小鼠視神經(jīng)損傷后視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)變化

季媛飛 楊陳 王敏 吳文燦 余波

外傷性視神經(jīng)病變（Traumatic optic neuropathy,TON）是一種少見的疾病，常常由于頭部鈍器損傷后引起，可造成永久性的視力喪失[1-2]。早期患者通常表現(xiàn)為部分或完全的視力喪失、相對瞳孔傳入障礙、視盤正常和視野缺損[2]，后期出現(xiàn)視神經(jīng)萎縮。目前，尚無有效的循證醫(yī)學(xué)治療方法，因為單純隨訪、糖皮質(zhì)激素治療和視神經(jīng)管減壓術(shù)都被證實對改善視力效果欠佳[3-5]。視神經(jīng)損傷后，在免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的相互作用下，組織病理學(xué)發(fā)生改變，包括軸突變性和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要常駐免疫細(xì)胞，參與神經(jīng)穩(wěn)態(tài)的維持和發(fā)展、損傷的應(yīng)答和修復(fù)[6-7]，被認(rèn)為是治療視神經(jīng)疾病的重要細(xì)胞靶點[8]。在生理條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)呈分枝狀，當(dāng)受到炎癥、損傷或缺血時其可被激活，轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆?，?shù)量增多，并做出迅速應(yīng)答[9]。本研究通過建立視神經(jīng)夾持模型來觀察不同時間點小鼠視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目與形態(tài)的變化，了解視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化情況，為將來通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)進(jìn)行視神經(jīng)損傷修復(fù)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

采用由CX3CR1+/GFP小鼠（訂購于美國Jackson實驗室）和C57BL/6J WT小鼠雜交配得到的清潔級健康成年CX3CR1-/GFP轉(zhuǎn)基因雜交雄性小鼠32 只，8～16周齡，體質(zhì)量18～25 g，其小膠質(zhì)細(xì)胞均表現(xiàn)為GFP（+）。實驗期間飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院清潔級動物實驗室，自由飲水?dāng)z食，22 ℃室內(nèi)溫度、濕度恒定，照明為12 h/12 h明暗交替。眼部檢查：雙眼角膜透明，屈光介質(zhì)清，瞳孔等大等圓，對光反應(yīng)靈敏，眼底無異常。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為4組：正常對照組，視神經(jīng)損傷1、7、14 d組，每組8只。正常對照組不做任何處理，視神經(jīng)損傷組均在左眼行視神經(jīng)夾傷模型，右眼不予處理。本實驗嚴(yán)格按照溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理要求進(jìn)行，并遵循溫州醫(yī)科大學(xué)批準(zhǔn)的動物護(hù)理和使用方案（批號：wydw2019-0161）。

1.2 視神經(jīng)損傷模型建立

鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉小鼠眼表，并用水合氯醛和烏拉坦麻醉藥（0.5 g烏拉坦，2.5 ml 10 %水合氯醛，7 ml蒸餾水混合）按0.15 ml/10 g進(jìn)行腹腔注射麻醉。側(cè)臥固定，聚維酮碘消毒左眼結(jié)膜囊及眼周皮膚。在顯微鏡下，沿角膜緣剪開顳側(cè)球結(jié)膜，彎鑷將眼球輕推向鼻側(cè)，直顳鈍性分離充分暴露視神經(jīng)，用恒定壓力的反向鑷夾持球后端視神經(jīng)5 s，可見傷眼瞳孔散大固定、直接對光反射消失，眼內(nèi)無出血?？p合結(jié)膜，將眼球恢復(fù)正常生理位置，眼表涂凡士林和氧氟沙星滴眼液，放置于37 ℃加熱板至蘇醒。

1.3 標(biāo)本取材

在相應(yīng)的時間點，水合氯醛和烏拉坦麻醉藥0.15 ml/10 g腹腔麻醉后，四肢固定于手術(shù)臺，開胸暴露心臟。止血鉗阻斷肺動脈和降主動脈，注射針插入左心室，右心耳開口放血。1.5 ml/min速度勻速灌注2 ml 37 ℃ 0.01 mmol/L PBS，預(yù)冷10 ml 4%PFA溶液。沿小鼠頸部剪下頭顱，去除顱骨和大腦，分離視神經(jīng)與周圍組織，取出左眼視神經(jīng)，避光固定于4% PFA溶液。

