GABA Transporter-2在克羅恩病中的表達(dá)及意義的臨床研究

韓微 周彩婷 馬怡君 丁巖冰 廖月霞 鄧彬 王磊

1揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，揚(yáng)州 225000；2大連醫(yī)科大學(xué)研究生院，大連 116044；3揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院消化科，揚(yáng)州 225000；4揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225000

克羅恩病（Crohn’s disease，CD）是一種發(fā)病原因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，近年來發(fā)病率逐年上升［1］。其臨床常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、體質(zhì)量減輕，肛周膿腫和肛瘺，還可出現(xiàn)腸外免疫性疾病，如強(qiáng)直性脊柱炎和游走性關(guān)節(jié)炎等［2］。目前臨床研究已證實，γ-氨基丁酸（GABA）能系統(tǒng) 可通過腸道微生物群-腸-腦軸（microbiota-gut-brain axis）影響宿主的免疫功能，在CD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3-4］。同時最新研究提示，在GABA能系統(tǒng)中GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GATs）具有信號傳導(dǎo)功能，參與免疫細(xì)胞的炎性反應(yīng)，其包含GAT-1、GAT-2、GAT-3和BGT-1亞單位。GAT-2除了在腸、肝、腎等組織中被發(fā)現(xiàn)，也存在于多種免疫細(xì)胞中，如T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和NK細(xì)胞［5］。已報道的相關(guān)研究表明，GAT-2在免疫性疾病多發(fā)性硬化癥（MS）中異常表達(dá)，參與了促炎機(jī)制及其下游效應(yīng)［6］，但目前還未有GAT-2在CD中表達(dá)研究的相關(guān)報道。我們推測GAT-2可能參與了CD發(fā)生發(fā)展過程，其表達(dá)水平與疾病狀態(tài)有一定關(guān)聯(lián)。本文對此展開研究，以期為CD臨床診斷與評估提供有效的客觀指標(biāo)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

資料與方法

1、研究對象

選取2010年3月至2021年3月期間于揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行腸鏡檢查及相關(guān)實驗室檢查后確診為CD的患者56例作為觀察組。上述患者符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2018年?北京）》［7］有關(guān)CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合CD診斷標(biāo)準(zhǔn)且為初次診斷，并經(jīng)病理檢查證實；⑵患者年齡范圍為18歲以上，不超過50歲；⑶臨床資料、病理診斷資料完整。排除了以下情形者：⑴合并惡性腫瘤；⑵伴有嚴(yán)重心、肝、腎功能障；⑶伴有感染性疾病或其他自身免疫性疾病。選擇同期行腸鏡檢查的健康體檢者68例作為對照組。觀察組中男性27例，女性29例，年齡18～47（32.30±9.40）歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）（21.20±2.24）kg∕㎡。對照組中男性32例，女性36例，年齡21～48（34.76±7.70）歲，BMI（22.45±2.02）kg∕㎡。兩組患者性別、年齡、BMI方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

本研究獲得揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2022-YKL1-20-005），所有研究對象及其親屬簽署臨床試驗知情同意書。

2、研究方法

2.1、臨床資料收集收集研究對象的年齡、性別、BMI、吸煙史、病變位置（回腸末段、結(jié)腸、回結(jié)腸）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、疾病行為（非穿透非狹窄、狹窄、穿透）和肛周病變等完整臨床信息。

2.2、GAT-2檢測收集56例CD患者和68例健康體檢患者腸黏膜組織，用10%的中性甲醛（南京化學(xué)試劑股份有限公司）進(jìn)行固定，經(jīng)梯度濃度乙醇（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）脫水，采用組織包埋機(jī)（常州市中威電子儀器有限公司）將組織用石蠟包埋成塊，再用組織切片機(jī)（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）將組織切成4μm厚切片，依次采用二甲苯（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、梯度濃度乙醇進(jìn)行脫蠟、EDTA抗原修復(fù)（北京索萊寶科技有限公司）及內(nèi)源性過氧化物酶（北京中杉金橋生物科技有限公司）阻斷，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（北京中杉金橋生物科技有限公司）漂洗3次后加山羊血清（北京中杉金橋生物科技有限公司）進(jìn)行封閉，滴加經(jīng)1∶150倍稀釋的鼠抗人GAT-2（艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司）多克隆抗體，置于4℃冰箱孵育過夜，PBS漂洗3次后加入羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司）于25℃孵育30 min，PBS漂洗，使用DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司）顯色，再用蘇木素（珠海貝索生物科技有限公司）復(fù)染、梯度乙醇脫水及中性樹脂（上海標(biāo)本模型廠）封片，顯微鏡下觀察GAT-2的表達(dá)情況。

