寡聚核苷酸介導(dǎo)的基因突變技術(shù)創(chuàng)制抗除草劑煙草新種質(zhì)

謝宇峰， 秦利軍

( 貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550025 )

煙草()為茄科(Solanaceae)煙草屬()一年生或有限多年生草本植物，是一種經(jīng)濟(jì)價值較高的作物，除主要用于吸食外，煙草還具有蛋白食用及藥用價值。煙草在我國南方和北方均有種植，面積達(dá)146.67萬 hm，年均產(chǎn)量約30億 kg，在我國占有極大的經(jīng)濟(jì)市場(張杰等，2018)，是國家和地方財稅的重要經(jīng)濟(jì)來源。然而，煙田雜草危害煙草生產(chǎn)，嚴(yán)重影響煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量。煙田雜草不僅與煙草爭奪水分、養(yǎng)分、光照和空間，而且作為煙草病蟲害傳播的中間宿主，極大影響了煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量(蔡海林等，2020)。在煙田中，氯磺隆、草甘膦除草劑可以通過靶向結(jié)合植物體中的乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)用以抑制纈氨酸(valine，Val)、亮氨酸(leucine，Leu)、異亮氨酸(isoleucine，Ile)的生物合成，進(jìn)而導(dǎo)致雜草死亡(Scoloss & Ciskanik, 1988)。雖然這類除草劑在殺滅雜草時具有活性高且藥量低、對哺乳動物低毒、生態(tài)環(huán)境友好的特點(diǎn)，但會極大影響農(nóng)作物的生長和發(fā)育(Grandpmo & Peter, 1998；牛聰偉，2005)。ALS中特定氨基酸突變會使細(xì)胞系或植株產(chǎn)生對除草劑的抗性(Kleschick & Costales, 1990; Scoloss, 1990)，如擬南芥()中ALS氨基酸保守區(qū)域第197位氨基酸由脯氨酸(proline，Pro)突變?yōu)榻z氨酸(serine，Ser)，會使細(xì)胞系具有對氯磺隆(chlorsulfuron，Chl)和芐嘧磺隆(bensulfuron methyl)等磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗性；甘藍(lán)()中ALS保守氨基酸序列(ahas3r)第557位Pro突變?yōu)楣劝滨０?glutamine，Gln)，會使細(xì)胞系具有對三唑嘧啶(triazole pyrimidine)類除草劑抗性(Saari & Maxwell, 1997)。此外，水稻()中ALS特定氨基酸的突變會使植株產(chǎn)生對除草劑的抗性。將ALS氨基酸第95位甘氨酸(glycine，Gly)突變?yōu)楸彼?alanine，Ala)后，獲得對雙草醚(bispyribac-sodium)產(chǎn)生抗性的水稻植株(Okuzaki et al., 2007)。煙草中，通過電穿孔及微粒轟擊方式將嵌合體DNA/RNA寡聚核苷酸導(dǎo)入原生質(zhì)體，使其基因所編碼的氨基酸特定位點(diǎn)發(fā)生突變(脯氨酸-196-谷氨酸，色氨酸-573-亮氨酸)，獲得抗氯磺隆的抗性植株(Beetham et al., 1999)。因此，利用分子生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)代謝關(guān)鍵酶編碼基因的定點(diǎn)突變，是創(chuàng)制抗除草劑作物新種質(zhì)的重要手段之一。