1.4 視神經(jīng)冰凍切片

視神經(jīng)避光置于4% PFA溶液，在4 ℃冰箱中固定4 h，再在30%蔗糖溶液中脫水過夜。用包埋劑包埋視神經(jīng)后進(jìn)行冰凍切片，切片厚30 μm，間隔1片貼于載玻片上，清洗包埋劑并封片。

1.5 激光共聚焦顯微鏡拍攝及小膠質(zhì)細(xì)胞分析

由于CX3CR1-/GFP轉(zhuǎn)基因雜交小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞自帶綠色熒光，因此無需染色，直接用Zeiss LSM880激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行圖像采集即可觀察細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)。每根視神經(jīng)選取3片冰凍切片標(biāo)本，在每片視神經(jīng)切片距離眼球端500 μm處拍攝1張圖像。用共聚焦顯微鏡20×拍攝，截取200 μm×300 μm視野面積，用Image J軟件計數(shù)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目，并計算單位面積的細(xì)胞密度（細(xì)胞個數(shù)/mm2）。用共聚焦顯微鏡63×拍攝，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗研究。采用GraphPad Prism 7.04軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，滿足方差齊性，以表示，4組間的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目變化

正常對照組視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目為（438±16）個/mm2。視神經(jīng)損傷1 d組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目為（323±15）個/mm2，視神經(jīng)損傷7 d組為（1 252±107）個/mm2，視神經(jīng)損傷14 d組為（1 474±113）個/mm2。視神經(jīng)損傷7 d組和14 d組的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目與對照組和視神經(jīng)損傷1 d組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），但是對照組和損傷1 d組比較以及損傷7 d組和損傷14 d組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

正常對照組的視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，胞體較小，分枝較多且細(xì)長、向四周伸展（見圖1A、E）。視神經(jīng)損傷1 d后，小膠質(zhì)細(xì)胞分枝數(shù)量減少，部分分枝朝向損傷部位，遠(yuǎn)離損傷部位的分枝減少，細(xì)胞核形態(tài)變化不明顯（見圖1B、F）。損傷7 d組的視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，排列較紊亂，存在少量細(xì)胞聚集現(xiàn)象，分枝由長而細(xì)轉(zhuǎn)變成短而粗，且越靠近細(xì)胞核分枝越粗，分枝方向與視神經(jīng)長軸方向平行，細(xì)胞核體積明顯增大（見圖1 C、G）。視神經(jīng)損傷14 d組，視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞聚集現(xiàn)象明顯，細(xì)胞核較大，突起數(shù)目較少，伸展范圍較短，與損傷7 d組類似（見圖1 D、H）。

3 討論

視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，受到損傷后將不能再生。TON是一種由眼眶外傷引起的較少見但可造成永久視力喪失的疾病。TON的發(fā)生率占所有閉合性頭部外傷的0.5%～5%，占頜面部骨折的2.5%[1]。急性TON的臨床表現(xiàn)為部分或完全失明，相對瞳孔傳入障礙，視野缺損。疾病初期，視盤外觀無變化，但隨著時間的推移，視盤會呈現(xiàn)蒼白色。TON可導(dǎo)致軸突的變性和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（Retinal ganglion cells,RGCs）的凋亡，因此視神經(jīng)損傷再生需要具備以下幾個條件：最大化RGCs內(nèi)在再生能力；克服抑制視神經(jīng)再生的外部環(huán)境；優(yōu)化再生軸突到達(dá)中樞。目前對于TON的病理生理和分子機(jī)制的了解仍然有限，尚無有效的治療方法[10-11]。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是視神經(jīng)的重要組成部分，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，它們之間不斷地相互作用，形成一個強(qiáng)大而高效的網(wǎng)絡(luò)，對于維持神經(jīng)元活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要常駐免疫細(xì)胞，占所有膠質(zhì)細(xì)胞的10%～15%，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理條件下都參與了各種保護(hù)和損傷作用。在生理條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，胞體較小，分枝細(xì)長，動態(tài)伸縮的突起不斷地掃描周圍環(huán)境，同時釋放神經(jīng)保護(hù)因子和抗炎因子，為神經(jīng)元提供支持，參與程序性細(xì)胞凋亡，維持微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。有研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞在靜息狀態(tài)下高度活躍，其胞體一般保持固定，而突起不斷伸縮，清除積累的代謝產(chǎn)物和衰竭的組織成分，當(dāng)相鄰的突起相互碰撞時，末端相互排斥[13]。急性損傷后，分枝狀小膠質(zhì)細(xì)胞迅速被激活，形態(tài)變?yōu)榘⒚装蜆?，胞體增大，分枝縮短變粗，向損傷部位遷移[14]，并釋放各種因子，一方面清除受損凋亡的細(xì)胞，限制進(jìn)一步損傷，另一方面引發(fā)持續(xù)激活，影響組織修復(fù)[15-16]。在神經(jīng)退行性病變中，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的線粒體碎片可調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，進(jìn)而加速神經(jīng)元的損傷和死亡[17]，同時星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能喪失，也可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變和神經(jīng)退行性病變[18]。包繞軸突的髓鞘由少突膠質(zhì)細(xì)胞形成，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，可直接引起脫髓鞘/髓鞘再生[19]。相反，少突膠質(zhì)細(xì)胞也能影響小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和存活，如少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的CD200可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，SEMA3A可促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[20]。

