基于UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜和分子對(duì)接技術(shù)篩選藿香正氣水抗新冠病毒潛在質(zhì)量標(biāo)志物

張雅莉，韓建勛, 2*，圖爾蓀托合提·托合提薩伊普，孫兆增，宋 薇，張玉松，魏海燕，肖進(jìn)進(jìn)

基于UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜和分子對(duì)接技術(shù)篩選藿香正氣水抗新冠病毒潛在質(zhì)量標(biāo)志物

張雅莉1，韓建勛1, 2*，圖爾蓀托合提·托合提薩伊普1，孫兆增1，宋 薇1，張玉松3，魏海燕1，肖進(jìn)進(jìn)1

1. 譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，北京 100095 2. 譜尼測(cè)試集團(tuán)北京檢驗(yàn)認(rèn)證科學(xué)研究院有限公司，北京 100095 3. 北京譜尼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，北京 100095

基于超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）指紋圖譜和分子對(duì)接技術(shù)，確定藿香正氣水（Huoxiang Zhengqi Shui，HZS）抗新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的潛在質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）。對(duì)27批HZS樣品建立UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，篩選出HZS的差異性成分；以瑞德西韋為陽(yáng)性對(duì)照，將HZS的差異性成分與SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease，Mpro）進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)一步確定HZS的潛在Q-Marker。通過(guò)建立27批HZS樣品的UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，標(biāo)定了27種共有化合物；結(jié)合層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA），確定了其中14種共有化合物在27批HZS樣品中具有較大的差異性，并鑒定出了橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甜橙素、甘草酸、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素9種差異性化合物；9種差異性化合物的分子對(duì)接結(jié)果顯示，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素6種化合物能與SARS-CoV-2 Mpro的活性氨基酸結(jié)合，具有抑制SARS-CoV-2 Mpro的潛能，可作為HZS的潛在Q-Marker。將UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜、化學(xué)計(jì)量學(xué)分析和分子對(duì)接技術(shù)交叉使用，確定了HZS的潛在Q-Marker，該方法為藥物成分鑒定、同一類藥物成分差異性分析，及其功效研究方面提供一定參考。

藿香正氣水；質(zhì)量標(biāo)志物；UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜；分子對(duì)接；SARS-CoV-2 Mpro潛在抑制劑預(yù)測(cè)；橙皮苷；氧化前胡素；新比克白芷內(nèi)脂；甘草酸；歐前胡素；珊瑚菜素

藿香正氣水（Huoxiang Zhengqi Shui，HZS）是由蒼術(shù)、陳皮、厚樸（姜制）、白芷、茯苓、大腹皮、生半夏、甘草浸膏、廣藿香油、紫蘇葉油等提取配制而成，具有解表化濕、理氣和中的作用，用于外感風(fēng)寒、內(nèi)傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒、胃腸型感冒等癥[1]。自新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）爆發(fā)以來(lái)，中藥治療發(fā)揮了不可或缺的作用，其中藿香正氣系列中成藥是《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》中醫(yī)學(xué)觀察期表現(xiàn)為乏力伴胃腸不適者的推薦用藥，現(xiàn)已在抗疫一線初顯成效[2-3]。經(jīng)查證，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局備案的HZS產(chǎn)品共有162條記錄，且不同HZS產(chǎn)品價(jià)格也有很大差異，同規(guī)格的產(chǎn)品價(jià)格差異可達(dá)20倍之多。有文獻(xiàn)[4-6]表明，不同廠家的HZS產(chǎn)品質(zhì)量差異較大。經(jīng)查詢國(guó)家藥品監(jiān)督管理局官網(wǎng)，近5年，就有87條HZS違規(guī)查處記錄，是中成藥中的常見(jiàn)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控項(xiàng)目。目前，有些廠家為了降低生產(chǎn)成本，采用質(zhì)量較差的原材料，或以設(shè)備簡(jiǎn)陋、索價(jià)低廉的小廠代為提取濃縮[7]，這導(dǎo)致了不同廠家HZS的質(zhì)量差異，從而直接影響了其臨床使用中的藥物有效性。因此，對(duì)HZS進(jìn)行成分鑒別和成分功效評(píng)價(jià)，在提高其藥物有效性方面具有重大意義。

