反應(yīng)時間對以甘草為原料制備香料揮發(fā)性成分的影響

施豐成，梁佳欣，劉遠(yuǎn)上，薛芳，劉彬，賈學(xué)偉，許春平*

(1.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司卷煙減害降焦四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610051；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002；3.河北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050051)

甘草，又被稱為美草、甜草、國老、靈通、甜根子、密甘，是豆科多年生草本植物干燥的根和根莖[1-2]。甘草提取物活性成分主要有甘草皂苷類的甘草酸、甘草黃酮類、甘草多糖等，具有抗疲勞、抗炎殺菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保肝、強(qiáng)化記憶力等功效[3-5]。甘草及其提取物作為添加劑廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、糕點(diǎn)、保健品、肉制品等食品中。段善海等[6]以甘草為原料制備甘草軟糖，其具有濃郁的香氣、軟綿的口感以及保健功能。馬彥花等[7]利用甘草中多糖研制出的甘草多糖飲料是一款功能性飲品，其風(fēng)味獨(dú)特，具有抗炎、抗病毒以及護(hù)胃功能，提高了甘草產(chǎn)品的附加值。劉安奇等[8]對甘草保健飲料展開介紹，并對后續(xù)研究進(jìn)展進(jìn)一步探討。甘草飲料主要包括甘草復(fù)合型飲料、甘草發(fā)酵飲料、甘草固體飲料；因甘草強(qiáng)大的保健功能，甘草飲料具有良好的開發(fā)前景。

近幾十年來，美拉德反應(yīng)一直是食品學(xué)、營養(yǎng)學(xué)、香料學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，主要原因是其產(chǎn)物能賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味、色澤，提高營養(yǎng)價值及安全性[9-11]。石曉巖等[12]以魷魚的下腳料為主要原料，確定最佳的酶解和美拉德反應(yīng)工藝，制備出顏色自然、風(fēng)味和口感純正、香氣濃郁的魷魚粉，可廣泛應(yīng)用到食品和香精香料行業(yè)中。張佳敏等[13]以豬骨多肽酶解液為原料，研究影響美拉德反應(yīng)的因素——氨基酸含量、還原糖含量、pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間，從而確定最佳工藝，制備出最逼真的肉味香精。綦艷梅[14]利用美拉德反應(yīng)技術(shù)，將雞肉酶解液制備成天然、安全的清燉雞肉風(fēng)味膏狀香精，其風(fēng)味濃郁、口感好、留香久。但針對甘草經(jīng)過美拉德反應(yīng)后作為香料添加劑的理論研究鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

本文以甘草為原料制備水提物，與焦糖化料液混配，使其在不同時間下發(fā)生美拉德反應(yīng)制備焦甜香型香料；對不同反應(yīng)時間下的產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析和主成分分析，探討不同時間下美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的差異，不僅可以開發(fā)新型香料，提高甘草的綜合利用，而且為其加工工藝研究提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘草：岷縣和泰中藥材有限公司；無水乙醇、二氯甲烷：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；葡萄糖溶液、無水Na2SO4：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；NaOH：煙臺市雙雙化工有限公司；乙酸苯乙酯(色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司；無菌水：濟(jì)南娃哈哈恒楓飲料有限公司。

Q-100A3型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；JJ-1型攪拌器 常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠；MS-H280-Pro型加熱器、低溫冷卻液循環(huán)泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；TDZ5-WS型離心機(jī) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限責(zé)任公司；PHS-3E型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市華峰儀器有限公司；ZDHW型調(diào)溫電熱套 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；SB-3200DT型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Agilent GC6890-MS5973N型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甘草水提物的制備

取1 kg干燥的甘草片原料進(jìn)行粉碎，過40目篩，加入4000 mL的去離子水，用集熱式恒溫加熱磁力攪拌器在55 ℃條件下攪拌6 h，然后進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速為4000 r/min，時間為10 min)，取出上清液置于冰箱中保存，沉淀物按上述操作步驟再攪拌12 h，取出上清液，合并濾液后加入旋蒸瓶中進(jìn)行旋蒸，最終制得甘草水提物，得率為38.6%。

1.2.2 葡萄糖焦糖化料液的制備

先配制濃度為400 g/L的葡萄糖溶液，加入糖質(zhì)量為20%的無水碳酸鈉作為反應(yīng)助劑，在160 ℃條件下油浴30 min使其發(fā)生焦糖化反應(yīng)，制得葡萄糖焦糖化料液。

1.2.3 不同時間樣品的制備

將甘草水提物和焦糖化料液按照3∶1的配比添加混勻，用1 mol/L的NaOH將pH調(diào)節(jié)至7，然后均分成7等份，在100 ℃條件下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，分別進(jìn)行0，20，40，60，80，100，120 min油浴，經(jīng)油浴后裝入不同的樣品瓶中。

