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    L-賴氨酸全營養(yǎng)流加發(fā)酵工藝的研究

    2022-10-13 04:00:22王金多李瀾瀟徐慶陽
    中國調(diào)味品 2022年10期
    關鍵詞:營養(yǎng)

    王金多,李瀾瀟,徐慶陽

    (天津科技大學 生物工程學院,天津 300450)

    L-賴氨酸作為人和動物的八大必需氨基酸之一[1],在醫(yī)療、畜牧業(yè)及食品工業(yè)得到了廣泛的應用。在醫(yī)療方面,用于治療由病毒引起的皰疹,有提高機體抵抗病毒的能力,L-賴氨酸和谷氨酸的復合鹽可用于腦部組織的保護[2],并且對減少骨密度降低和鈣流失有效果。L-賴氨酸最主要的應用范圍是畜牧業(yè),作為飼料添加劑,有助于提高禽畜的抗病性和生長速率,需求量巨大[3-5]。近些年來,各大企業(yè)爭相開展L-賴氨酸的生產(chǎn)。在食品工業(yè)中,L-賴氨酸作為營養(yǎng)補充劑,廣泛應用于谷物制品中,亦可作為調(diào)味品添加到食品中。由于L-賴氨酸的主要生產(chǎn)方式是發(fā)酵,如何有效地提高產(chǎn)量、提高葡萄糖-氨基酸轉化率、降低設備損耗、優(yōu)化分離提純工藝成為降低成本的關鍵[6]。

    L-賴氨酸的發(fā)酵優(yōu)化方法有溶氧、在線控制pH和優(yōu)化培養(yǎng)基配比等,上述方法對提高L-賴氨酸的產(chǎn)量、減少副產(chǎn)物的積累和提高糖酸轉化率等有很好的作用[7-8]。為解決菌體生長后期菌體活力明顯減弱、產(chǎn)酸能力下降等問題,實驗通過全營養(yǎng)流加工藝,探究最適全營養(yǎng)流加濃度和最適流加時間[9-12],達到長時間維持菌體穩(wěn)定期和高產(chǎn)酸速率[13]、防止早衰的目的[14]。實驗通過設置5個流加梯度,采用低速全程流加全營養(yǎng)的方法,并對比生物量、單位生長速率、L-賴氨酸產(chǎn)量和單位產(chǎn)酸速率等參數(shù),確定最適宜的全營養(yǎng)流加濃度。根據(jù)已確定的最佳全營養(yǎng)流加濃度,采用流速為25 mL/h恒速分時流加全營養(yǎng)的方法,分析在菌體生長的不同階段流加全營養(yǎng)對發(fā)酵生物量、生長速率、L-賴氨酸產(chǎn)量、單位產(chǎn)酸速率等的影響,最終應用于實際生產(chǎn)中,提高L-賴氨酸產(chǎn)量和糖酸轉化率,降低后處理成本,在提高企業(yè)經(jīng)濟效益的基礎上實現(xiàn)綠色生產(chǎn)[15]。

    1 材料與方法

    1.1 菌種

    谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)LS260:由天津科技大學代謝工程實驗室保藏。

    1.2 培養(yǎng)基

    種子罐培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L,豆餅水解液15 mL/L,玉米漿干粉20 g/L,(NH4)2SO4·7H2O 6 g/L,KH2PO41.7 g/L,MgSO40.6 g/L,VB11.5 mg/L,VB51.5 mg/L,VB121.5 mg/L,VH2 mg/L。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖60 g/L,豆餅水解液20 mL/L,玉米漿干粉25 g/L,(NH4)2SO4·7H2O 5 g/L,KH2PO42 g/L,MgSO41 g/L,VB11 mg/L,VB51 mg/L,VB121 mg/L,VH1.5 mg/L。