中藥指紋圖譜是我國(guó)廣為接受的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，可以直觀地揭示中藥化學(xué)特征，從化學(xué)信息的角度評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，用于篩選能夠真實(shí)反映產(chǎn)品內(nèi)在品質(zhì)的標(biāo)志物[8-11]。目前對(duì)于HZS指紋圖譜的建立和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，主要集中在氣相和液相色譜指紋圖譜，通過(guò)標(biāo)示HZS特征的共有峰圖譜，以評(píng)價(jià)其均一性和穩(wěn)定性。例如聶黎行等[12]建立了13個(gè)廠家的28批HZS的UPLC指紋圖譜，確定了18個(gè)共有峰，并采用層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）方法，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了模式識(shí)別；李紅梅等[13]建立了10批HZS氣相色譜指紋圖譜，確定了16個(gè)共有峰。然而液相色譜和氣相色譜指紋圖譜存在一定的片面性，尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)更為完整全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)及鑒別目的，且對(duì)共有峰的指認(rèn)較困難。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）將具有高分離度、高靈敏度的液相色譜系統(tǒng)，與能同時(shí)提供母離子和碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)以及元素組成的高分辨質(zhì)譜有機(jī)結(jié)合，通過(guò)建立指紋圖譜，可快速分析和表征中藥材復(fù)雜成分[14-15]。分子對(duì)接技術(shù)以結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)相結(jié)合的方式，通過(guò)將配體與受體進(jìn)行對(duì)接，評(píng)價(jià)其對(duì)接體系的穩(wěn)定性，篩選與受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物，具有周期短、操作性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)逐漸成為中藥活性成分篩選的重要手段，廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）的篩選過(guò)程中[16-19]。有研究表明，藿香正氣水中的主要成分包括橙皮苷、甘草酸、歐前胡素、厚樸酚等[5]。其中橙皮苷[20]和甘草酸[21]與新型冠狀病毒SARS-CoV-2主蛋白酶（main protease，Mpro）具有較好的結(jié)合親和力，從而對(duì)SARS-CoV-2產(chǎn)生一定的抑制作用。因此，為進(jìn)一步對(duì)HZS進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，明確不同生產(chǎn)廠家HZS的共有物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在Q-Marker，提高其質(zhì)量控制水平，本研究以25個(gè)廠家共計(jì)27批HZS作為研究對(duì)象，建立了HZS的UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，標(biāo)定了其共有峰并進(jìn)行化合物表征，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)結(jié)合HCA和PCA等模式識(shí)別方法評(píng)價(jià)不同廠家的HZS差異性；并選用SARS-CoV-2 Mpro為篩選靶標(biāo)，與HZS的差異性成分進(jìn)行分子對(duì)接獲得抗SARS-CoV-2的潛在活性成分，進(jìn)一步確定HZS的潛在Q-Marker，為HZS質(zhì)量評(píng)價(jià)和有效控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Xevo G2-XS型超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜，美國(guó)Waters公司，MassLynx 4.1軟件；AB135-S型分析天平（感量0.01 mg）、AB204-S型分析天平（感量0.1 mg），瑞士Mettler Toledo公司；Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；有機(jī)相濾膜（尼龍），0.22 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 材料與試劑

HZS產(chǎn)品在網(wǎng)上藥店進(jìn)行采購(gòu)，共收集25個(gè)廠家的27個(gè)品牌共計(jì)27批產(chǎn)品，詳見(jiàn)表1。對(duì)照品甘草苷（批號(hào)111610-201908）、橙皮苷（批號(hào)110721-202019）、厚樸酚（批號(hào)110729-202015）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；對(duì)照品甘草酸（批號(hào)C0008456）、歐前胡素（批號(hào)B0002871）均購(gòu)自曼哈格檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。乙醇、乙腈，色譜級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司；甲酸，美國(guó)Acros公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%；水為自制超純水。

表1 27批HZS樣品信息

Table 1 Information of 27 batches of HZS samples

樣品編號(hào)廠家品牌生產(chǎn)批號(hào) S1云南白藥集團(tuán)股份有限公司云南白藥WTEB2102 S2云南萬(wàn)裕藥業(yè)有限公司葵花210004B S3云南裕豐藥業(yè)有限公司萬(wàn)通200001A S4云南楚雄天利藥業(yè)有限公司健之佳20200876 S5云南裕豐藥業(yè)有限公司東盛友邦200002D S6云南騰藥制藥股份有限公司騰藥20201221 S7廣東一力羅定制藥有限公司好立康210705 S8廣西靈峰藥業(yè)有限公司金雞20042902 S9漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司片仔癀2006038 S10四川彩虹制藥有限公司康森210504 S11四川天府康達(dá)藥業(yè)集團(tuán)有限公司府慶210704 S12四川泰華堂制藥有限公司泰華堂210516 S13四川依科制藥有限公司蜀中210612 S14四川省通園制藥集團(tuán)有限公司育林200510 S15四川泰華堂制藥有限公司正遠(yuǎn)210607 S16四川德元藥業(yè)集團(tuán)有限公司德輝210415 S17四川禾邦旭東制藥有限公司禾邦200502 S18太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司太極2021022 S19湖南時(shí)代陽(yáng)光藥業(yè)股份有限公司永州20210302 S20湖南漢森制藥股份有限公司漢森2004101 S21湖北東信藥業(yè)有限公司東信210201 S22武漢太福制藥有限公司太福210506 S23天津和治藥業(yè)集團(tuán)有限公司美舒通210201 S24天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司隆順榕060084 S25北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司同仁堂20140162 S26吉林省撫松制藥股份有限公司林海191004 S27吉林隆泰制藥股份有限公司明復(fù)20200614