寡聚核苷酸介導(dǎo)的基因突變(OMM)技術(shù)是一種新的基因誘變技術(shù)，已被成功運(yùn)用于動物及酵母的基因定點(diǎn)突變(Yoon et al., 1996; Alexeev et al., 2000; Bartlett et al., 2000)。在植物中，該技術(shù)已成功實(shí)現(xiàn)對玉米()基因發(fā)生定點(diǎn)突變，引起AHAS蛋白中621氨基酸由Ser突變?yōu)樘於彼?aspartic acid，Asp)，獲得對咪唑啉酮(imidazolone)類除草劑具有抗性的突變玉米植株(Zhu et al., 1999)。Okuzaki等(2007)利用OMM技術(shù)實(shí)現(xiàn)水稻ALS中第171位氨基酸由Pro變?yōu)镚ly，第548位氨基酸由色氨酸(tryptophan，Tyr)變?yōu)镮le以及第627位氨基酸由Ser變?yōu)镮le，獲得除草劑抗性水稻。與應(yīng)用廣泛的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白Cas(CRISPR/Cas)技術(shù)，以及轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)技術(shù)(Ishino et al.,1987; Michno et al., 2020)相比，OMM技術(shù)所誘導(dǎo)的突變幾乎都是有目的定點(diǎn)突變，不會向生物體內(nèi)引入新的基因。Breyer等(2009)認(rèn)為通過OMM技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生的生物不應(yīng)當(dāng)歸類于轉(zhuǎn)基因生物。在對轉(zhuǎn)基因生物安全性爭論不休的今天，OMM技術(shù)為生物品質(zhì)的改良提供了一條新的途徑。本研究以煙草品種‘K326’為材料，利用同源克隆法獲得基因，根據(jù)基因保守區(qū)結(jié)構(gòu)分析構(gòu)建RNA/DNA嵌合體分子，并利用該嵌合體實(shí)現(xiàn)對基因的定點(diǎn)突變，創(chuàng)制對磺酰脲類除草劑具有抗性的煙草新種質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

煙草()品種‘K326’由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。DL 2 000 DNA marker、LA Taq with GC Buffer、DNA快速純化回收試劑盒購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；MS培養(yǎng)基購自Phyto Technology Laboratoies公司；新型植物DNA提取試劑盒購自TIANGEN BIOTECH公司；膠回收試劑盒、pGEM-T Easy Vector System購自Promega公司；氯磺隆購自Sigma-Aldrich公司；RNA/DNA嵌合體由TaKaRa公司合成；基因克隆引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 煙草品種‘K326’基因組提取及基因克隆 以煙草品種‘K326’的葉片為材料，使用TIANGEN BIOTECH公司新型植物DNA提取試劑盒提取煙草基因組DNA。根據(jù)NCBI報道的普通煙草基因(基因登錄號：X07644.1和X07645.1)序列設(shè)計同源克隆引物及含588位點(diǎn)和1719位點(diǎn)突變區(qū)擴(kuò)增引物，引物序列如表1所示。

表 1 煙草ALS基因的克隆及保守區(qū)擴(kuò)增引物Table 1 Cloning and conserved region amplification primer sequences of tobacco ALS gene

參照TaKaRa公司LA Taq with GC Buffer試劑盒操作方法，對基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(50 μL)：0.5 μL TaKaRaTaq(5 U·μL)，25.0 μL 2 × GC BufferⅡ，8.0 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L)，1.0 μL R-F(20 μmol·L)，1.0 μL R-R(20 μmol·L)，1.0 μL基因組DNA(100 ng)和13.5 μL ddHO。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸160 s，35個循環(huán)后72 ℃ 延伸 10 min。

1.2.2 PCR產(chǎn)物連接及測序 參照Promega公司膠回收試劑盒操作方法回收PCR產(chǎn)物，參照Promega公司pGEM-T Easy Vector System試劑盒說明將回收的PCR產(chǎn)物連接于pGEM-T Easy Vector。連接有PCR產(chǎn)物的pGEM-T Easy Vector導(dǎo)入大腸桿菌()DH5α感受態(tài)菌株。將工程菌送至北京諾賽公司測序。利用DNAMAN 9.0軟件中“序列拼接功能”對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，將拼接結(jié)果于NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，確認(rèn)保守區(qū)。

1.2.3 RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合體構(gòu)建 基于煙草品種‘K326’的基因保守區(qū)的結(jié)構(gòu)，參照Kochevenko和Willmitzer(2003)的方法設(shè)計RNA/DNA嵌合體序列，交由TaKaRa公司合成。嵌合鏈設(shè)計基本要求與靶基因的序列一樣(除了突變位點(diǎn)外)，通過寡聚核苷酸鏈代換，引入靶位點(diǎn)堿基序列變化。

