(qū)和膜筏。MF主要體現(xiàn)在DNA結合轉錄因子結合和泛素樣蛋白連接酶結合等方面。采用KEGG信號通路分析方法來確定與筋痛靈膏治療肩關節(jié)周圍炎相關的信號通路，共篩選出171個KEGG富集通路。根據(jù)P＜0.05，繪制了前30條KEGG通路結果的柱狀圖（圖5）。在KEGG通路中，筋痛靈膏治療肩關節(jié)周圍炎主要富集在白細胞介素（IL）17信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等（圖6）。

圖5 基因本體論（GO）功能富集分析結果

圖6 京都基因與基因組大百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）通路富集分析結果

6、分子對接結果

通過篩選出來的核心靶點蛋白（JUN、TP53、RELA、MAPK14、MAPK1）和對應的活性成分進行分子對接，以結合能≤-5.0 kJ∕mol作為標準。分子對接結果發(fā)現(xiàn)核心靶點蛋白與活性成分對接后結合能均小于-5.0 kJ∕mol（圖7），表明關鍵活性成分與核心靶點蛋白之間具有強烈的結合活性。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素（MOL000098）與JUN結合能力最好，為-9.2 kJ∕mol。

圖7 分子對接圖（A為JUN—槲皮素，B為TP53—黃芩素，C為TP53—槲皮素，D為MAPK14—牽?；ㄉ?，E為MAPK1—槲皮素，F(xiàn)為RELA—槲皮素）

討 論

肩關節(jié)周圍炎是一種發(fā)病率高且疼痛大的疾病。目前，肩關節(jié)周圍炎防治方法多種多樣，非甾體類抗炎藥物、關節(jié)鏡松解、推拿療法、中藥內(nèi)服等，其中膏藥外敷也是治療肩關節(jié)周圍炎的重要手段［10-12］。然而，膏藥治療肩關節(jié)周圍炎的作用機制尚不清楚。網(wǎng)絡藥理學為研究中草藥的復雜藥理機制提供了新的方法。本研究通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術來探索筋通靈膏治療肩關節(jié)周圍炎的作用機理。筋痛靈膏的有效成分和作用靶點通過TCMSP獲得，其中潛在有效成分53個，作用靶標24個。根據(jù)degree值得到槲皮素、谷甾醇、β-谷甾醇、黃芩素連接比較多的靶點。

槲皮素能抑制IL-17和TNF-α，提高免疫功能，達到消炎和鎮(zhèn)痛的作用［13］。據(jù)報道，槲皮素能清除缺氧，提高p-MAPK蛋白表達水平，減少缺氧對細胞的損傷［14］。β-谷甾醇具有抗炎作用［15］。有科學研究證實β-谷甾醇有抑制破骨細胞，保護成骨細胞，保護關節(jié)軟骨的功能［16］，而豆甾醇則有消炎、鎮(zhèn)痛的功效［17］。據(jù)報道豆甾醇能夠對小鼠疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛的效果［18］。Ahmad Khan等［19］研究表明豆甾醇通過抑制p38MAPK和NFkBp6通路，防治關節(jié)炎的主要藥物。黃芩素具有顯著抗炎效果，可以減少IL-1β、IL-6、TNF-ɑ，抑制細胞凋亡，改善關節(jié)軟骨的作用［20］。這些結果表明核心成分在治療肩關節(jié)周圍炎中起重要作用。

通過PPI篩選得到的核心靶點（TP53、ESR1、JUN、MAPK1）是治療肩關節(jié)周圍炎的關鍵靶點。TP53與細胞免疫相關，對人體免疫應答能力有重要的影響［21］。TP53可以通過調節(jié)細胞分裂和增殖來影響細胞衰老和凋亡［22-23］。MAPK參加了細胞因子與受體結合后調控轉錄的進程，對生物細胞的繁殖、分化、應激適應和炎性反應具有重要的調控作用［24］。JUN作為一種原癌基因，它編碼的c-JUN蛋白是轉錄因子AP-1家族的重要一員，在控制細菌的增殖、分化、侵染和凋亡方面起著關鍵作用［25-26］。

KEGG分析結果顯示，IL-17信號通路、TNF信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路等與肩關節(jié)周圍炎的防治效果有關。而AGE-RAGE通路也與炎癥的產(chǎn)生相關，它能夠升高MAPK磷酸化作用水平，從而提高了TNF-α、IL-1和IL-6等炎癥因子的表達［27］。IL-17為IL的一種，參與炎性反應。有研究表明，IL-17是關節(jié)炎發(fā)生的重要因素，IL-17的減少可緩解人體軟骨破壞抑制炎性因子的表現(xiàn)［28］。TNF信號通路既有抗腫瘤作用，又有炎癥介質功能。TNF-α是肩袖損傷患者的磨損肌腱組織和肩峰下滑囊組織中常見的炎癥細胞因子［29］。這些通路與人體免疫相關，可能是筋痛靈膏通過這些通路調節(jié)炎性反應，從而達到治療肩關節(jié)周圍炎的作用。

本研究對筋痛靈膏的核心靶點蛋白（JUN、TP53、RELA、MAPK14、MAPK1）與對應的活性成分（槲皮素、β-谷甾醇、谷甾醇和黃芩素）進行分子對接，結果顯示，核心靶點蛋白與活性成分對接的親和力小于-5.0 kJ∕mol，表明關鍵活性成分與核心靶點蛋白之間具有較好結合活性。此外，本研究還發(fā)槲皮素與JUN結合能力最好，為-9.2 kJ∕mol。分子對接表明筋痛靈膏可能通過靶向這些核心靶點蛋白在肩關節(jié)周圍炎中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)筋痛靈膏通過槲皮素、谷甾醇等化學成分作用于JUN、TP53、RELA等關鍵靶點，在IL-17、TNF等信號通路下調節(jié)免疫力，減低炎性反應，從而達到防治肩關節(jié)周圍炎的效果，為進一步實驗研究奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突