2 方法

2.1 供試品溶液制備

取HZS樣品1.0 mL于10 mL量瓶中，加入50%乙醇溶液定容至刻度，渦旋混勻，取適量過(guò)0.22 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC?HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫45 ℃；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；平衡時(shí)間15 min；梯度洗脫：0～7 min，10%～20%乙腈；7～30 min，20%～50%乙腈；30～35 min，50%～90%乙腈；35～37 min，90%乙腈；37～37.1 min，90%～10%乙腈；37.1～40 min，10%乙腈；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度550 ℃；脫溶劑氣體積流量600 L/h；錐孔氣體積流量50 L/h；毛細(xì)管電壓2 kV；錐孔電壓40 eV；離子源：ESI+；工作模式：MSE模式；掃描模式：靈敏度模式；掃描范圍50～1000；掃描時(shí)間1.0 s；碰撞能量：低碰撞能量為off，高碰撞能量為20～40 eV。

2.3 指紋圖譜建立

將27批HZS樣品按“2.1”項(xiàng)方法處理后按照“2.2”項(xiàng)方法進(jìn)行UPLC-Q-TOF-MS分析，生成基峰離子流（base peak chromatogram，BPI）譜圖，導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，建立指紋圖譜，并進(jìn)行相似度分析。

2.4 共有峰鑒定

將UPLC-Q-TOF-MS采集的HZS樣品數(shù)據(jù)，導(dǎo)入到UNIFI 1.9.4軟件中完成質(zhì)量校正、加和離子設(shè)定等處理，進(jìn)行化合物峰提取，并結(jié)合UNIFI 1.9.4軟件自帶的中藥數(shù)據(jù)庫(kù)以及Chemical Book等線上數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行化合物匹配鑒定。UNIFI 1.9.4軟件參數(shù)設(shè)置：高能量下響應(yīng)閾值為20，低能量下響應(yīng)閾值為200；精確質(zhì)量偏差閾值為0.005；可識(shí)別的化合物加和峰形式包括＋H、＋H2O＋H、?e峰。

2.5 數(shù)據(jù)分析

將UPLC-Q-TOF-MS采集的HZS樣品相關(guān)數(shù)據(jù)，分別導(dǎo)入到IBM SPSS Statistics 21.0軟件以及EZInfo 3.0軟件進(jìn)行HCA和差異顯著性檢驗(yàn)以及PCA，分析不同HZS樣品的差異性。

2.6 分子對(duì)接

將“3.4”項(xiàng)中得到的差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro進(jìn)行分子對(duì)接篩選出抗SARS-CoV-2的潛在活性成分，進(jìn)一步確定HZS的潛在Q-Marker。SARS-CoV-2 Mpro蛋白（PDB ID：7AF0）的晶體結(jié)構(gòu)從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/）中獲取。運(yùn)用PyMOL（version 2.3.1）（https://pymol. org/）可視化軟件移除配體和水分子，用AutoDock（ADT，version 1.5.6）軟件加氫、加電荷（compute gastieger），建立剛性盒子，盒子的三維坐標(biāo)參數(shù)如表2所示。篩選出的HZS差異性成分3D結(jié)構(gòu)的SDF格式文件從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取，用PyMOL可視化軟件獲得pdb格式文件，用AutoDock激活其可旋轉(zhuǎn)的氫原子，并且以pdbqt文件的形式保存。前期工作準(zhǔn)備好之后，打開(kāi)Command Prompt命令提示符窗口進(jìn)行Vina對(duì)接。得到的對(duì)接結(jié)構(gòu)通過(guò)PyMOL軟件可視化，通過(guò)Ligplot軟件（https://www.ebi.ac.uk/ thornton-srv/software/LigPlus/）和蛋白質(zhì)-配體相互作用分析工具（https://plip.biotec.tu-dresden.de/plip- web/plip/index）分析HZS差異性成分與SARS-CoV- 2 Mpro之間形成的氫鍵、疏水鍵等作用力。

表2 剛性盒子的三維坐標(biāo)參數(shù)

Table 2 3D coordinate parameters of rigid box

設(shè)置參數(shù)數(shù)值/nm 盒子的中心坐標(biāo)值x1.224 0 y?1.325 1 z0.514 5 盒子三維坐標(biāo)值x4.0 y6.8 z6.8

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜建立

將27批HZS樣品的BPI譜圖以cdf格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”進(jìn)行分析，以S1樣品譜圖為參照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正后自動(dòng)峰匹配，其指紋圖譜疊加見(jiàn)圖1，共確定27個(gè)共有峰，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（圖R）。將各樣品與R進(jìn)行比較，得到S1～S27的相似度分別為0.910、0.922、0.972、0.819、0.984、0.982、0.975、0.909、0.927、0.976、0.937、0.790、0.914、0.935、0.837、0.816、0.950、0.973、0.947、0.941、0.900、0.963、0.947、0.966、0.931、0.899、0.855，各樣品的相似度分布在0.790～0.984，表明27批HZS樣品質(zhì)量存在一定的差異性。