1.2.4 基因槍介導(dǎo)的RNA/DNA導(dǎo)入煙草的愈傷組織 參照譚穎等(2013)的方法略有改動，對煙草品種‘K326’的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)。煙草葉片經(jīng)75%的酒精滅菌30 s，0.1%HgCl消毒8 min，無菌水清洗3～5次后切塊(0.5 cm×0.5 cm)接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)皿上，經(jīng)過2周誘導(dǎo)培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接于新鮮繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)分化芽點(diǎn)，分化芽接種生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+1.5 mg·L6-BA+0.1 mg·LNAA；繼代培養(yǎng)基：MS+1.0 mg·L6-BA+0.2 mg·LNAA。將煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)基分組，分別加入不同濃度的氯磺隆，對愈傷組織進(jìn)行氯磺隆敏感性實(shí)驗(yàn)。氯磺隆濃度梯度分別設(shè)置為90、100、110、120、130、140、150、160 nmol·L。每個皿接種相同數(shù)量、生長狀態(tài)近似的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度為2 000 lx，每日光照16 h，培養(yǎng)溫度為(26 ± 1)℃。培養(yǎng)1 周后觀察愈傷組織生長情況?？剐匝可囵B(yǎng)基：1/2MS + 0.1 mg·LNAA。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基中補(bǔ)加30 g·L蔗糖和8 g·L瓊脂，生根培養(yǎng)基中補(bǔ)加30 g·L蔗糖和6 g·L瓊脂，各培養(yǎng)基pH均為5.8。

基因槍微彈的制備參照Bio-Rad PDS-1000He使用說明書，根據(jù)程義琳等(2013)的方法，略有改動。設(shè)計基因槍轟擊實(shí)驗(yàn)流程：稱取8 mg金粉置于1.5 mL EP管中；加入1 mL無水乙醇，漩渦震蕩3～5 min，10 000 r·min離心1 min，棄上清液(重復(fù)3次)；加入1 mL無菌水，震蕩1 min；加入133 μL無菌水，儲存在-20 ℃待用；加入13.3 μL嵌合體震蕩2～3 s；加入133 μL 2.5 mol·LCaCl震蕩2～3 s；加入53.3 μL 0.1 mol·Lspermidine，震蕩2～3 s；在冰上靜置10 min，10 000 r·min離心10～20 s，棄上清液；加入500 μL無水乙醇，沖洗2次，離心10 s，棄上清液；加入160 μL無水乙醇，均勻后，4 ℃?zhèn)溆?每次使用10 μL)。

基因槍介導(dǎo)的RNA/DNA導(dǎo)入煙草愈傷組織，參照Kochevenko和Willmitzer(2003)、程義琳等(2013)的方法，略有改動。具體操作：打開超凈臺，用70%乙醇擦拭超凈臺內(nèi)部與基因槍的表面及基因槍內(nèi)部；打開紫外燈，滅菌30 min，滅菌后吹風(fēng)20 min；易裂片、微彈載體及阻攔網(wǎng)置于70%乙醇10 min，放在無菌濾紙上自然晾干；打開氦氣瓶，將壓力調(diào)制1 100 psi；將易裂片、微彈載體及阻攔網(wǎng)安裝并固定在基因槍真空室，將帶有煙草愈傷組織的培養(yǎng)皿放在托盤上，調(diào)節(jié)轟擊距離為9 cm，關(guān)閉基因槍門，打開電源及真空泵；按下真空鍵“VAC”，當(dāng)真空表讀數(shù)為25 inHg時，按維持鍵“Hold”；按下“Fire”鍵，轟擊結(jié)束，按下“通氣鍵”至真空表讀數(shù)為零。打開基因槍門，取出培養(yǎng)皿，蓋好蓋子用封口膜封好，轉(zhuǎn)入組培室，暗恢復(fù)2 d后，氯磺隆篩選培養(yǎng)，溫度為(26 ± 1)℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時間為 16 h。共做12批次，每批次接種25皿，每皿接種30～40個愈傷組織(d=0.5 cm)，共計9 500～10 000個愈傷組織塊。