2.3、CD疾病活動指數(shù)評價使用簡化CD疾病活動指數(shù)（CDAI）評分標(biāo)準(zhǔn)對CD患者進(jìn)行評分，根據(jù)過去1周內(nèi)全身健康狀況進(jìn)行自我評分，包括腹痛、腹部包塊、腹瀉和伴隨疾病等。CDAI評分≤4分為緩解期，＞4分為活動期。CDAI評分4～7分為輕度活動期，＞7～16分為中度活動期，＞16分為重度活動期［8］。

3、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

CRP＞8 mm∕L定義為升高，ESR＞21 mm∕h定義為升高；GAT-2陽性表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，由3名經(jīng)驗豐富的主治病理醫(yī)師根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行綜合評分。判定標(biāo)準(zhǔn)如下。染色強(qiáng)度：0分為不著色，1分為淺黃色，2分為黃色，3分為棕黃色；陽性細(xì)胞數(shù)：0分為陽性細(xì)胞比率＜5%，1分為陽性細(xì)胞比率≥5%～25%，2分為陽性細(xì)胞比率＞25%～50%，3分為陽性細(xì)胞比率＞50%～75%，4分為陽性細(xì)胞比率＞75%。最終得分=染色強(qiáng)度計分×陽性細(xì)胞數(shù)計分，最終得分＜4分為陰性表達(dá)，≥4分為陽性表達(dá)［9］。

4、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用卡方檢驗比較CD患者腸黏膜組織和健康體檢患者腸黏膜組織GAT-2表達(dá)水平；采用卡方檢驗比較不同臨床病理特征CD患者腸黏膜組織中GAT-2表達(dá)水平；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1、GAT-2在健康體檢者腸鏡標(biāo)本與CD患者腸鏡標(biāo)本中的表達(dá)情況比較

68例健康體檢者腸鏡組織中有63例（92.65%）呈陰性表達(dá)（圖1A）；56例CD患者腸鏡組織中有47例（83.93%）呈陽性表達(dá)（圖1B和圖1C），CD患者腸鏡組織中GAT-2陽性表達(dá)率顯著高于在健康體檢者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。同時觀察到在健康體檢者腸鏡組織中，GAT-2僅少量表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的胞漿中（圖1A）；在CD患者腸鏡組織中，GAT-2不僅明顯地表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的胞漿中，而且較多地表達(dá)于間質(zhì)炎癥細(xì)胞胞漿中，胞漿呈黃色或棕黃色顆粒狀（圖1B和圖1C）。

圖1 GAT-2在68例健康體檢者腸鏡組織與56例克羅恩病患者腸鏡組織中的表達(dá)情況。A：GAT-2在健康體檢者腸組織中呈陰性表達(dá)，僅少量腺上皮細(xì)胞胞漿著色（二步法10×20）；B：GAT-2在克羅恩病患者腸黏膜組織中呈陽性表達(dá)，廣泛表達(dá)于腺上皮細(xì)胞與間質(zhì)炎癥細(xì)胞中（二步法10×20）；C：GAT-2陽性表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，可見胞漿呈黃色或棕黃色顆粒狀（二步法10×40）