    全營養(yǎng)培養(yǎng)基:一定濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基。

    1.3 主要儀器

    主要儀器設備見表1。

    表1 儀器設備

    1.4 培養(yǎng)方法

    斜面培養(yǎng):一代試管斜面活化2根,恒溫箱32 ℃培養(yǎng)24 h,二代茄形瓶斜面活化2支,恒溫箱32 ℃培養(yǎng)18 h。

    種子罐培養(yǎng):接種量2支茄形瓶,發(fā)酵體積2 L,培養(yǎng)溫度34 ℃,pH 7.0~7.2,溶氧45%以上,轉速與溶氧聯(lián)動,種子培養(yǎng)12~15 h。

    發(fā)酵罐培養(yǎng):接種量600 mL,發(fā)酵體積3 L,培養(yǎng)溫度34 ℃,pH 7.0~7.2,溶氧30%以上,轉速與溶氧聯(lián)動,發(fā)酵時間36 h。

    1.5 實驗方法

    1.5.1 梯度濃度低速全程流加全營養(yǎng)策略

    分別配制發(fā)酵培養(yǎng)基濃度100%、75%、50%、25%的流加料,從發(fā)酵起始開始流加,全程以20 mL/h低速流加,至發(fā)酵36 h結束。

    1.5.2 恒速分時流加全營養(yǎng)策略

    根據(jù)1.5.1確定的最適全營養(yǎng)濃度,在發(fā)酵過程和菌體生長的不同狀態(tài),分別選擇5,10,15,20 h恒速流加全營養(yǎng),流加速度為20 mL/h。

    1.6 檢測方法

    1.6.1 pH值測定

    采用梅特勒-托利多pH在線檢測,精密pH試紙輔助檢測。

    1.6.2 菌體生物量測定

    菌體生物量采用OD600吸光度法測定,發(fā)酵液用容量瓶稀釋特定倍數(shù)后,用可見光分光光度計測定吸光度,吸光度×稀釋倍數(shù)得到實際OD值,可以直接表示菌體生物量。

    1.6.3 L-賴氨酸含量測定

    發(fā)酵液中L-賴氨酸及副產(chǎn)物含量采用高效液相色譜法測定,采用Agilent C18色譜柱(15 mm×4.6 mm,3.5 μm),衍生劑為2,4-二硝基氟苯,柱前衍生,流動相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液,柱溫33 ℃,流速1 mL/min,檢測波長360 nm。

    1.7 數(shù)據(jù)處理

    糖酸轉化率SA計算公式為:

    式中:ρ為L-賴氨酸質量濃度,g/L;V為發(fā)酵液總體積,L;m為總耗糖量,g。

    所有實驗數(shù)據(jù)取3次實驗的平均值。單因素方差分析之后采用Dunnett-t檢驗來確定數(shù)據(jù)差異的顯著性。

    2 結果與討論

    2.1 梯度濃度低速全程全營養(yǎng)流加策略

    目前,在L-賴氨酸的發(fā)酵過程中,一般采用補料分批發(fā)酵,一次性投入底物培養(yǎng)基,過程中流加葡萄糖等碳源維持發(fā)酵。隨著發(fā)酵的進行,菌體細胞不斷翻倍,用以支持菌體生長的營養(yǎng)物質濃度逐漸降低,導致發(fā)酵中后期常出現(xiàn)菌體活力下降。而在合適的發(fā)酵階段向培養(yǎng)體系中流加合適濃度的全營養(yǎng)則能有效解決上述問題,達到提高菌體活力,延緩菌體衰退,延長穩(wěn)定期及產(chǎn)酸高峰期的效果。

    值得注意的是,過高的營養(yǎng)濃度可能也會使菌體生長受到抑制。因此,為了確定合適的全營養(yǎng)培養(yǎng)基濃度,本實驗設置100%、75%、50%、25%、0% 5個流加培養(yǎng)基濃度梯度,以0%為對照組,進行發(fā)酵優(yōu)化對比實驗[16],探究不同全營養(yǎng)培養(yǎng)基濃度對L-賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。過程中每隔2 h取樣,檢測生物量及L-賴氨酸產(chǎn)量,并計算菌體生長速率及糖酸轉化率,結果見圖1~圖4。