1.2.5 抗性分化植株ALS酶活的檢測 參照陳以峰等(1998)的提取方法，取移栽后3周的野生型煙草品種‘K326’葉片1 g，加入提取介質(zhì)(磷酸緩沖液A)1 mL，勻漿，2 500 r·min離心20 min，取上清液即為粗酶液；取0.5 mL反應(yīng)介質(zhì)(磷酸緩沖液B)，加入不同濃度的氯磺隆，這里設(shè)氯磺隆濃度梯度為0～500 nmol·L；加入30 μL粗酶液，總體積0.9 mL，蒸餾水補(bǔ)齊，37 ℃溫育1 h，加入50 μL 3 mol·L的HSO中止反應(yīng)；依次加入0.5 mL 0.83%甲萘酚和0.5 mL肌酸，60 ℃溫育15 min，將溶液于2 000 r·min離心10 min，取上清液于分光光度計530 nm比色。ALS活性直接用A530 nm值來表示。以野生型煙草品種‘K326’為對照，測定抗性植株的ALS酶活。

1.2.6 抗性分化植株突變位點(diǎn)驗(yàn)證 根據(jù)煙草品種‘K326’的基因突變位點(diǎn)，選擇跨該區(qū)段的引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行測序，分析擬突變位點(diǎn)的變化情況，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增、連接及測序參照1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草品種‘K326’的ALS基因克隆

以煙草品種‘K326’基因?yàn)槟０?，利用引物對SuRA F/SuRA R和SuRB F/SuRB R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增得到一條長度約為2 000 bp的條帶，且擴(kuò)增條帶清晰明亮。將該P(yáng)CR產(chǎn)物分別膠回收后以pGEM-T Easy Vector進(jìn)行連接，連接后的質(zhì)粒載體導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌株篩選陽性菌落，陽性菌落送至北京諾賽公司進(jìn)行測序。測序拼接結(jié)果表明，以SuRA F/SuRA R引物擴(kuò)增到序列長度為2 004 bp的基因，命名為‘ K326’，而以SuRB F/SuRB R擴(kuò)增到序列長度為2 010 bp的基因，命名為‘ K326’(圖2)。

圖 1 基因槍轟擊實(shí)驗(yàn)?zāi)M流程圖Fig. 1 Flow chart of simulation by gene gun bombardment experiment

A. ‘K326’的ALS基因PCR擴(kuò)增(M代表DNA 2 000 bp標(biāo)記; A1-A3均代表SuRA F/SuRA R擴(kuò)增產(chǎn)物; B1-B3均代表SuRB F/SuRB R擴(kuò)增產(chǎn)物)。B-C. ‘K326’ALS SuRA和‘K326’ALS SuRB測序結(jié)果。A. PCR amplification of ‘K326’ALS gene ( M represents 2 000 bp Marker; A1-A3 represent SuRA F/SuRA R amplification; B1-B3 represent SuRB F/SuRB R amplification). B-C. The product sequencing of ‘K326’ ALS SuRA and ‘K326’ ALS SuRB.圖 2 煙草品種‘K326’的ALS基因擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物測序Fig. 2 Amplification of Nicotiana tabacum ‘K326’ALS gene and sequencing of PCR products

2.2 RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合體設(shè)計

參照Kochevenko和Willmitzer(2003)的方法，結(jié)合‘K326’和‘K326’基因保守序列的比對，設(shè)計以‘K326’基因編碼區(qū)第588位核苷酸由胞嘧啶(cytosine，C)突變?yōu)橄汆堰?adenine，A)的顛換，第1719位核苷酸由鳥嘌呤(guanine，G)突變?yōu)樾叵汆奏?thymine，T)的顛換。針對編碼區(qū)核苷酸第588位點(diǎn)、 1719位點(diǎn)設(shè)計突變堿基的嵌合體分別命名為Chl-588和Chl-1719(圖3)。

大寫字母為DNA殘基; 小寫字母為2′-O-RNA殘基; 框內(nèi)字母代表突變位點(diǎn)。Capital letters represent DNA residues; Lowercase letters represent 2′-O-RNA residues; Letters in box represent the mutation sites.圖 3 嵌合體RNA/DNA寡聚核苷酸Fig. 3 Chimeric RNA/DNA oligonucleotide