表1 GAT-2在克羅恩病患者和健康體檢者腸鏡標(biāo)本表達(dá)情況比較［例（%）］

2、GAT-2表達(dá)評分與CD患者CDAI評分的相關(guān)性分析

按照CDAI評分將CD患者分為緩解期（9例）、輕度活動期（16例）、中度活動期（14例）、重度活動期（17例），各期患者GAT-2表達(dá)評分分別為（2.44±2.01）、（6.41±2.42）、（8.14±2.07）、（10.19±1.68）分，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=28.486，P＜0.05）；重度活動期患者的GAT-2表達(dá)評分明顯高于中度活動期患者、輕度活動期患者與緩解期患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），GAT-2表達(dá)評分與CDAI評分間散點(diǎn)圖提示GAT-2表達(dá)評分與CDAI評分呈正相關(guān)（r=0.756，P＜0.05），隨著GAT-2表達(dá)評分的增加，CD患者疾病的嚴(yán)重程度也隨之升高（圖2），兩者之間數(shù)據(jù)序列符合正態(tài)分布。GAT-2表達(dá)的強(qiáng)度與陽性率在緩解期（圖3A）、輕度活動期（圖3B）、中度活動期、重度活動期（圖3C）中逐漸增加。者GAT-2表達(dá)陽性率顯著高于血清CRP正常、ESR正常、無肛周病變的CD患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。這提示血清CRP水平升高、ESR水平升高、有肛周病變可能是CD疾病進(jìn)展的危險因素。見表2。

表2 GAT-2表達(dá)情況與56例CD患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

圖2 56例克羅恩病患者GAT-2表達(dá)評分與CDAI評分間散點(diǎn)圖

圖3 GAT-2在56例不同臨床分期克羅恩病患者中的表達(dá)（二步法10×20）。A：GAT-2在緩解期中的表達(dá)；B：GAT-2在輕度活動期中的表達(dá)；C：GAT-2在重度活動期中的表達(dá)

討 論

3、GAT-2表達(dá)情況與CD患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

GAT-2表達(dá)情況在性別、年齡、吸煙、病變部位、病灶范圍（內(nèi)鏡下多個潰瘍面積相加之和）、病變部位是否形成潰瘍、疾病行為方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；而血清CRP水平升高、ESR水平升高、有肛周病變的CD患CD發(fā)病年齡有兩個高峰，分別為20～40歲和60～70歲，最常見于回腸末端和鄰近結(jié)腸。近年來CD發(fā)病率逐年上升，且因CD病情特點(diǎn)復(fù)雜多變，治療時間長，有終身復(fù)發(fā)傾向［10］。CD早期臨床表現(xiàn)與腸結(jié)核、急慢性腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎等癥狀相似，內(nèi)鏡檢查誤診率高。診斷需結(jié)合臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡和病理組織學(xué)進(jìn)行綜合分析［11］。但因CD病理組織學(xué)形態(tài)多變，且疾病各階段表現(xiàn)不一，無絕對組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時由于活檢部位、數(shù)量、病史缺陷等因素，導(dǎo)致對于CD的病理診斷具有較高主觀性，不利于CD的早診斷與早治療［12］。因此，鑒于目前CD臨床病理診斷過程中出現(xiàn)的問題，越來越需要客觀指標(biāo)作為CD確診過程中的輔助診斷方法，這也是此次臨床研究的出發(fā)點(diǎn)。

1、GABA能系統(tǒng)與CD的關(guān)聯(lián)

腸道和大腦之間存在的復(fù)雜的雙向通信系統(tǒng)，最初被稱為“腸-腦軸”，其與宿主心理和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］。隨著研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)腸道微生物群在維持局部和全身穩(wěn)態(tài)也起到了關(guān)鍵作用，它可通過“腸-腦軸”影響宿主的免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌和迷走神經(jīng)功能，因而將“腸-腦軸”變更為“微生物群-腸-腦軸”。最新的研究證實中樞神經(jīng)的信號系統(tǒng)通過“腸-腦軸”可控制腸道運(yùn)動、感覺、分泌和免疫功能。反過來，來自腸道的信號被傳遞到中樞影響宿主行為、認(rèn)知和情緒調(diào)節(jié)等高級功能而導(dǎo)致疾病狀態(tài)［14］。腸道微生物群通過多種代謝產(chǎn)物參與腸-腦交流，如GABA、色氨酸前體、5-羥色胺、谷氨酰胺、組胺等，構(gòu)成了“微生物群-腸-腦軸”［15］。GABA是神經(jīng)系統(tǒng)中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，由宿主∕微生物通過氨基酸谷氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生；同時腸道中的一些益生菌，如大腸桿菌屬、乳酸桿菌屬，在體外和體內(nèi)也能夠產(chǎn)生GABA［16］。由此可見，GABA能系統(tǒng)與CD的發(fā)生發(fā)展關(guān)系緊密，具有重要的生理功能。