    圖1 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對生物量的影響

    圖2 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對生長速率的影響

    圖3 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對產(chǎn)量的影響

    圖4 不同濃度恒速全程全營養(yǎng)流加對產(chǎn)酸速率的影響

    由圖1可知,流加濃度為0%,在發(fā)酵進行至20 h時,菌體生物量開始下降,菌體量從20 h開始明顯下降,菌體衰亡相對流加全營養(yǎng)組提前;流加濃度為50%時,最大菌體量為123.9,較對照組提高了33.8%,且流加全營養(yǎng)的4組的最終OD值都比對照組高。

    由圖2可知,流加濃度為75%、50%、25%時都能有效地延緩菌體活力下降,并且在發(fā)酵前期能提高菌體的生長速率,流加濃度為50%時,6~8 h達到最大生長速率24.8%,較對照組提高了18.09%。

    由圖3可知,流加濃度為75%、50%、25%時,L-賴氨酸產(chǎn)量相較對照組分別提高了21.6%、40.7%、15.6%,并且在全營養(yǎng)流加濃度為50%時,產(chǎn)量達到235 g/L,產(chǎn)量最高;全營養(yǎng)流加濃度為100%時,因流加全營養(yǎng)導致菌體營養(yǎng)中毒,發(fā)酵液中營養(yǎng)成分過剩,導致胞內(nèi)代謝流紊亂,產(chǎn)酸量低于對照組。

    由圖4可知,流加濃度為75%、50%、25%時,L-賴氨酸產(chǎn)酸速率較對照組明顯提高,產(chǎn)酸速率分別提高了16.9%、30.8%、13.1%,但流加濃度100%相比對照組,產(chǎn)酸速率有所降低。

    綜合上述實驗結果可知,通過在發(fā)酵過程中低速全程流加全營養(yǎng)策略,在適宜的流加濃度下,能有效提高菌體生物量,菌體在對數(shù)期生長速率有所提高,在發(fā)酵后期菌體衰退放緩,延長了菌體穩(wěn)定期和高速產(chǎn)酸期,解決了發(fā)酵后期由于營養(yǎng)不足引起的菌體活力不足的問題,使得產(chǎn)量較使用全營養(yǎng)流加策略前大幅提升。但發(fā)酵前期培養(yǎng)基底料營養(yǎng)十分充足,在這段時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基有可能影響菌體生長,增加發(fā)酵結束時發(fā)酵液營養(yǎng)剩余,造成浪費、提取困難、產(chǎn)品質量下降等問題[17]。

    2.2 恒速分時流加策略

    為了進一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)過程,提高產(chǎn)酸量和糖酸轉化率,并解決發(fā)酵前期因流加料導致培養(yǎng)基營養(yǎng)過剩、發(fā)酵后期菌體活力下降、產(chǎn)酸動力不足等問題,本實驗在1.5.1實驗方法的基礎上,結合2.1得出的實驗結果,進一步改進流加策略。流加料采用濃度為50%的發(fā)酵底物培養(yǎng)基,并對全營養(yǎng)流加的最佳開始時間進行探究。分別在發(fā)酵5,10,15,20 h開始流加全營養(yǎng),直至發(fā)酵結束,分析在菌體生長的不同階段流加全營養(yǎng)對發(fā)酵生物量、生長速率、L-賴氨酸產(chǎn)量和單位產(chǎn)酸速率[18]等的影響,結果見圖5~圖8。

    圖5 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對菌體生物量的影響

    圖6 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對菌體生長速率的影響

    圖7 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對產(chǎn)量的影響

    圖8 發(fā)酵不同時間流加全營養(yǎng)培養(yǎng)基對產(chǎn)酸速率的影響

    由圖5可知,對照組和5 h開始流加的組別菌體在22~25 h開始出現(xiàn)菌體衰亡。在發(fā)酵的10,15,20 h開始流加流加料,菌體生長速度均有提高;菌體生物量穩(wěn)定期延長,最終生物量分別較未流加流加料的對照組提高23.1%、16.1%、10.0%。