2.3 煙草品種‘K326’愈傷組織誘導(dǎo)及敏感性分析

通過優(yōu)化的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基獲得了嫩綠色至淡黃色、結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織，可用于后續(xù)氯磺隆敏感試驗(yàn)和抗性芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。煙草品種‘K326’愈傷組織形成后，接種于含有不同濃度氯磺隆的篩選培養(yǎng)基中生長1周，愈傷組織的顏色從低濃度到高濃度分組顏色由綠色變黃直至黑色(圖4)。

A. 煙草愈傷誘導(dǎo)及分化; B. 愈傷組織對不同濃度氯磺隆敏感性響應(yīng) (A-H分別為90、100、110、120、130、140、150、160 nmol·L-1氯磺隆)。A. Callus induction and differentiation in tobacco; B. Sensitively response of callus to different concentrations of chlorsulfonon ( A-H represent the concentration of chlorsulfonon 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 nmol·L-1, respectively).圖 4 煙草品種‘K326’愈傷組織誘導(dǎo)及氯磺隆敏感性分析Fig. 4 Callus induction of tobacco‘K326’ and sensitivity analysis of chlorsulfuron

在氯磺隆濃度為90、100 nmol·L時，愈傷組織為綠色，生長狀態(tài)良好；在氯磺隆濃度為110、120、130、140 nmol·L時，愈傷組織顏色為黃色且顏色依次變暗；當(dāng)氯磺隆濃度達(dá)150 nmol·L時，愈傷組織顏色呈棕色，且不繼續(xù)生長；在氯磺隆濃度達(dá)160 nmol·L時，愈傷組織呈黃黑色，逐漸發(fā)生褐化現(xiàn)象最后死亡。因此，本研究選擇氯磺隆濃度150 nmol·L作為篩選的臨界濃度。

2.4 基因槍轟擊處理及抗性煙苗獲得

參照程義琳等(2013)的方法，結(jié)合耿立召等(2005)和宮本賀等(2010)的方法，用包裹金顆粒的RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合體Chl-588和Chl-1719以9 cm的轟擊距離、25 inHg的轟擊壓強(qiáng)對煙草品種‘K326’愈傷組織進(jìn)行基因槍轟擊處理。轟擊后的愈傷組織經(jīng)過恢復(fù)培養(yǎng)，氯磺隆篩選分化培養(yǎng)及抗性芽生根培養(yǎng)獲得具有氯磺隆抗性的煙草植株22株(圖5)。

A. 基因槍轟擊后的愈傷組織; B. 在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織; C. 篩選出抗性芽; D. 抗性芽生根培養(yǎng); E. 獲得的抗性苗。A. Callus after gene gun bombardment; B. Callus cultured on screening medium; C. Screening resistant buds; D. Root cultivation with resistant buds; E. Resistant plants obtained.圖 5 煙草品種‘K326’基因槍遺傳轉(zhuǎn)化體系Fig. 5 Process of gene gun gemetic transformed tobacco ‘K326’

2.5 抗性煙苗的ALS酶活性測定

通過對野生型煙草品種‘K326’的ALS酶活性進(jìn)行不同濃度氯磺隆敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，在氯磺隆濃度為300～500 μmol·L時， ALS酶活性保持最低，在小于300 μmol·L時，隨著氯磺隆濃度逐漸降低，ALS酶活性逐漸增強(qiáng)，于是選取310 μmol·L的氯磺隆作為檢測ALS酶活性的標(biāo)準(zhǔn)?？剐灾仓昱c野生型植株的ALS酶活性檢測結(jié)果顯示，在抗性植株中有8株(Chl-3、Chl-5、Chl-8、Chl-11、Chl-12、Chl-18、Chl-20、Chl-22)的ALS酶活性明顯高于野生型的(圖6)。因此，推測這8株定點(diǎn)誘變成功的可能性較大。

圖 6 氯磺隆對抗性植株和野生型植株的ALS酶活影響Fig. 6 Effects of chlorsulfuron on ALS enzyme activity in resistance and wild-type plants

