氨氮脅迫對(duì)金魚抗氧化功能和消化功能的影響

楊金艷 李宇潔 洪慧青 張紅霞 蔡巧巧 劉成榮23

（1.莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100）

（2.福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100）（3.生態(tài)環(huán)境與信息圖譜福建省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100）

魚類的新陳代謝活動(dòng)主要通過呼吸和排泄來進(jìn)行，通過魚的新陳代謝活動(dòng)我們可以了解到魚類的能量需求、抗氧化功能及消化功能等情況。抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛普遍存在于生物體的各個(gè)器官，它們可以通過氧化還原作用體內(nèi)的過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒或者毒性較低的物質(zhì)抑制氧自由基的生成保持體內(nèi)代謝的平衡；消化酶蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶就是將食物分解成人體可以吸收的小分子物質(zhì)，它的主要作用就是分解食物。研究不同氨氮濃度對(duì)金魚抗氧化功能和消化功能的影響。因此研究魚類的呼吸和排泄，對(duì)于了解魚類代謝生理特點(diǎn)和開展魚類養(yǎng)殖均有重要意義。氨氮是魚類蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物，約占魚類氮代謝的60%-80%（Salin et al，1991）。

陳堅(jiān)、夏蘇東等人研究表明，在魚類養(yǎng)殖水體中，氨氮會(huì)大量消耗水體溶氧，影響魚類鰓的氧傳遞和正常的呼吸代謝，延緩魚類生長，對(duì)魚體生理活動(dòng)等造成嚴(yán)重影響甚至導(dǎo)致死亡。水體中氨氮一般以非離子氨（NH3）和離子氨（NH4+）形式存在（Zhang YL，2017），其中NH3會(huì)對(duì)魚類產(chǎn)生毒害作用，能引起魚類食欲降低、組織變形及消化功能下降等現(xiàn)象。

金魚是世界上重要的觀賞用水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，隨著市場(chǎng)的需求，魚類養(yǎng)殖已形成高密度工廠化養(yǎng)殖。然而金魚的養(yǎng)殖對(duì)環(huán)境要求極為嚴(yán)苛，溫度、水的酸堿度及硬度和水溶氧對(duì)金魚的生存都有著極大的影響。

金魚對(duì)氨氮的毒性非常敏感，當(dāng)金魚長時(shí)間在氨氮脅迫下，且若氨氮濃度過高，會(huì)對(duì)魚類正常的攝食、呼吸、運(yùn)動(dòng)、新陳代謝等基本生理生化活動(dòng)產(chǎn)生消極影響，對(duì)魚類產(chǎn)生毒害作用，致其患病甚至死亡，從而影響魚類正常生長發(fā)育（鄭洪武，2020）。但目前尚未見到有關(guān)氨氮脅迫對(duì)金魚的抗氧化功能和消化功能影響的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)初次淺探氨氮脅迫對(duì)金魚部分功能影響，為其健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

材 料：金魚，體長13.91±0.2（cm），體質(zhì)量37.41±0.2（g）。

試劑：PBS緩沖液、Met、NBT、EDTA-Na2、核黃素、生理鹽水、LB培養(yǎng)基、蒸餾水、DNS、NaOH、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、酪素、碳酸鈉、福林試劑、L-酪氨酸、雙氧水、淀粉、麥芽糖、考馬斯亮藍(lán)、90%乙醇、70%乙醇、85%磷酸、牛血清白蛋白、瓊脂、脂肪酶（LPS）測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、胃蛋白酶測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 方法

取100L自來水放于多個(gè)水箱中，并將水箱放置在通風(fēng)處靜置2天后。將金魚放入水中暫養(yǎng)2天，無病害發(fā)生則開始實(shí)驗(yàn)。做1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別配置成氨氮濃度為0mg/L、17.25mg/L、20.36mg/L、24.02mg/L、28.34mg/L、33.44mg/L的溶液，將金魚分裝到不同濃度的NH4Cl溶液中進(jìn)行脅迫。脅迫48h后，分別取出金魚1g的肝胰臟和肌肉放入研缽；加入生理鹽水，研磨成漿液，滴加PBS緩沖液，放于離心機(jī)中離心，取其上層清液制成酶液。測(cè)定各處理組金魚抗氧化酶（SOD、CAT）的活性和MDA含量。繼續(xù)脅迫72小時(shí)后，取出金魚腸道，將內(nèi)容物取出后，把腸道按比例加生理鹽水研磨勻漿并在離心機(jī)中離心，取上清液制成酶液。測(cè)定金魚消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）的活性；將內(nèi)容物稀釋后接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h觀察大腸桿菌、芽孢桿菌、乳酸桿菌菌落數(shù)量情況。