圖1 27批HZS指紋圖譜疊加

3.2 主要共有峰鑒定

使用UNIFI軟件對(duì)27批HZS樣品的MSE原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。進(jìn)行峰識(shí)別和對(duì)齊后，得到包含母離子質(zhì)荷比、保留時(shí)間RT和離子響應(yīng)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)合UNIFI軟件自帶的中藥數(shù)據(jù)庫(kù)及Chemical Book等線上數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“3.1”項(xiàng)中確定的27個(gè)共有峰進(jìn)行鑒定，推斷出14種化合物（表3），其中5種化合物經(jīng)過(guò)對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，1（檳榔次堿）號(hào)峰來(lái)源于大腹皮，6（甘草苷）、8（新甘草苷）、18（甘草酸）號(hào)峰來(lái)源于甘草，9（橙皮苷）、15（甜橙素）、19（川陳皮素）、20（3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮，3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone，HMOF）、21（桔皮素）號(hào)峰來(lái)源于陳皮，13（氧化前胡素）、14（新比克白芷內(nèi)脂）、22（歐前胡素）、23（珊瑚菜素）號(hào)峰來(lái)源于白芷，24（厚樸酚）號(hào)峰來(lái)源于厚樸。

表3 27批HZS主要共有峰的鑒定

Table 3 Identification of mainly common peaks of 27 batches of HZS samples

峰號(hào)tR/min化合物分子式準(zhǔn)分子離子(m/z)δ/(×10?6)加和離子來(lái)源藥材 10.85檳榔次堿C7H11NO2160.096 1?5.0＋H2O＋H，＋H大腹皮[22-23] 66.35甘草苷*C21H22O9419.133 4?0.7＋H甘草[24] 87.76新甘草苷C21H22O9419.133 2?1.2＋H甘草[25-26] 98.94橙皮苷*C28H34O15611.197 71.0＋H陳皮[27-29] 1312.50氧化前胡素C16H14O5305.101 8?0.6＋H2O＋H白芷[30-31] 1413.30新比克白芷內(nèi)脂C17H16O6317.102 00.0＋H，＋H2O＋H白芷[31] 1518.40甜橙素C20H20O7373.127 8?1.1＋H陳皮[29,32] 1821.64甘草酸*C42H62O16823.411 30.4＋H甘草[33-34] 1922.94川陳皮素C21H22O8403.138 5?0.5＋H陳皮[28-29] 2024.60HMOFC22H24O9433.149 2?0.2＋H，?e陳皮[29] 2125.32桔皮素C20H20O7373.128 30.3＋H陳皮[28] 2227.10歐前胡素*C16H14O4271.096 50.0＋H白芷[31] 2328.88珊瑚菜素C17H16O5301.107 00.0＋H白芷[35] 2431.69厚樸酚*C18H18O2267.137 5?1.5＋H厚樸[36]

*為經(jīng)對(duì)照品驗(yàn)證

*compound comfirmed by reference substance

3.3 HCA

將“3.1”項(xiàng)中得到的27個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 21.0軟件中，運(yùn)用ward法，以平方歐氏（Euclidean）距離為測(cè)度，進(jìn)行HCA，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)平方Euclidean距離為5時(shí)，各樣品聚類效果最好，27批HZS樣品可分為3類，S7、S11～S13、S15～S17、S21～S23、S25、S27聚為一類，S3、S5、S6、S8～S10、S14、S18～S20、S24、S26聚為一類，S1、S2和S4聚為一類。

3.4 PCA

應(yīng)用EZInfo 3.0軟件對(duì)正離子模式下各HZS樣品的UPLC-Q-TOF-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，圖3為其PCA得分圖。結(jié)果顯示，各HZS樣品分為3類，S7、S10～S13、S15～S17、S21、S22、S27為一類，S6、S8、S9、S14、S18～S20、S23～S26為一類，S1～S5為一類。除S3、S5、S10、S23、S25樣品外，其他樣品的PCA結(jié)果與“3.3”項(xiàng)HCA結(jié)果一致。

圖2 27批HZS樣品的HCA

圖3 27批HZS樣品的PCA得分圖

通過(guò)載荷散點(diǎn)圖進(jìn)一步對(duì)影響HZS質(zhì)量的化學(xué)成分進(jìn)行比較和分析。在載荷散點(diǎn)圖中的各個(gè)點(diǎn)表示各個(gè)質(zhì)荷比-保留時(shí)間變量，根據(jù)變量離原點(diǎn)的距離判定變量對(duì)主成分的權(quán)重影響，離原點(diǎn)越遠(yuǎn)則表明該變量對(duì)主成分的影響權(quán)重越大[37]。圖4為各HZS樣品27個(gè)共有峰的PCA載荷散點(diǎn)圖，可以看出9（橙皮苷）、18（甘草酸）、20（HMOF）、21（桔皮素）、26號(hào)峰對(duì)主成分1的貢獻(xiàn)率較大，10、13（氧化前胡素）、14（新比克白芷內(nèi)脂）、15（甜橙素）、16、17、22（歐前胡素）、23（珊瑚菜素）、25號(hào)峰對(duì)主成分2的貢獻(xiàn)較大，說(shuō)明以上14種化合物在27批HZS樣品中的相對(duì)含量存在較大差異，是HZS的差異性成分。

