CRISPR/Cas9技術(shù)在乙肝治療中的研究與進(jìn)展

彭海航，靳春鵬

·綜述·

CRISPR/Cas9技術(shù)在乙肝治療中的研究與進(jìn)展

彭海航*，靳春鵬*

100160 北京，國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心

慢性乙型肝炎（CHB）是由乙型肝炎病毒（HBV）持續(xù)感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。CHB 包括乙型肝炎病毒 e 抗原（HBeAg）陽性的 CHB 患者及 HBeAg 陰性的 CHB 患者。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，我國原發(fā)性肝癌（PLC）患者乙肝表面抗原 HBsAg 陽性率高達(dá) 90%，而 PLC 主要在肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生，提示HBV 長期持續(xù)感染最終可導(dǎo)致肝硬化及 PLC[1]。

病毒性肝炎每年導(dǎo)致多達(dá) 134 萬人死亡，并且仍然是肝硬化和肝細(xì)胞癌發(fā)病率和死亡率的主要原因[2]。乙型肝炎病毒（HBV）感染對全球健康問題的影響很大，估計有 2.57 億人長期感染，特別是中國，擁有約 1.2 億乙肝病毒攜帶者。雖然在疫苗和抗病毒藥物開發(fā)方面取得了有價值的進(jìn)展，全球預(yù)防性疫苗接種計劃降低了 5 歲以下兒童的 HBV 流行率，但在非流行的非洲國家覆蓋率不足，意味著一些國家的患病率仍然很高[2]。

目前，批準(zhǔn)的治療劑包括干擾素α、聚乙二醇化干擾素 α、拉米夫定、替比夫定、腺病毒二倍體、恩替卡韋、替諾福韋地索普西富馬酸鹽和替諾福韋艾拉酚胺。這些治療劑有時會因施用周期長，患者選擇的種類以及是否有利于同時或順序給藥的觀點相互矛盾而有所不同[3]。但是仍然沒有可靠的治療 HBV 感染的方法。而且治療的關(guān)鍵限制是它們無法可靠地實現(xiàn)精準(zhǔn)的病毒學(xué)治療[4]。

隨著基因打靶技術(shù)的出現(xiàn)，使得精準(zhǔn)的病毒學(xué)治療成為了可能。經(jīng)典的基因打靶技術(shù)是基于 DNA 同源重組原理，用設(shè)計的同源基因片段替代靶基因片段，但是這種打靶技術(shù)在體細(xì)胞中的成功率極低。之后發(fā)展出的 ZFN（zinc finger nucleases）、TALEN（transcription activator-like effector nucleases）等技術(shù)，是基于 DNA 雙鏈斷裂（double strand broken，DSB）修復(fù)的非同源末端連接機(jī)制（non homologous end-joining，NHEJ），通過蛋白-DNA 相互作用識別特定 DNA 序列，在修復(fù)過程中引入外源 DNA 從而引起移碼突變，但是此類技術(shù)的局限性在于構(gòu)建融合蛋白的工作量大、成本高。2013 年，、、等雜志幾乎同時報道了一種新型的基因組編輯手段—— CRISPR/Cas9 技術(shù)（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated system）。從表 1 的結(jié)果可以看出[5]，與傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù) ZFN 和 TALEN 相比，該技術(shù)具有良好的靶向性、構(gòu)建簡單、可同時操作多條基因等優(yōu)點，并迅速成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的前沿?zé)狳c，引發(fā)了新一輪的基因治療研究熱潮。

特別是針對乙肝病毒 cccDNA 設(shè)計的三種類型的打靶方式，通過比較可以發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9 技術(shù)具有極高的剪切效率，因此，采用 CRISPR/Cas9 技術(shù)進(jìn)行 HBV 的打靶治療變成了重要的研究方向。

表1 三種基因編輯技術(shù)比較

本文整理了最新文獻(xiàn)報道，從 CRISPR/Cas9 的技術(shù)原理、研究進(jìn)展、用于 HBV 基因治療的可行性及建議等多個方面進(jìn)行綜述。