1.2.1 氨氮脅迫后金魚抗氧化酶活性和丙二醛含量的測(cè)定

金魚的超氧化物歧化酶活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；過氧化氫酶活性的測(cè)定方法參照李軍等的方法并稍作改進(jìn)；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定。

1.2.2 氨氮脅迫后金魚消化道相關(guān)酶活性的測(cè)定

金魚脂肪酶活性采用脂肪酶測(cè)定試劑盒測(cè)定；蛋白酶活性采用蛋白酶試劑盒測(cè)定；淀粉酶活性采用DNS比色法測(cè)定。

2．結(jié)果與分析

2.1 氨氮脅迫對(duì)金魚超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

2.1.1 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟中的超氧化物歧化酶的影響

如圖1所示，氨氮濃度為20.36mg/L時(shí)，肝臟組織中的酶活力最低，為20.23±19.72（U/g），差異不顯著（P＞0.05）。氨氮濃度為17.25 mg/L時(shí)，肝臟組織中的酶活力最高，為53.97±10.22（U/g），差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟中SOD活力的影響

2.1.2 氨氮脅迫對(duì)金魚肌肉組織中的超氧化物歧化酶的影響

如圖2所示，當(dāng)氨氮濃度為17.25 mg/L時(shí)，肌肉組織的酶活力最低，為3.78±11.72（U/g），差異不顯著（P＞0.05）。當(dāng)氨氮濃度為28.34 mg/L時(shí)，肌肉組織的酶活力最高，為40.03±12.84（U/g），差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 氨氮脅迫對(duì)金魚肌肉組織中SOD活力的影響

2.2 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟組織中的過氧化氫酶（CAT）活力的影響

2.2.1 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟組織中的過氧化氫酶的影響

由圖3所示，金魚在濃度為20.36 mg/L的NH4Cl溶液中，差異極其顯著（P＜0.01），CAT活力最低，為1.50±0.08（U/g/min）。在NH4Cl濃度為20.36 mg/L之后，隨著氨氮濃度的不斷升高，金魚肝胰臟組織中的CAT的活力逐漸升高，在NH4Cl濃度為33.44 mg/L時(shí)，CAT活力達(dá)到最高，為9.61±0.48（U/g/min），差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟中CAT活力的影響

2.2.2 氨氮脅迫對(duì)金魚肌肉組織中過氧化氫酶活力的影響

由圖4可看出，當(dāng)氨氮濃度為33.44 mg/L時(shí)，CAT活力達(dá)到最低，為0.50±0.03（U/g/min），差異顯著（P＜0.05）?？芍痿~在高氨氮濃度下，其肌肉中的CAT活力逐漸降低，在NH4Cl溶度為0.00 mg/L時(shí)，CAT活力達(dá)到最高，為2.25±0.11（U/g/min）差異顯著（P＜0.05）。

圖4 氨氮脅迫對(duì)金魚肌肉組織中CAT活力的影響

2.3 氨氮脅迫對(duì)金魚丙二醛（MDA）含量的影響

2.3.1 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟組織中丙二醛含量的影響

由圖5所示，金魚在濃度為24.02 mg/L的NH4Cl溶液中，丙二醛含量最高，為7.43±0.17（μmol/g×FW），顯著高于其他組（P＜0.05）；在濃度為33.44 mg/L的NH4Cl溶液中，丙二醛含量最低，為2.30±0.35（μmol/g×FW），差異極顯著（P＜0.01）?？梢姡邪钡窟^高，金魚體內(nèi)肝胰臟組織中的丙二醛分泌受到抑制。

圖5 氨氮脅迫對(duì)金魚肝胰臟中丙二醛含量的影響

2.3.2 氨氮脅迫對(duì)金魚肌肉組織中丙二醛含量的影響

由圖6所示，對(duì)照組內(nèi)，金魚肌肉組織的MDA含量為1.04±0.15（μmol/g×FW），顯著高于其他組（P＜0.05）。其中，在濃度為33.44mg/L的NH4Cl溶液中，金魚肌肉組織中的丙二醛含量最低，為0.03±0.14（μmol/g×FW），顯著高于其他組（P＜0.05）。因此，水溶液中的過高氨氮含量會(huì)嚴(yán)重抑制金魚肌肉組織中丙二醛的分泌。

圖6 氨氮脅迫對(duì)金魚肌肉組織中丙二醛含量的影響

2.4 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道內(nèi)淀粉酶活性的影響

如圖7所示。氨氮濃度為0.00mg/L時(shí)，金魚淀粉酶活力最高，為0.43±0.01（U/mL）;顯著高于其他組（P＜0.05）；隨著NH4Cl溶液濃度的升高，金魚淀粉酶活性不斷降低。可見，未受氨氮影響的金魚消化道淀粉酶活性最高；而水中的氨氮?jiǎng)t會(huì)抑制金魚消化道內(nèi)淀粉酶的活性。