3.5 潛在Q-Marker的確定

以藥物瑞德西韋為陽(yáng)性對(duì)照，以HZS 9種已鑒定出的差異性成分橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素作為研究對(duì)象，分別與SARS-CoV-2 Mpro進(jìn)行對(duì)接，以結(jié)合能大小、結(jié)合位點(diǎn)等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選出對(duì)SARS-CoV-2 Mpro可能有抑制作用的HZS潛在活性成分，作為HZS的潛在Q-Marker。陽(yáng)性對(duì)照和9種差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro的對(duì)接結(jié)果如表4所示。由表4可知，瑞德西韋與SARS-CoV-2 Mpro的結(jié)合能為?28.88 kJ/mol，差異性成分中橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素與SARS-CoV-2 Mpro的結(jié)合能分別為?36.84、?26.37、?28.46、?26.37、?38.09、?25.53、?26.37、?28.04、?28.46 kJ/mol，可見(jiàn)這9種差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro結(jié)合能接近于陽(yáng)性對(duì)照與SARS-CoV-2 Mpro的結(jié)合能。有文獻(xiàn)顯示，復(fù)合物的穩(wěn)定性主要由配體和受體之間形成的氫鍵和疏水鍵等作用力大小決定，形成的作用力越多，配體與受體結(jié)合的穩(wěn)定性越高[38-39]。由表4可知，瑞德西韋與SARS-CoV-2 Mpro結(jié)合，形成2個(gè)氫鍵和13個(gè)疏水鍵，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素與SARS-CoV-2 Mpro結(jié)合分別形成了9、2、3、3、8、3、3、1、1個(gè)氫鍵和9、8、7、7、8、6、6、8、7個(gè)疏水鍵，這可能是這9種化合物與SARS-CoV-2 Mpro的結(jié)合能小于或者較為接近瑞德西韋的原因。

圖4 27批HZS樣品的PCA載荷散點(diǎn)圖

表4 HZS的差異性成分與SARS-CoV-2 Mpro的結(jié)合能、氫鍵和疏水鍵信息

Table 4 Binding affinity, interactions with SARS-CoV-2 Mpro and binding sites of differential compounds in HZS

化合物名稱結(jié)合能/(kJ?mol?1)氫鍵疏水鍵 數(shù)量結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量結(jié)合位點(diǎn) 橙皮苷?36.849Thr24, Cys44, His41, Glu166, Cys145, Thr269Thr45, Met49, Ser46, Gln189, His163, Ser144, Leu141, Gly143, Thr25 氧化前胡素?26.372Glu166, Cys1458Met165, Met49, Thr25, Leu27, Gly143, Asn142, His164, His163 新比克白芷內(nèi)脂?28.463Arg298, Thr111, Thr2927Phe294, Asn151, Asp295, Gln110, Ile106, Ser158, Asp153 甜橙素?26.373Lys137, Leu287, Arg1317Asp289, Leu286, Leu271, Leu272, Tyr239, Tyr237, Thr199 甘草酸?38.098Ser158, Arg298, Asp295, Asn151, Thr111, Gln1108Asp245, Gln107, Val104, Asp153, Phe8, Phe294, Ile249, His246 HMOF?25.533Lys137, Thr199, Ser2846Asp197, Arg131, Leu287, Asp289, Glu288, Leu286 桔皮素?26.373Thr199, Leu287, Lys1376Asp289, Tyr237, Tyr239, Leu272, Leu271, Leu286 歐前胡素?28.041Ser1588 Phe294, Asp295, Asp153, Val104, Ile106, Gln110, Asn151, Thr111 珊瑚菜素?28.461Ser1587Phe294, Gln110, Ile106, Asp153, Lys102, Ile152, Asn151 瑞德西韋?28.882Thr24, Phe14013Thr26, His41, Thr25, Gly143, Cys145, His163, Leu141, Glu166,Met165, Gln189, Ser46, Met49, Asn142

有些氨基酸殘基形成2個(gè)氫鍵，因此氫鍵數(shù)量≥氨基酸殘基數(shù)量

some amino acid residues form two hydrogen bonds, so the number of hydrogen bonds ≥ the number of amino acid residues