1 CRISPR/Cas9 技術(shù)的歷程

聚集的規(guī)則間隔短回文重復(fù)（CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白 9（Cas9）系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的防御機(jī)制[6-10]。CRISPR 基因座由小的獨特序列組成，稱為“間隔區(qū)”，它們是整合到稱為“CRISPR 重復(fù)序列”的高度保守的重復(fù) DNA 序列的延伸中。這些遺傳元件首先在大腸桿菌的堿性磷酸酶（iap）基因的 3' 末端區(qū)域中被鑒定，其包含一組 29 個核苷酸重復(fù)序列和 32 個隨后序列，發(fā)現(xiàn)超過40%的細(xì)菌和 90%的古細(xì)菌在其基因組中含有這些短的規(guī)則間隔重復(fù)[11]。間隔區(qū)的序列是宿主基因組外來源的，比如來源于噬菌體、病毒和質(zhì)粒。將這些外源 DNA 整合到宿主基因組中可以抵抗入侵病原體對細(xì)菌和古細(xì)菌的抵抗。由這些基因編碼的 54 種 Cas 蛋白通常攜帶與核酸酶、解旋酶、聚合酶和核苷酸結(jié)合蛋白相似的功能結(jié)構(gòu)域[8]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以跨越不同的細(xì)菌屬轉(zhuǎn)移，以賦予對侵入性核酸的異源抗性[12]。

在自然條件下，Cas9 是無效的，只有當(dāng) Cas9 與 sgRNA 結(jié)合時才有效。Cas9 和 sgRNA 形成復(fù)合體之后，然后通過識別 PAM 及搜尋 PAM 附近的目標(biāo) DNA 序列，然后 sgRNA 與靶標(biāo)結(jié)合序列結(jié)合后，靶序列鏈被HNH 切割并且靶序列的相反鏈被 Ruv C 切割[13-16]。

從圖 1 可以看出，當(dāng) Cas9 的 HNH 和 Ruv C 對 DNA 切割后形成 DSB 時，則形成 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)激活 DSB 的修復(fù)機(jī)制[16]。一種是同源定向修復(fù)（HDR），另外一種是非同源末端連接（NHEJ）。HDR 是一種無錯誤的方法，它只加入同源模板，常用于植物中。與 NHEJ 相比，它更復(fù)雜[17-19]。雖然 NHEJ 是一種容易出錯的方法，但它能夠插入或刪除特定的基因序列和引起 Indels 突變。因此，它通常用于基因敲除[17, 20]。

從目前的實踐中證明，sgRNA 和 Cas9 蛋白足以誘導(dǎo)多種系統(tǒng)中的靶 DNA 結(jié)合和切割，包括培養(yǎng)的人類細(xì)胞、大鼠、小鼠、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚、果蠅、細(xì)菌、擬南芥等[21-28]。這種雙組分系統(tǒng)可以通過靶向任何具有 PAM 形式的 DNA 序列來使用，使其成為可應(yīng)用于各種場景的通用工具。

2 CRISPR/Cas9 技術(shù)在乙肝治療中的應(yīng)用

在采用基因編輯技術(shù)針對乙肝病毒 HBV 治療的過程中，一般有兩種形式，即直接靶向 HBV DNA 中的靶點來抑制 cccDNA，另外一種形式是通過調(diào)節(jié)其他因子來抑制 cccDNA 的復(fù)制。下面分別針對這兩種情形進(jìn)行分析。

栽后第1年的幼樹根系不發(fā)達(dá)，加之定植穴內(nèi)已施入一定肥料，為防止傷根燒根可不施入肥料。第2年起一定要逐年施肥。重視擴(kuò)穴施肥提高建園質(zhì)量，為果園優(yōu)質(zhì)高效打好基礎(chǔ)。

2.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)在靶向 HBV DNA 靶點中的應(yīng)用

目前，已經(jīng)證實 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以在細(xì)胞層面以及小鼠動物模型層面有效地破壞 HBV 基因組模板，有的可以抑制或降低 cccDNA 的量，具體總結(jié)見表 2。