1.2.4 不同時間樣品的嗅香評價

參考YC/T 497—2014[15]中的嗅香評價方法，結(jié)合不同時間美拉德反應(yīng)樣品香料的實(shí)際情況，選取9種香韻(木香、清香、藥草香、甜香、奶香、堅(jiān)果香、烘烤香、焦糖香、煙熏香)對樣品進(jìn)行嗅香評價。組織5個專家進(jìn)行評價，量化分值為0～5分，記分單位為0.5分；綜合分析數(shù)據(jù)，剔除異常離群值，將平均值作為各香韻的最終得分。

1.2.5 同時蒸餾萃取甘草中的揮發(fā)性物質(zhì)

分別取不同時間美拉德反應(yīng)的樣品10 g置于圓底燒瓶中，加入100 mL去離子水，搖晃均勻后放入加熱套中進(jìn)行加熱處理，同時在蒸餾瓶中加入50 mL二氯甲烷在65 ℃條件下水浴，待樣品微沸時計(jì)時2 h，冷卻后將蒸餾瓶取下，加入無水Na2SO4吸取水分，在55 ℃條件下濃縮至1～1.5 mL，用注射器過孔徑為0.22 μm的有機(jī)濾膜轉(zhuǎn)移至氣質(zhì)樣品瓶中，同時加入20 μL濃度為0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯(作為內(nèi)標(biāo))進(jìn)行氣質(zhì)分析進(jìn)而得到甘草中的揮發(fā)性物質(zhì)。

1.2.6 GC-MS分析方法

色譜條件：載氣：氦氣，載氣流量：3 mL/min，進(jìn)樣口溫度：280 ℃，HP-5MS 色譜柱(60 m×250 μm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，升溫程序：初起始溫度50 ℃，以4 ℃/min升至280 ℃。

質(zhì)譜條件：接口溫度270 ℃，離子源：EI源，四極桿溫度：150 ℃，采集模式：掃描，電子能量：70 eV，質(zhì)量掃描范圍：35～550 amu，檢索譜庫：NIST 11譜庫，溶劑延遲5 min。

1.2.7 主成分分析方法

對美拉德反應(yīng)的甘草中揮發(fā)性物質(zhì)用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)，計(jì)算主成分特征值和累計(jì)貢獻(xiàn)率等。根據(jù)不同美拉德反應(yīng)時間的甘草中有關(guān)成分的含量標(biāo)準(zhǔn)化值與特征根、特征向量，計(jì)算出各主成分值，并以此繪制出散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果分析

2.1 嗅香評價結(jié)果分析

為了明確7種不同美拉德反應(yīng)時間樣品的感官特征，采用香氣輪廓分析法[16]對7種樣品的嗅香進(jìn)行了評價分析，結(jié)果見圖1。

圖1 不同反應(yīng)時間樣品的嗅香評價結(jié)果

由圖1可知，隨著反應(yīng)時間的增加，藥草香香韻從微有到濃郁又減少，甜香香韻則從濃郁減少至微有，焦糖香香韻一直都較為濃郁，大體上相差不大；7種樣品的主香韻(甜香、焦糖香、藥草香)較為一致，同時在其他香韻上又存在一定差異。0 min樣品則表現(xiàn)出濃郁的焦糖味和甜味，因?yàn)闃悠诽砑佑薪固腔弦呵椅催M(jìn)行美拉德反應(yīng)，固有較為濃烈的焦甜味；20，40，60，80 min樣品的感官特征較為相似；100 min樣品有藥草味；120 min樣品則具有特殊的煙熏味，可能是由于美拉德反應(yīng)時間過長。

2.2 GC-MS數(shù)據(jù)分析

以0.8211 mg/mL的乙酸苯乙酯為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行GC-MS分析后，選取匹配度在80%及以上的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，鑒定結(jié)果見表1。

表1 甘草經(jīng)不同時間美拉德反應(yīng)后揮發(fā)性物質(zhì)含量(μg/g)

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

由表1可知，不同時間美拉德反應(yīng)的甘草混配物共有110種揮發(fā)性物質(zhì)，已鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)的種類主要包括酸類、醇類、酯類、醛類、烯類、酮類、酚類、烷類、胺類、雜環(huán)類等。對照樣品(未進(jìn)行美拉德反應(yīng))和美拉德反應(yīng)時間分別為20，40，60，80，100，120 min的樣品，已鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)分別有34，21，20，20，27，43，34種。按上述時間梯度甘草混配物中已鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)總量依次為18.04，20.53，66.39，67.16，86.63，127.62，88.22 μg/g，鑒定出揮發(fā)性成分含量最多和種類數(shù)最多的均是美拉德反應(yīng)時間為100 min的樣品。僅分析進(jìn)行美拉德反應(yīng)的樣品可知，隨著美拉德反應(yīng)時間的延長，揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量都呈先上升后下降的趨勢；但分析對照樣品可知，其揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)較多，烷烴種類數(shù)最多，但含量都很低，僅占對照樣品揮發(fā)性物質(zhì)總含量的8.65%；當(dāng)進(jìn)行美拉德反應(yīng)后，烷烴類物質(zhì)大大減少，可能是其中的直鏈烷烴在加熱條件下不穩(wěn)定易分解造成的；而且烷烴類物質(zhì)分子量大且閾值較高，通常香氣不突出，香味特征不明顯[17-18]，對香氣的貢獻(xiàn)比較小。