2.6 抗性煙苗ALS基因突變區(qū)序列擴(kuò)增及測序

利用特異引物，對‘K326’中588位點(diǎn)的保守區(qū)及1719位點(diǎn)的保守區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物直接進(jìn)行測序，擴(kuò)增產(chǎn)物無雜帶(圖7)，在上述22個抗性植株中檢測到2株發(fā)生了特定位點(diǎn)的突變，命名為突變株系f11和b18，前者在588位點(diǎn)發(fā)生了C→A的突變，后者在1719位點(diǎn)發(fā)生了G→T的突變(圖8)。

M. DNA 2 000 bp標(biāo)記; f1-f9. 擴(kuò)增含588位點(diǎn)區(qū)域; b1-b9. 擴(kuò)增含1719位點(diǎn)區(qū)域。M. DNA 2 000 bp Marker; f1-f9. Amplification with segment containing 588 site; b1-b9. Amplification with segment containing 1719 site. 圖 7 含突變位點(diǎn)區(qū)段PCR擴(kuò)增Fig. 7 PCR amplification with segment containing mutation sites

Chl. 抗性植株的測序結(jié)果； WT. 野生型的測序結(jié)果。Chl. Sequencing result of resistant plants; WT. Sequencing result of wild type plants. 圖 8 含突變位點(diǎn)區(qū)段測序Fig. 8 Segment sequencing with mutation site

3 討論與結(jié)論

利用生物學(xué)手段實(shí)現(xiàn)植物體中關(guān)鍵代謝基因的定點(diǎn)突變，能提高植物對除草劑的敏感性，從而提高突變植株對除草劑的抗性，但效率較高的基因定點(diǎn)編輯生物學(xué)手段CRISPR/Cas及TALEN技術(shù)，在操作的過程中引入了外源基因 (Ishino et al., 1987; Michno et al., 2020)。因此，在轉(zhuǎn)基因作物嚴(yán)格管制的今天難以廣泛推廣種植。OMM技術(shù)理論上不涉及轉(zhuǎn)基因，該技術(shù)所得新種質(zhì)，在種植領(lǐng)域上有其得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。

煙草品種‘K326’基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該品種基因序列全部為編碼區(qū)，無內(nèi)含子序列，從起始密碼子至終止子序列完整，而NCBI報道的普通煙草品種與‘K326’品種的基因存在一定差別(Keeler et al., 1993)。NCBI中煙草基因序列長度為2 004 bp，與‘K326’基因序列長度一致；基因序列長度為 1 995 bp，而‘K326’長度為2 010 bp，推測是由品種之間的差異性所致。‘K326’基因與NCBI報道的煙草品種基因盡管序列長度一致，但存在一個堿基的區(qū)別，即煙草品種‘K326’基因編碼區(qū)序列的第831位發(fā)生了A到G的簡并突變，氨基酸密碼子由UUA變成UUG，然而都編碼氨基酸Leu，為簡并突變，經(jīng)過多次PCR和重復(fù)測序證實(shí)結(jié)果正確無誤，證實(shí)這一突變?yōu)闊煵萜贩N‘K326’本身的差異性。根據(jù)‘K326’和‘K326’的保守區(qū)，結(jié)合Beethan等(1999)、Kochevenko和Willmitzer(2003)的報道，設(shè)計了用于‘K326’定點(diǎn)突變的RNA/DNA。

由于Kochevenko和Willmitzer(2003)研究的煙草品種基因并非‘K326’，因此在報道位點(diǎn)上存在位置偏離。為了解決這個問題實(shí)驗(yàn)中找到與其完全配對的目標(biāo)序列，設(shè)計突變位點(diǎn)，命名為Chl-588和Chl-1719。在寡聚核苷酸嵌合體設(shè)計過程中，為避免嵌合體的不穩(wěn)定，對片段進(jìn)行甲基化保護(hù)。Yoon等(1996)、Alexeev等(2000)和Bartlett等(2000)的研究發(fā)現(xiàn)，RNA/DNA寡聚核苷酸鏈自身互補(bǔ)形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在這種雙鏈結(jié)構(gòu)中，2條互補(bǔ)雙鏈的區(qū)別非常明顯，其中一條嵌合體鏈?zhǔn)怯? bp的DNA片段及分別位于該DNA片段兩邊的10 bp的RNA區(qū)域組成，而另一條鏈全是由DNA構(gòu)成，利用載體的特殊結(jié)構(gòu)(兩組胸腺嘧啶脫氧核苷酸連接互補(bǔ)的兩條鏈，在3′末端的“GC”帽子結(jié)構(gòu)及2′-O-甲基RNA殘基)，使其在細(xì)胞中具有較好的穩(wěn)定性。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計時采用同樣的方法保證在轉(zhuǎn)化過程中的穩(wěn)定性。