要徹底清除乙肝患者體內(nèi)的 HBV，尋求從根源上清除 cccDNA 是達(dá)到治愈乙肝的有效路徑。Liu 等[29]基于金黃葡萄球菌（Sa）的 Cas9 系統(tǒng)設(shè)計了5 個針對不同靶標(biāo)基因的 gRNA，其中 3 種被證明是有效的，其中靶向 preC/C 靶點的 Sa3 gRNA 效果最好。該SaCas9 系統(tǒng)顯著降低 Huh7、HepG2.2.15 和 HepAD38 細(xì)胞中的 HBV 抗原表達(dá)以及 pgRNA 和 cccDNA 水平。這些細(xì)胞系中 gRNA/SaCas9 的雙重表達(dá)導(dǎo)致更有效的 HBV 基因組切割。在小鼠模型中，流體動力學(xué)注射 gRNA/SaCas9 質(zhì)粒導(dǎo)致 HBV 蛋白表達(dá)水平顯著降低。另外還使用 AAV 載體將 SaCas9 系統(tǒng)遞送到具有持續(xù) HBV 復(fù)制的小鼠中，當(dāng)注射較高滴度的 AAV 時，觀察到乙型肝炎表面抗原（HBsAg），HBV DNA 和 pgRNA 水平降低。

Li 等[30]首次利用 VIII 型腺相關(guān)病毒（AAV8）介導(dǎo)小型化CRISPR-SaCas9 系統(tǒng)通過剪切HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的 HBV DNA，高效抑制了小鼠血清及肝組織中的乙肝病毒標(biāo)志物。具體的，利用篩選出的靶向 HBV 核心區(qū)的小型化 CRISPR-SaCas9 系統(tǒng)，在腺相關(guān)病毒（AAV8）的介導(dǎo)下通過靜脈注射入 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，在注射 2 周后 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠血清中的乙肝標(biāo)志物開始下降，在注射1 個月后，相比注射 AAV 空載體的對照組，實驗組小鼠血清中的 HBV DNA 的含量降低了 94.24%、HBsAg含量降低了 62.96%、HBeAg含量降低了 65.18%（< 0.05，n = 7）。此外，研究人員還通過深度測序確認(rèn)了 CRISPR-SaCas9 系統(tǒng)對 HBV DNA 核心區(qū)域的高效剪切，同時未檢出脫靶效應(yīng)，進(jìn)一步證實了 CRISPR/Cas9 技術(shù)在乙肝基因治療中的潛力。

圖 1 CRISPR/Cas9 工作原理圖

表 2 CRISPR/Cas9 靶向 HBV 的重點研究匯總表

注：N.D. 代表未描述。

Lin 等[31]報道了 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可用于在體外和體內(nèi)破壞 HBV 基因組。當(dāng) Cas9 和 HBV 表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到 Huh7 肝細(xì)胞來源的癌細(xì)胞中時，HBV 特異性 Cas9/sgRNA 組合能夠顯著降低 HBV 核心和 HBsAg 的產(chǎn)生。此外，該系統(tǒng)可有效降低 HBV 流體動力學(xué)-小鼠模型中肝內(nèi) HBV 表達(dá)載體的水平和 HBsAg 的血清水平。通過設(shè)計針對 HBV S 的第 30 個密碼子編碼 HBV 表面抗原（HBsAg）的 gRNA，可以完全停止 HBsAg 表達(dá)并減少病毒粒子的分泌，這也說明完全停止 HBsAg 的表達(dá)是可行的[45]。

Kennedy 等[34]使用 Cas9 和 HBV 特異性 gRNA 的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，證明慢性 HBV 感染（HepAD38 細(xì)胞）和新生感染（HepaRG 細(xì)胞）的體外模型中 HBV DNA 產(chǎn)生和cccDNA 積累的有效抑制情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)將總 HBV 病毒 DNA 水平抑制高達(dá) 1000 倍，cccDNA 水平高達(dá) 10 倍。Seeger 和 Sohn[32]證明，在?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）表達(dá) HepG2 細(xì)胞時，HBV 特異性指導(dǎo) RNA 可以將 HBV 感染抑制高達(dá) 8 倍。在另一項研究中，Liu 等[36]報道 HBV 特異性 gRNA/Cas9 可以抑制體外和體內(nèi)不同基因型 HBV 的復(fù)制，這是由于病毒 DNA 模板的清除和易錯修復(fù)。