    由圖6可知,10 h開始流加時,菌體生長速率下降放緩,最終生長速率平穩(wěn)。

    由圖7可知,發(fā)酵5,10,15,20 h開始流加全營養(yǎng),最后L-賴氨酸產(chǎn)量分別為218,255,220,181.5 g/L,相較于對照組167 g/L有明顯提高,分別提高了30.5%、52.7%、31.7%、8.7%。由實驗結果可知,5 h流加不能解除營養(yǎng)過剩導致的菌體中毒,導致菌體內(nèi)部代謝流紊亂,影響菌體產(chǎn)酸活力。發(fā)酵20 h流加,菌體已經(jīng)開始衰退,流加全營養(yǎng)無明顯效果。

    由圖8可知,5,10,15 h的L-賴氨酸最高產(chǎn)酸速率分別為23%、42.2%、7.3%,相較于對照組明顯提高;20 h開始流加,已經(jīng)在發(fā)酵的后期,產(chǎn)酸高峰已經(jīng)結束,產(chǎn)酸速率相較于對照組無明顯變化。

    綜合上述實驗結果可知,在發(fā)酵前期流加全營養(yǎng),對菌體生物量、產(chǎn)酸能力、菌體活力有一定幫助,但效果不明顯;在菌體達到穩(wěn)定期,發(fā)酵剛開始進入高速產(chǎn)酸期時開始流加全營養(yǎng),能夠長時間維持菌體活力和產(chǎn)酸能力[19],延長高速產(chǎn)酸期,延緩菌體衰亡,有效地解決了發(fā)酵前期底物抑制和發(fā)酵后期菌體過早衰亡的問題;發(fā)酵后期流加全營養(yǎng),此時菌體已經(jīng)開始衰亡,流加全營養(yǎng)可以恢復部分菌體活力,但效果不明顯,意義不大[20-21]。

    2.3 全營養(yǎng)流加對糖酸轉化率的影響

    由表2可知,在發(fā)酵時間同為36 h的條件下,優(yōu)化后的平均補糖速率比優(yōu)化前高40.06%,補糖量高出397 g,糖酸轉化率提高9%,產(chǎn)酸量提高52.7%。

    表2 全營養(yǎng)流加對糖酸轉化率的影響

    3 結論

    在谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的過程中,L-賴氨酸的產(chǎn)量及糖酸轉化率是評估菌株性狀和發(fā)酵產(chǎn)酸能力的核心指標。為解決發(fā)酵后期菌體活力不足、高速產(chǎn)酸期時間較短等問題,通過探究梯度濃度低速全程全營養(yǎng)流加策略,增強了發(fā)酵前期菌體的生長能力,提高了菌體生物量,延長了菌體生長穩(wěn)定期。全營養(yǎng)流加料為發(fā)酵培養(yǎng)基濃度50%時,L-賴氨酸產(chǎn)量大幅提高,達到235 g/L,比對照組提高了40.7%。為探究在不同發(fā)酵階段采用全營養(yǎng)流加策略對發(fā)酵產(chǎn)酸和糖酸轉化率等的影響,根據(jù)1.5.2的實驗方法,采用恒速分時流加策略,最終生物量為144,較優(yōu)化前提高了23.1%,L-賴氨酸產(chǎn)量為255 g/L,較優(yōu)化前提高了64.5%,糖酸轉化率為70.3%,較優(yōu)化前提高了9%。最終發(fā)現(xiàn)通過在發(fā)酵10 h時流加發(fā)酵培養(yǎng)基底物濃度50%的流加料效果最優(yōu)。采用全營養(yǎng)流加策略能有效地提高產(chǎn)量,一定程度上提高了糖酸轉化率。在工業(yè)生產(chǎn)中,在高速產(chǎn)酸期初始階段,可以采用流加發(fā)酵培養(yǎng)基濃度50%的全營養(yǎng)流加策略,能夠有效提高產(chǎn)量,提高糖酸轉化率,降低原料成本。

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