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[40]，SARS-CoV-2 Mpro具有S1（Phe140、Leu141、His163、Met165、Glu166、His172）、S2（Met49、Asp187、Gln189）、S1’（Thr25、Leu27、Cys38、Pro39、Val42、Cys145）、S2’（Thr26、Asn28、Tyr118、Asn119、Gly143）和S4（Leu167、Gln192）5個(gè)活性口袋，配體通常需要與靶蛋白的關(guān)鍵活性氨基酸殘基結(jié)合，才能有效抑制其活性[41]。從結(jié)合位點(diǎn)角度分析，瑞德西韋位于SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4中（圖5），且與S1的活性氨基酸殘基Phe140結(jié)合形成1個(gè)氫鍵，與S1、S2、S1’、S2’的活性氨基酸殘基Thr26、Thr25、Gly143、Cys145、His163、Leu141、Glu166、Met165、Gln189、Met49結(jié)合形成10個(gè)疏水鍵（表4和圖6- A）。而9種差異性成分中橙皮苷和氧化前胡素也位于活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4中（圖5），橙皮苷與S1、S1’、S2’的活性氨基酸殘基Glu166、Cys145、Thr26結(jié)合形成4個(gè)氫鍵，與S1、S2、S1’、S2’的活性氨基酸殘基Met49、Gln189、His163、Leu141、Gly143、Thr25結(jié)合形成6個(gè)疏水鍵（表4和圖6-B）；氧化前胡素與S1、S1’的活性氨基酸殘基Glu166、Cys145結(jié)合形成2個(gè)氫鍵，與S1、S2、S1’、S2’活性氨基酸殘基Met165、Met49、Thr25、Leu27、Gly143、His163結(jié)合形成6個(gè)疏水鍵（表4和圖6-C）。

圖5 SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S1、S2、S1’、S2’和S4與配體瑞德西韋、橙皮苷和氧化前胡素對(duì)接的3D示意圖

圖6 瑞德西韋(A)、橙皮苷(B)、氧化前胡素(C)、新比克白芷內(nèi)脂(D)、甘草酸(E)、歐前胡素(F)、珊瑚菜素(G)與SARS-CoV-2 Mpro的分子對(duì)接2D圖

此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道[42-43]，Thr24、His41、Cys44、Thr45、Ser46、Asn142、Ser144、His164、Pro168、Arg188、Thr190、Thr111、Thr292、Phe294、Gln110、Asp153、Gln107、Ile249、His246等也是SARS-CoV-2 Mpro的活性氨基酸殘基，可形成SARS-CoV-2 Mpro的活性口袋S5（圖7）。瑞德西韋、橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素落在S5口袋中，且與活性氨基酸殘基結(jié)合（圖7）。其中，瑞德西韋與S5的活性氨基酸殘基Thr24結(jié)合形成1個(gè)氫鍵，與活性氨基酸殘基His41、Ser46、Asn142結(jié)合形成3個(gè)疏水鍵（表4和圖6-A）；橙皮苷與S5的活性氨基酸殘基Thr24、Cys44、His41結(jié)合形成5個(gè)氫鍵，與活性氨基酸殘基Thr45、Ser46、Ser144結(jié)合形成3個(gè)疏水鍵（表4和圖6-B）；氧化前胡素與S5的活性氨基酸殘基Asn142、His164結(jié)合形成2個(gè)疏水鍵（表4和圖6-C）；新比克白芷內(nèi)脂與S5的活性氨基酸殘基Thr111、Thr292結(jié)合形成2個(gè)氫鍵，與活性氨基酸殘基Phe294、Gln110、Asp153結(jié)合形成3個(gè)疏水鍵（表4和圖6-D）；甘草酸與S5的活性氨基酸殘基Thr111、Gln110結(jié)合形成2個(gè)氫鍵，與活性氨基酸殘基Gln107、Asp153、Phe294、Ile249、His246結(jié)合形成5個(gè)疏水鍵（表4和圖6-E）；歐前胡素與S5的活性氨基酸殘基Phe294、Asp153、Gln110、Thr111結(jié)合形成4個(gè)疏水鍵；珊瑚菜素與S5的活性氨基酸殘基Phe294、Gln110、Asp153結(jié)合形成3個(gè)疏水鍵（表4和圖6-F）。

圖7 SARS-CoV-2 Mpro活性口袋S5和配體瑞德西韋、橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素和珊瑚菜素對(duì)接的3D示意圖

綜上，9種差異性化合物中，只有橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素與SARS-CoV-2 Mpro的關(guān)鍵活性氨基酸殘基結(jié)合。因此，橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素可能對(duì)SARS- CoV-2 Mpro具有一定的潛在抑制作用，可作為HZS的潛在Q-Marker，以對(duì)HZS進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.6 質(zhì)量評(píng)價(jià)

以“3.5”項(xiàng)中確定的6種潛在Q-Marker橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素在HZS中的峰面積作為指標(biāo)，評(píng)價(jià)不同HZS樣品的質(zhì)量。將各HZS樣品中6種潛在Q-Marker化合物的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 21.0軟件中，進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差（LSD）檢驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。從表5中可以看出，27批HZS樣品中6種潛在Q-Marker的峰面積均存在顯著性差異（＜0.01）。其中，橙皮苷峰面積較高的樣品有S1～S4、S10、S11；氧化前胡素峰面積較高的樣品有S2、S6、S9、S23～S25；新比克白芷內(nèi)脂峰面積較高的樣品有S6、S9、S25；甘草酸峰面積較高的樣品有S3、S8～S10、S12～S15、S19；歐前胡素峰面積較高的樣品有S2、S3、S5、S6、S9、S18、S21、S23～S25；珊瑚菜素峰面積較高的樣品有S2、S3、S6、S9、S18、S19、S25、S26。