Zhen 等[39]設(shè)計了 gRNA 靶向 HBV 表面蛋白的 ORF，在體外 HepG2.2.15 細(xì)胞模型和體內(nèi)流體動力學(xué)-小鼠模型中通過CRISPR/Cas9 處理降低培養(yǎng)物上清液和小鼠血清中的 HBsAg 水平。另外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還可有效抑制小鼠肝臟中 HBV DNA 水平和 HBsAg 表達(dá)，例如，Dong 等[33]表明 CRISPR/Cas 系統(tǒng)可用于抑制preC/C DNA 轉(zhuǎn)染的 Huh7 細(xì)胞和攜帶 HBV cccDNA 的新小鼠模型中的細(xì)胞內(nèi) cccDNA 和病毒復(fù)制。Ramanan 等[37]研究表明，靶向 HBV 保守區(qū)的 sgRNA 在體外和體內(nèi)都會引起病毒復(fù)制的強(qiáng)烈抑制，并將這種抗病毒活性擴(kuò)展到從患者體內(nèi)分離的病毒。Wang 等[38]將雙重 gRNA 應(yīng)用于引導(dǎo)的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，以使體外基因型 A-D 的 HBV 失活。

在最近的 HBV 和 CRISPR 研究中，Karimova 等[35]證明改進(jìn)的 CRISPR/Cas9 切口酶系統(tǒng)可以破壞HeLa和 HEK293 細(xì)胞系中的 HBV cccDNA 和整合的 HBV序列。

另外，一些研究還聲稱 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以破壞或滅活 HBVcccDNA 和整合的 HBV 基因組[40, 44, 46]。HBV 目前從基因 A 型到基因 I 型，至少有 9 種 HBV 基因型已被確定[48]，可見 HBV 基因組序列高度多樣化，因此設(shè)計廣譜治療的 CRISPR 系統(tǒng)也是研究的方向。比如具有多重 gRNA 的 CRISPR/Cas9 可以同時進(jìn)行切割多個HBV 基因組位點，從而提高 HBV 基因組失活和消耗的效率[37-38, 41, 49]。通過帶有八個多重 gRNA 表達(dá)單元的腺病毒載體（AdV）不僅可以提供多個基因敲除，還可以解決基因組編輯治療中的異質(zhì)靶標(biāo)和逃逸突變體的問題[50]。然而，只有少數(shù)研究檢查了脫靶效應(yīng)通過基因組切割檢測測定或潛在脫靶的深度測序來測定 HBV 特異性 gRNA 位點[37, 40-41, 44]。結(jié)果表明，深度測序確實比基因組切割更敏感，檢測分析可以鑒定 Cas9 核酸酶與 HBV 特異性引起的脫靶效應(yīng) gRNAs。兩項研究還表明，通過利用可以提高 HBV 基因組切割的特異性 Cas9 切口酶和具有靶向所需 HBV 序列的一對 gRNA，不僅破壞了報告細(xì)胞系中的游離型 cccDNA 和染色體整合的 HBV 靶位點，而且破壞了慢性和從頭感染的肝癌細(xì)胞系中的 HBV 復(fù)制，盡管Cas9 切口酶顯示出降低裂解功效[35, 41]?？偟膩碚f，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)能夠特異而有效破壞 HBV 基因組而沒有明顯的細(xì)胞毒性。此外，通過靶向 S- 或 X-ORF，成功抑制慢性和新型感染的人肝癌細(xì)胞系中的 HBsAg 表達(dá)。通過 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向 HBx 可有效下調(diào) HBx 基因表達(dá)，降低 HBsAg 和 HBV cccDNA 的表達(dá)水平[47]。

總之，這些研究證明了 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可在體外和體內(nèi)破壞 HBV cccDNA，并顯示了CRISPR/Cas9 在急性和慢性 HBV 感染中的治療潛力。

2.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)通過調(diào)節(jié)其他因子在抑制 HBV 中的應(yīng)用

Liu 等[52]認(rèn)為 p53 突變和 PTEN 表達(dá)改變是HBV感染相關(guān)肝細(xì)胞癌（HCC）中兩種最常見的遺傳事件。為了證實 p53 和 PTEN 體細(xì)胞突變在 HCC 發(fā)展中的致病作用，其通過流體動力學(xué)尾靜脈注射建立了 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的體細(xì)胞基因破壞，允許在成體 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠中同時體內(nèi)靶向 p53 和 PTEN。在注射后 4 個月就導(dǎo)致肉眼可見的肝臟腫瘤，并且大多數(shù)腫瘤包含 p53 和 PTEN 功能喪失改變。這項研究表明，CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 p53 和 PTEN體細(xì)胞突變加速了成人 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠的肝癌發(fā)生。