2、GAT-2在GABA能系統(tǒng)中的作用

GABA能系統(tǒng)主要包括GABA、GABA受體、GATs和GABA轉(zhuǎn)氨酶。越來越多的研究表明，神經(jīng)系統(tǒng)控制宿主的免疫反應(yīng)，免疫細(xì)胞也具有GABA能系統(tǒng)［17］。GATs通過介導(dǎo)GABA從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)間隙終止GABA信號。GATs有4種亞單位：GAT-1（SLC6A1）、GAT-2（SLC6A13）、GAT-3（SLC6A11）和BGT-1（SLC6A12）。GAT-2是一種高選擇性的Na+和Cl-離子依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在除神經(jīng)系統(tǒng)外的外周器官廣泛表達(dá)，廣泛分布于外周組織，如腸道細(xì)胞肝臟、腎臟及視網(wǎng)膜外周免疫細(xì)胞等。Ren等［18］研究發(fā)現(xiàn)GAT-2對輔助性T細(xì)胞17（Th17）的分化有調(diào)控作用，Th17細(xì)胞表現(xiàn)出更高的GAT-2豐度，并具有明顯的細(xì)胞代謝特征。Xia等［19］研究發(fā)現(xiàn)：在促炎信號刺激下，巨噬細(xì)胞通過GAT-2轉(zhuǎn)運(yùn)GABA進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)，通過LPS∕IFN-γ途徑產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-1β。當(dāng)腸上皮細(xì)胞（IEC）受到免疫失調(diào)、細(xì)菌感染、色氨酸缺乏等因素發(fā)生損傷，導(dǎo)致固有層內(nèi)大量淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞增生反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-17、IL-6等促炎性細(xì)胞因子水平增加，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)促炎性細(xì)胞因子與抗炎性細(xì)胞因子的失衡，使得腸黏膜受到損傷而發(fā)生CD［20］。由此推測，GAT-2可能通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子參與CD的發(fā)生發(fā)展。

3、GAT-2在CD中的表達(dá)及意義

通過本次臨床研究我們發(fā)現(xiàn)，GAT-2在CD患者腸鏡標(biāo)本中的陽性表達(dá)率顯著增加（P＜0.05），在健康人群中，GAT-2僅少量表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的胞漿中；在CD患者腸鏡組織中，GAT-2不僅明顯表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的胞漿中，而且較多表達(dá)于間質(zhì)炎癥細(xì)胞胞漿中，胞漿呈黃色或棕黃色顆粒狀；不同臨床分期CD患者之間，GAT-2的陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），GAT-2表達(dá)評分與CDAI評分呈正相關(guān)，當(dāng)CD疾病嚴(yán)重程度增加時，GAT-2表達(dá)的強(qiáng)度與陽性率也隨之增加；血清CRP水平升高、ESR水平升高、有肛周病變的CD患者GAT-2表達(dá)陽性率顯著高于血清CRP正常、ESR正常、無肛周病變的CD患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），提示血清CRP水平升高、ESR水平升高、有肛周病變可能是CD疾病進(jìn)展的危險因素。

綜上所述，GAT-2在CD患者腸鏡組織中呈高表達(dá)，而在正常人群腸鏡組織中呈低表達(dá)；且GAT-2表達(dá)的強(qiáng)度、陽性率與CD患者的炎癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)，炎癥越重GAT-2表達(dá)強(qiáng)度與陽性率越高。因此，GAT-2可作為CD腸鏡病理診斷的免疫抗體標(biāo)志物，為臨床病理確診提供有效的客觀指標(biāo)，具有一定的臨床意義。至于GAT-2通過何種機(jī)制參與到CD的免疫應(yīng)答過程之中，則有待于接下來進(jìn)一步研究探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突