綜合6種潛在Q-Marker峰面積比較結(jié)果，27批HZS樣品中，樣品S2、S3、S6、S9、S25具有較好的抗SARS-CoV-2的潛在活性。

4 討論

通過(guò)建立不同HZS樣品的UPLC-Q-TOF-MS指紋圖譜，標(biāo)定了27種共有化合物，相似度在0.790～0.984，說(shuō)明不同HZS樣品具有一定的差異性；通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，確定了其中14種共有化合物為差異性化合物，共鑒定出了橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甜橙素、甘草酸、HMOF、桔皮素、歐前胡素、珊瑚菜素9種差異性化合物。這些差異性化合物主要來(lái)源于陳皮、白芷、甘草藥材，因此不同HZS樣品的差異性可能是以上3種藥材原材料質(zhì)量、投料以及工藝參數(shù)存在差異性導(dǎo)致的。唐素芳[4]采用UPLC-Q-TOF組學(xué)以及指紋圖譜等研究方法，對(duì)抽取的22個(gè)生產(chǎn)廠家、68批次藿香正氣水的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)個(gè)別企業(yè)陳皮和白芷的特征峰缺失嚴(yán)重，處方中甘草浸膏投料普遍不足，存在提取物投料或替代投料嫌疑，這與本研究結(jié)論基本一致。

表5 27批HZS樣品中橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素的峰面積比較 (, n = 3)

Table 5 Peak area of hesperidin, oxypeucedanin, neobyakangelicol, glycyrrhizic acid, imperatorin and phellopterin of 27 batches of HZS samples (, n = 3)

樣品編號(hào)峰面積/(×106) 橙皮苷氧化前胡素新比克白芷內(nèi)脂甘草酸歐前胡素珊瑚菜素 S16.02±0.33a1.81±0.02m0.88±0.01m1.50±0.11n1.41±0.03e2.53±0.07fg S25.49±0.09bc4.16±0.09cd2.08±0.08d4.72±0.42hi1.99±0.08b3.25±0.15b S35.82±0.05a4.11±0.03d1.98±0.03e6.14±0.01cd2.09±0.04b3.14±0.04bc S45.59±0.09b0.77±0.02p0.45±0.02p1.82±0.03mn0.64±0.02hi1.07±0.05lm S54.95±0.05e3.92±0.04e1.77±0.03fg5.31±0.18fg1.91±0.07bc2.86±0.09d S63.94±0.05j4.19±0.06cd2.29±0.05c5.79±0.15de2.39±0.06a3.90±0.08a S75.22±0.01d4.10±0.03d1.71±0.02g3.33±0.12kl1.67±0.03d2.35±0.04hi S84.03±0.14j2.12±0.04l0.99±0.03kl6.16±0.06cd0.88±0.05g1.72±0.08jk S94.61±0.06fg5.97±0.13a3.83±0.11a6.73±0.37b2.39±0.31a3.89±0.16a S105.45±0.04bc2.38±0.01k0.75±0.01n6.12±0.31cd1.45±0.07e2.24±0.10i S115.30±0.07cd1.35±0.01o0.47±0.01p5.49±0.30ef1.06±0.02f1.57±0.01k S124.67±0.03fg1.94±0.02m0.59±0.00o7.16±0.09a1.20±0.02f1.75±0.02j S134.14±0.04ij3.69±0.06f1.61±0.04h7.27±0.17a1.65±0.05d2.53±0.04fg S144.72±0.05f2.51±0.07jk1.32±0.06i6.24±0.07c0.85±0.01g1.16±0.02l S154.33±0.11hi1.25±0.05o0.44±0.02p6.76±0.07b0.57±0.01i0.99±0.02m S164.33±0.04hi2.42±0.05k0.92±0.02lm5.06±0.09gh1.16±0.02f1.61±0.03jk S173.53±0.09k2.43±0.05jk1.01±0.02kl3.11±0.18l0.35±0.01j0.69±0.01n S182.72±0.09o2.56±0.13ij1.04±0.04k5.71±0.07ef1.76±0.05cd3.08±0.11bc S192.78±0.06no2.68±0.02hi1.19±0.02j6.24±0.28c1.68±0.04d3.02±0.06c S202.96±0.06mn3.83±0.03e1.85±0.02f4.12±0.10j1.41±0.06e2.39±0.05gh S214.47±0.02gh3.42±0.01g1.56±0.01h4.89±0.17h1.93±0.08bc2.74±0.04de S224.00±0.12j1.64±0.04n0.68±0.02n2.08±0.13m0.77±0.03gh1.07±0.04lm S232.72±0.01o4.28±0.05c1.74±0.01g3.47±0.04kl1.81±0.04cd2.70±0.09de S242.05±0.10p4.26±0.11c2.01±0.09de4.18±0.05j1.79±0.04cd2.58±0.05ef S253.07±0.12lm5.10±0.06b2.68±0.06b3.65±0.10k2.03±0.04b3.13±0.07bc S261.86±0.01p2.75±0.02h1.30±0.01i4.32±0.06j1.71±0.05d3.01±0.01c S273.20±0.03l0.43±0.01q0.26±0.00q4.38±0.09ij0.50±0.00ij0.79±0.01n