本研究利用基因槍轟擊法將定點(diǎn)誘變的RNA/DNA寡聚核苷酸嵌合體Chl-588和Chl-1719轟擊煙草品種‘K326’愈傷組織，定點(diǎn)突變煙草基因，以期得到具有氯磺隆抗性的煙草品種‘K326’植株。耿立召等(2005)提出轟擊距離是基因槍轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵因素，認(rèn)為基因槍轟擊煙草的轟擊距離為9 cm。本研究中，探索了基因槍轟擊煙草品種‘K326’愈傷組織的轟擊距離和轟擊壓強(qiáng)，結(jié)果得出的轟擊煙草品種‘K326’愈傷組織的最佳距離與蘇寧等(2002)的研究結(jié)果一致，這說明在煙草基因槍轟擊實(shí)驗(yàn)中，轟擊條件在不同品種之間差別不大。在氯磺隆篩選過程中，假陽性明顯，分化培養(yǎng)基中篩選出的芽在生根培養(yǎng)時大量死亡，本研究認(rèn)為可能與愈傷組織在含有氯磺隆的培養(yǎng)基中多次繼代培養(yǎng)造成的，多次繼代培養(yǎng)后使愈傷組織表現(xiàn)了對氯磺隆抗性的假陽性，這一結(jié)論與李學(xué)寶和毛慧珠(1999)認(rèn)為的多次繼代培養(yǎng)對抗生素產(chǎn)生抗性基本一致?？剐灾仓闍LS酶活性檢測結(jié)果表明，部分抗性植株的ALS酶活性高于野生型，可以初步說明抗性植株目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生了堿基突變與氨基酸發(fā)生了突變，具體要看測序的結(jié)果。

通過對抗性植株基因測序，目標(biāo)位點(diǎn)測序結(jié)果表明，在目標(biāo)位點(diǎn)僅有2株抗性植株發(fā)生了定點(diǎn)突變，即發(fā)生588位點(diǎn)C到A的突變和1719位點(diǎn)由G到T的突變。但是，由于多數(shù)抗性植株并未出現(xiàn)定點(diǎn)突變，因此推測實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在如下可能：(1)煙草染色體為異源四倍體，基因存在2個拷貝(Kochevenko & Willmitzer, 2003)，且2個拷貝之間存在一定程度的差異，在基因擴(kuò)增及RNA/DNA嵌合體定點(diǎn)誘變上帶來一定難度，或是因四倍體在克隆測序時送出的克隆不是突變的那一個拷貝；(2)RNA/DNA嵌合體誘變了其他位點(diǎn)使煙草產(chǎn)生除草劑抗性，煙草AHAS序列的W464位點(diǎn)突變后可以產(chǎn)生抗性，引起植株具有氯磺隆抗性的原因需要進(jìn)一步去驗(yàn)證；(3)所得誘變植株假陽性概率較高，成功突變的植株較少，Beethan等(1999)、Kochevenko和Willmitzer (2003)的研究也都報道了相似的結(jié)果。目前，OMM法的定點(diǎn)誘變在煙草愈傷的誘變條件還處于初步探索階段。當(dāng)OMM技術(shù)與工程核酸酶TALENs或CRISPR/Cas9一起使用時，觀察到的精確無痕基因組編輯的頻率顯著增加(Sauer et al., 2016)。但是，在編輯的過程中引入外源基因，會使OMM獨(dú)特的不涉及轉(zhuǎn)基因過程的技術(shù)優(yōu)勢蕩然無存，所得作物無法大田推廣。后期，對OMM技術(shù)的優(yōu)化，以及T1、T2代的檢測篩選試驗(yàn)還在不斷地探索完善過程中。