圖7 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道內(nèi)淀粉酶活性的影響

2.5 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道內(nèi)蛋白酶活性的影響

如圖8所示。NH4Cl溶液濃度為17.25mg/L時(shí)，金魚蛋白酶活力最高，為18.94±1.42（U/mgprot），顯著高于其他組（P＜0.05）；當(dāng)NH4Cl溶液濃度高于17.25mg/L時(shí)，金魚蛋白酶活力不斷下降；可見，適量的氨氮影響可以提高金魚蛋白酶活力；但氨氮濃度超過一定范圍則會(huì)抑制消化道內(nèi)蛋白酶的活性。

圖8 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道內(nèi)蛋白酶活性的影響

2.6 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道內(nèi)脂肪酶活性的影響

如圖9所示。在氨氮濃度為20.36mg/L時(shí)脂肪酶活性達(dá)到最大，為214.64±15.33（U/gprot），差異不顯著（P＞0.05）。在氨氮濃度為0.00mg/L時(shí)，脂肪酶活性最低，為58.66±25.14（U/gprot），差異不顯著（P＞0.05）。由此可見，在一定濃度范圍內(nèi)，氨氮脅迫可增強(qiáng)金魚消化道內(nèi)的脂肪酶活性。

2.7 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道菌群的影響

如圖10所示。氨氮脅迫五天后，消化道內(nèi)的芽孢桿菌數(shù)在33.44mg/L時(shí)達(dá)到最大，差異不顯著（P＞0.05）；大腸桿菌的數(shù)目在33.44mg/L時(shí)達(dá)到最大，差異不顯著（P＞0.05）；而乳酸桿菌數(shù)目在17.25mg/L時(shí)達(dá)到最大，差異不顯著（P＞0.05）。由此說明，氨氮脅迫能提高芽孢桿菌數(shù)目，而適量的氨氮濃度也能增加大腸桿菌和乳酸桿菌的數(shù)目。

圖10 氨氮脅迫對(duì)金魚消化道內(nèi)脂肪酶活性的影響

3．結(jié)論

金魚是我國特有的一種觀賞魚，因其雍容華貴的體態(tài)、優(yōu)美輕盈的舞姿和鮮艷秀麗的色彩，被譽(yù)為“東方圣魚”“水中芭蕾”，因此金魚在我國從古至今深受人們的喜愛。如今，金魚已是許多家庭和公共場(chǎng)所人們喜聞樂見的觀賞魚類。人們將金魚放養(yǎng)于裝飾精美、水質(zhì)明澈的魚缸或水族箱，不僅獲得了絕佳的觀賞效果，也為居室和工作環(huán)境平添了幾分情趣，給人以閑雅恬適的感覺。但是，在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖過程中，由于殘余的餌料和水產(chǎn)動(dòng)物的排泄物使得金魚等硬骨魚類受到嚴(yán)重的傷害。使金魚等水產(chǎn)動(dòng)物在抗氧化酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性等和丙二醛含量出現(xiàn)了明顯的變化，也使金魚等水產(chǎn)動(dòng)物消化道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性發(fā)生了明顯變化。為了金魚等水產(chǎn)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖，避免氨氮脅迫對(duì)金魚養(yǎng)殖的影響，我們進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)的對(duì)比，金魚體內(nèi)酶活性隨著氨氮濃度的增加呈現(xiàn)不同的變化。金魚體內(nèi)肝胰臟中的SOD活性、CAT活性、MDA含量分別在氨氮濃度為17.25mg/L、33.44mg/L、24.02mg/L時(shí)達(dá)到最高；其肌肉中的SOD活性、CAT活性、MDA含量分別在氨氮濃度為28.34mg/L、0.00mg/L、20.36mg/L時(shí)達(dá)到最大值；而金魚體內(nèi)的消化酶淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活性在氨氮濃度為0.00mg/L、17.25mg/L、20.36mg/L時(shí)酶活性達(dá)到最大。金魚腸道內(nèi)的大腸桿菌數(shù)目和乳酸桿菌的數(shù)目在低氨氮濃度的脅迫下均得到提升，而芽孢桿菌在氨氮濃度較大的時(shí)候其數(shù)目得到提升。綜合上述實(shí)驗(yàn)，建議在金魚等水產(chǎn)動(dòng)物的養(yǎng)殖中應(yīng)該在保持適當(dāng)氨氮濃度下，每隔2-3d進(jìn)行換水；防止由于金魚的排泄物等因素引起水中氨氮濃度過高，使金魚體內(nèi)的酶活性發(fā)生改變，從而影響金魚的健康。