表中同列不同小寫(xiě)字母表示27批HZS樣品中化合物峰面積存在顯著差異（＜0.01）

different lowercase letters in the same column in the table indicate that there are significant differences in peak areas of compounds in 27 batches of HZS samples (< 0.01)

通過(guò)分子對(duì)接確定了橙皮苷、氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂、甘草酸、歐前胡素、珊瑚菜素6種差異性化合物對(duì)SARS-CoV-2 Mpro有潛在抑制作用，可作為HZS的潛在Q-Marker。其中，已有研究結(jié)果顯示，橙皮苷[44-46]、甘草酸[46-49]以及歐前胡素[50-51]對(duì)SARS-CoV-2有一定的抑制作用，而氧化前胡素、新比克白芷內(nèi)脂和珊瑚菜素尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，這為SARS-CoV-2小分子抑制劑的研究提供了新思路?！吨袊?guó)藥典》2020年版[1]規(guī)定HZS處方中需檢測(cè)厚樸和陳皮2項(xiàng)原材料含量，二者分別以厚樸酚、和厚樸酚總量以及橙皮苷含量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，建議增加處方中白芷和甘草原材料的檢測(cè)方法，以得到更加綜合完整的藿香正氣水質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

另外，后續(xù)研究仍需通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)等進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步確定本研究預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening potential Q-Marker from Huoxiang Zhengqi Shui based on UPLC-Q-TOF-MS fingerprints and molecular docking

ZHANG Ya-li1, HAN Jian-xun1, 2, TUERSUNTUOHETI·Tuohetisayipu1, SUN Zhao-zeng1, SONG Wei1, ZHANG Yu-song3, WEI Hai-yan1, XIAO Jin-jin1

1. Pony Testing International Group Co., Ltd., Beijing 100095, China 2. Pony Testing International Group Beijing Academy of Inspection and Certification Co., Ltd., Beijing 100095, China 3. Beijing Pony Medical Laboratory Co., Ltd., Beijing 100095, China

To screen the potential quality markers (Q-Marker) of anti-coronavirus of Huoxiang Zhengqi Shui (藿香正氣水, HZS) based on the ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) fingerprints and molecular docking.UPLC-Q-TOF-MS fingerprints and chemometric methods were employed to establish fingerprints and find out the difference between the peaks for the 27 batches of HZS samples. The SARS-CoV-2 main protease (Mpro) inhibition potential of the differential compounds among the 27 batches of HZS were further predicted by molecular docking with remdesiviras positive control.The UPLC-Q-TOF-MS fingerprints of 27 batches of HZS samples were set up with 27 common peaks. Combined with hierarchical clustering analysis (HCA) and principal component analysis (PCA), 14 common peaks were determined as differential compounds, and nine of them were identified as hesperidin, oxypeucedanin, neobyakangelicol, sinensetin, glycyrrhizic acid, 3,5,6,7,8,3′,4′-heptamethoxyflavone, tangeretin, imperatorin and phellopterin. Molecular docking results showed that a total of six differential compounds were proven to have a certain inhibitory effect on SARS-CoV-2 Mpro, which can be used as potential Q-Marker of HZS, including hesperidin, oxypeucedanin, neobyakangelicol, glycyrrhizic acid, imperatorin and phellopterin.The potential Q-Marker of HZS was determined by UPLC-Q-TOF-MS fingerprints, chemometric analysis and molecular docking. This method may provide a certain reference for the identification of various drug components, analysis of the differences of the same type drug components and pharmaceutical activity evaluation.

Huoxiang Zhengqi Shui; Q-Marker; UPLC-Q-TOF-MS fingerprint; molecular docking; SARS-CoV-2 Mpro potential inhibitor prediction; hesperidin; oxypeucedanin; neobyakangelicol; glycyrrhizic acid; imperatorin; phellopterin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)19 - 6023 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.009

2022-04-12

北京市“科技助力經(jīng)濟(jì)2020”重點(diǎn)專項(xiàng)（SQ2020YFF0414333）；2020年蘇州市新型冠狀病毒感染應(yīng)急防治專項(xiàng)（XG56）

張雅莉，碩士，中級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗幤贩治雠c檢測(cè)。E-mail: yfh@ponytest.com

韓建勛，博士，副研究員，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量與安全控制。E-mail: yfb@ponytest.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]