Qi 等[53]證明，肝細(xì)胞的乙型肝炎病毒（HBV）感染開始于與其細(xì)胞受體?；悄懰徕c協(xié)同轉(zhuǎn)運多肽（NTCP）結(jié)合，然后病毒核衣殼內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中。核衣殼中的病毒rcDNA 基因組被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中并轉(zhuǎn)化為cccDNA，以用作當(dāng)前抗病毒療法難以控制的病毒持久性儲庫。已經(jīng)推測宿主 DNA 修復(fù)酶催化 rcDNA 向 cccDNA 的轉(zhuǎn)化，然而，填充 rcDNA 正鏈中的缺口的 DNA 聚合酶仍有待確定。通過靶向遺傳篩選與化學(xué)抑制相結(jié)合，以確定負(fù)責(zé) cccDNA 形成的細(xì)胞DNA 聚合酶，并利用衣殼編碼缺陷的重組 HBV 感染 HepG2-NTCP 細(xì)胞，具有與野生型 HBV 相似的效率，以確保 cccDNA 合成完全來自新發(fā) HBV 感染。DNA 聚合酶 κ（POLK），一種在非分裂細(xì)胞中具有最大活性的Y 家族 DNA 聚合酶，在新發(fā) HBV 感染期間實質(zhì)上有助于 cccDNA 的形成。通過 siRNA 敲低或 CRISPR/Cas9 敲除消除 HepG2-NTCP 細(xì)胞中 POLK 的基因表達(dá)抑制 rcDNA 向 cccDNA 的轉(zhuǎn)化，同時通過異位有效地拯救敲除細(xì)胞中的 cccDNA 形成減少，從而導(dǎo)致病毒感染以及 POLK 的表達(dá)。這些研究表明，POLK 是新發(fā) HBV 感染期間 cccDNA 形成所需的關(guān)鍵宿主因子，并表明 POLK 可能是開發(fā)針對 HBV 的抗病毒藥物的潛在靶標(biāo)。

2.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在治療 HBV 中的其他改進(jìn)

在針對 HBV 進(jìn)行 CRISPR 打靶時，除了針對靶標(biāo)的設(shè)計以及靶標(biāo)的選擇之外，針對方法本身也進(jìn)行了系列的改進(jìn)。

Liu 等[54]采用來自金黃色葡萄球菌（Sa）的 Cas9 蛋白，該蛋白比來自化膿性鏈球菌（Sp）的 Cas9 的分子量要小，因此能夠包裝到 AAV 載體中。該SaCas9 系統(tǒng)顯著降低 Huh7、HepG2.2.15 和 HepAD38 細(xì)胞中的 HBV 抗原表達(dá)以及 pgRNA 和 cccDNA 水平。這些細(xì)胞系中 gRNA/SaCas9 的雙重表達(dá)導(dǎo)致更有效的 HBV 基因組切割?？傊?，該 SaCas9 系統(tǒng)準(zhǔn)確有效地靶向 HBV 基因組并在體外和體內(nèi)抑制 HBV復(fù)制。該系統(tǒng)由 AAV 載體遞送，并且可以用作針對慢性 HBV 感染的新型治療策略。為了克服 Cas9 的貨物容量的障礙，一種替代策略是利用兩個 Cas9 片段系統(tǒng)或分裂內(nèi)含子 Cas9 系統(tǒng)，其中一個全功能的 Cas9 蛋白被分裂成兩個無功能的片段，遞送至靶細(xì)胞后，Cas9 的兩個片段通過重組重新發(fā)揮功能，這也是一種克服運輸障礙的有效手段[55]。當(dāng)然，SpG 和 SpRY 對 PAM 的要求最低，分別針對 NGN PAM 和 NRN/NYN PAM 也可作為可選的 Cas 選擇方案用于 HBV 的切割[56]。