圖1.小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞的分布與形態(tài)變化A-D：分別為正常對照組及ONC 1、7、14 d組小鼠視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（×20），紅色箭頭所示為小膠質(zhì)細(xì)胞聚集；E-H：分別為正常對照組及ONC 1、7、14 d組小鼠視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞（×63）Figure 1. Distributed and morphological changes of microglia in optic nerve of mice at different time points after optic nerve crush.A-D: control group,ONC 1 d group,ONC 7 d group and ONC 14 d group (×20).The red arrow shows the aggregation of microglia.E-H: control group,ONC 1 d group,ONC 7 d group and ONC 14 d group (×63).ONC,optic nerve crush.

本實驗通過視神經(jīng)夾傷模型模擬外傷性視神經(jīng)病變，這是一種用于研究視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞功能的常用模型[21-22]。我們利用CX3CR1-/GFP轉(zhuǎn)基因雜交小鼠，其通過同源重組將CX3CR1基因替換為編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）的基因后，所有小膠質(zhì)細(xì)胞都被熒光標(biāo)記[23]，因此視神經(jīng)冰凍切片后，用共聚焦顯微鏡可直接觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)與分布。

本研究觀察了小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及形態(tài)變化。我們發(fā)現(xiàn)正常對照組視神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，形態(tài)為分枝狀的靜息狀態(tài)，分布均勻且稀疏，在視神經(jīng)損傷1 d后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目輕度減少，其胞體變化不明顯，部分細(xì)胞的分枝增粗，且分枝在損傷對側(cè)縮短，而在損傷側(cè)較長，說明視神經(jīng)損傷急性期，可能部分小膠質(zhì)細(xì)胞受損凋亡，存活的小膠質(zhì)細(xì)胞處于激活初期，正在轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆?。視神?jīng)損傷7 d后，大部分小膠質(zhì)細(xì)胞處于激活狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)急劇增加，胞體直徑增大，分枝縮短增粗，呈現(xiàn)阿米巴樣，部分細(xì)胞出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。視神經(jīng)損傷后14 d，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目仍然較多，形態(tài)與損傷7 d組相比變化不大，提示其仍處于激活狀態(tài)。這些表現(xiàn)與既往的研究[14]相一致。

本研究存在進(jìn)一步的提升空間，首先，可以設(shè)置更多時間點觀察視神經(jīng)損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞激活和失活的變化；其次，可以觀察視神經(jīng)不同部位小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)；最后，通過調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)進(jìn)行視神經(jīng)修復(fù)可能是值得進(jìn)一步研究的方向。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明季媛飛：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。楊陳：實施研究，收集數(shù)據(jù)，參與資料的分析和解釋，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。王敏：參與選題、設(shè)計；指導(dǎo)相關(guān)實驗工作和修改論文的結(jié)果、結(jié)論。吳文燦：參與選題、設(shè)計；指導(dǎo)相關(guān)實驗工作。余波：參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論；根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改