研究表明，高效和可觀察的基因組編輯通常需要高滴度的 AAV-SaCas9/gRNA（每只小鼠 > 1011個病毒基因組）[57]。Schiwon 等[58]認(rèn)為高容量腺病毒載體（HCAdVs）是將大 DNA 分子遞送到細(xì)胞中的有力工具。在此，HCAdVs 被設(shè)計為遞送了包含三個 gRNA 的 CRISPR/Cas9核酸酶系統(tǒng)，所述 3 個 gRNA 與hSpCas9 在 pAdV 載體中同時表達(dá)，達(dá)到一步法即可實現(xiàn) 3 個靶標(biāo)一次轉(zhuǎn)化完成靶標(biāo)打靶的操作，并且證明了 cccDNA 拷貝降低以及抗病毒效果。

Wang 等[59]構(gòu)建了由單個 U6 啟動子驅(qū)動的新型 gRNA-microRNA（miRNA）-gRNA 三元盒。通過在兩個 HBV 特異性 gRNA 之間整合的抗 HBV pri-miR31 模擬物，可以通過 Drosha/DGCR8 處理將兩種gRNA 與 gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒的長轉(zhuǎn)錄物分離。結(jié)果顯示，gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒可有效表達(dá)兩種 gRNA 和 miR-HBV。gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒中的 HBV 特異性 gRNA 和 miR-HBV 可在體外和體內(nèi)抑制 HBV 復(fù)制和破壞 HBV 基因組中發(fā)揮協(xié)同作用。最重要的是，與RNA 干擾（RNAi）方法一起，HBV 特異性 gRNA 顯示出對 HBV cccDNA 破壞的有效活性。由于HBV cccDNA 是消除慢性 HBV 感染的障礙，因此 gRNA-miR-HBV-gRNA 三元盒可能是清除 HBV cccDNA 的潛在工具。雖然 CRISPR/Cas 可能會清除 cccDNA，但確保其安全性是應(yīng)用的必要條件。Yan 等[60]用肝臟特異性啟動子替換原始啟動子的重建 CRISPR/SaCas9 系統(tǒng)在體外和體內(nèi)仍能抑制 HBV 復(fù)制。與肝臟相比，SaCas9 在其他器官或組織中的表達(dá)進(jìn)一步降低。這些結(jié)果有助于確保 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的作用僅限于肝臟，有助于臨床應(yīng)用，從而通過非特異性靶向其他器官來降低不良和有害影響的可能性。

Li 等[61]采用 CRISPR/Cas9 技術(shù)完全切除了一個完整的 3175 bp 整合的 HBV DNA 片段，并在穩(wěn)定的 HBV 細(xì)胞系中破壞了 HBV cccDNA。在 HBV 切除的細(xì)胞系中，細(xì)胞內(nèi)的 HBV cccDNA，上清液 HBV DNA、HBsAg 和 HBeAg 保持低于負(fù)臨界值超過 10 個月。此外，通過全基因組測序，分析了脫靶效應(yīng)并排除了細(xì)胞污染。這是第一次在穩(wěn)定的 HBV 細(xì)胞系中完全根除 HBV 感染。這種大片段的切除方法，為 HBV 的治療提供了一種可行的實施策略。

此外，將 CRISPR/Cas9 成分安全有效地遞送到 HBV 感染的肝細(xì)胞的細(xì)胞核中對于 HBV 基因組的體內(nèi)基因編輯至關(guān)重要[62]。CRISPR/Cas9 常用的載體主要是非病毒載體，例如脂質(zhì)或聚合物，具有靈活的載貨能力和臨床應(yīng)用中的高安全性[63]。其中 LNP 已經(jīng)成功用于遞送 CRISPR/Cas9 RNPs[64]并且展示了對 HBV 基因組的顯著編輯[65]。LNP-mRNA 介導(dǎo)的 CRISPR/Cas9 為開發(fā)未來的 CHB 基因療法提供了強(qiáng)有力的支持[66]。近紅外響應(yīng)仿生納米粒子（UCNPs-Cas9@CM），也可以有效地傳遞 Cas9 RNP（即核糖核蛋白復(fù)合物，由化學(xué)合成的 crRNA、tracrRNA及 Cas9 蛋白組成，化學(xué)合成 crRNA 和 tracrRNA 與 Cas9 蛋白混合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可快速實現(xiàn)靶基因的編輯。與傳統(tǒng) Cas9/gRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，基因編輯效率更高，脫靶效應(yīng)更低，且無 DNA 整合的風(fēng)險，是更加理想的基因編輯系統(tǒng)），發(fā)現(xiàn) HBV 感染細(xì)胞中的 HBsAg、HBeAg、HBV pgRNA 和HBV DNA 以及 cccDNA 被抑制，實現(xiàn)對 HBV 治療的有效基因組編輯。這些發(fā)現(xiàn)在 HBV-Tg 小鼠中得到證實，該小鼠沒有表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性和最小的脫靶 DNA 損傷[67]，這也是未來治療的一個重要途徑。

多種治療方式聯(lián)合也是重要的研究方向。Zhen 等[68]通過抗 HBV 與抗 PD-1 聯(lián)合治療抑制 HBV 表達(dá)，顯著提高 HBV 轉(zhuǎn)基因小鼠的存活率。此外，聯(lián)合治療增加了T 細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素，進(jìn)而增強(qiáng)了 Th1 相關(guān)免疫刺激基因的表達(dá)，從而降低了調(diào)節(jié)/抑制免疫基因的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明 HBV 靶向治療與 PD-1 免疫檢查點阻斷聯(lián)合具有很強(qiáng)的協(xié)同作用，從而支持了該聯(lián)合治療策略在 HBV 感染臨床治療中的轉(zhuǎn)化潛力。

4 結(jié)語與展望

CRISPR/Cas9 技術(shù)給人類疾病治療的研究帶來了巨大的便利性、高效性和靈活性，也開啟了精準(zhǔn)醫(yī)療的新篇章，為個體定制化醫(yī)療打下了堅實的基礎(chǔ)。CRISPR/Cas9技術(shù)治療乙肝目前還處于較為早期的研發(fā)階段。但已有少數(shù)公司據(jù)此開始了慢性乙型肝炎根治療法的商業(yè)化開發(fā)。例如 Intellia Therapeutics，由CRISPR 發(fā)現(xiàn)者之一的 JenniferA. Doudna 創(chuàng)立于 2013 年。該公司最新的一次乙肝治療相關(guān)成果公布在其2016 年的年報，顯示其相關(guān)研究還處于細(xì)胞水平。筆者相信在以后必然會有長足的發(fā)展和進(jìn)步。使用基因編輯的方法徹底治愈乙肝，還需要解決以下一些問題：

第一，脫靶現(xiàn)象。需要盡可能降低基因編輯工具的脫靶率，讓其精準(zhǔn)破壞 cccDNA 等病毒核酸而不影響機(jī)體細(xì)胞的正?；蚪M及其他核酸序列。

第二，提高基因編輯系統(tǒng)的體內(nèi)遞送效率。通過優(yōu)化遞送系統(tǒng)，將基因編輯工具準(zhǔn)確高效地遞送到需要編輯的細(xì)胞里。

第三，盡量回避或克服免疫系統(tǒng)對基因編輯的影響。因為這些用于基因編輯及遞送的工具，多是一些外源物質(zhì)，可引起機(jī)體免疫或毒性反應(yīng)。加速好不容易導(dǎo)入體內(nèi)的基因編輯工具的清除，同時給細(xì)胞及機(jī)體組織造成傷害。

第四，提高打靶效率?？梢酝ㄟ^使用多個 gRNA 一起打靶，或者與其他的基因修飾方式比如小干擾 RNA 聯(lián)用，從而獲得更佳的效果。

第五，在 CRISPR 基礎(chǔ)上聯(lián)合其他方式治療。正如在前所述，通過敲除 HBV 基因以及抑制 PD-1 可以有效地提高治療效果。在 CRISPR 靶向治療的基礎(chǔ)上，同時給予其他治療藥物的聯(lián)用，從而提高治療效果，也是重要的研究方向。

由于 CRISPR/Cas9 技術(shù)還未真正應(yīng)用于臨床治療，因此，其安全性與穩(wěn)定性仍需要進(jìn)一步完善，但是不可否認(rèn)， CRISPR/Cas9 系統(tǒng)因其非凡的靈活性和便利性在臨床應(yīng)用中將展現(xiàn)出革命性的潛力[69]，在乙肝治療方面將具有極大的應(yīng)用前景，治愈乙肝也變得不再遙不可及。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.05.007

彭海航，Email：haisunshine@126.com

2022-07-04

*同為第一作者