通過對揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量分析，甘草混配物經(jīng)美拉德反應(yīng)后的揮發(fā)性物質(zhì)主要為醇類、酯類、雜環(huán)類等。醇類物質(zhì)主要來自脂肪的氧化以及醛酮等羰基化合物的還原。醇類含量占比最多，以美拉德反應(yīng)100 min的樣品計(jì)算達(dá)到44.00%，主要是不飽和醇，閾值較低，一般具有令人愉悅的香氣[19-20]；其中糠醇、麥芽醇含量較高，都具有焦甜的香氣，而且麥芽醇為美拉德反應(yīng)100 min樣品中所特有的香氣物質(zhì)。

酯類物質(zhì)一般是由脂肪酸和醇類發(fā)生酯化反應(yīng)形成的，有揮發(fā)性高和相對閾值較低的特性，多具有令人愉悅的香甜水果香、花香或者酒香味，乙酸糠酯具有水果、堅(jiān)果和焦糖的氣味[21]，棕櫚酸甲酯有令人愉快的水果香氣，其中乙酸糠酯和Z-10-十四烯-1-醇乙酸酯是在美拉德反應(yīng)100 min樣品中特有的。

雜環(huán)類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物之一，其香味特征突出，主要產(chǎn)生堅(jiān)果、烘焙或面包味的香味物質(zhì)[22]。吡嗪類物質(zhì)一般具有堅(jiān)果和燒烤味香氣，呋喃和吡喃類物質(zhì)具有焦甜味和燒烤味香氣[23-24]。雖然含量少，但因其閾值一般較低，對風(fēng)味的貢獻(xiàn)率很大。添加少量吡嗪和吡啶類物質(zhì)，便可與煙草很好地協(xié)調(diào)，掩蓋和修飾部分對煙草氣味不利的雜氣，改善和提高煙草香氣[25]。其中吲哚具有花果樣的香味，2-甲基吡嗪具有堅(jiān)果香和咖啡香[26]，在稀釋后產(chǎn)生巧克力香，2-乙?；量┚哂锌究煽上恪⒚仪嘞?，存在于菸葉和茶葉中，也是炒榛子揮發(fā)性香味組分[27]。

由表2可知，對照樣品(美拉德反應(yīng)時間0 min)未進(jìn)行美拉德反應(yīng)，所以沒有美拉德反應(yīng)產(chǎn)物生成；而進(jìn)行不同時間(20,40,60,80,100,120 min)美拉德反應(yīng)后，均有美拉德反應(yīng)特征產(chǎn)物生成，隨著美拉德反應(yīng)時間的增長，其特征香味成分的含量先增加后減少，在100 min時其特征香味成分總量達(dá)到最大；而且在進(jìn)行100 min美拉德反應(yīng)時，產(chǎn)生的特征香味物質(zhì)也最多，表明美拉德反應(yīng)對揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生起促進(jìn)作用；其中2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、糠醇和麥芽醇含量較高，這些都是具有焦甜香香味的物質(zhì)，可以突出食品的焦甜香韻。

表2 不同反應(yīng)時間樣品特征香味成分及其含量比較(μg/g)

續(xù) 表

2.3 主成分分析

對不同美拉德反應(yīng)時間的甘草中的111種揮發(fā)性成分進(jìn)行主成分分析，得到主成分載荷矩陣表(見表3)、主成分特征值和貢獻(xiàn)率(見表4)。

表3 主成分載荷矩陣

續(xù) 表

表4 6種主成分的特征值和貢獻(xiàn)率

物質(zhì)在某主成分中有較高矩陣(載荷的絕對值大于0.8)，則表明該主成分主要反映這些物質(zhì)的信息。結(jié)合表3中數(shù)據(jù)可以得出：主成分1正相關(guān)物質(zhì)中棕櫚酸甲酯、糠醇、2,6-二甲基吡嗪、N,N-二乙基苯胺的載荷值分別為0.949，0.869，0.851，0.804，則主成分1正相關(guān)主要反映酯類、醇類和雜環(huán)類的物質(zhì)信息，負(fù)相關(guān)物質(zhì)中1-十九碳烯、甲基-10-甲基月桂酸酯、正十六烷、4-己基-四氫-硫代吡喃-1,1-二氧化物等26種物質(zhì)載荷值均大于0.8，則主成分1負(fù)相關(guān)主要反映烷類、醇類、烯類、酯類、雜環(huán)類的物質(zhì)信息；主成分2正相關(guān)物質(zhì)(2Z,6E)-3,7,11-三甲基十二碳-2,6,10-三烯-1-醇、E-8-甲基-9-十四烯-1-醇乙酸酯、Z-8-十六烯、正十六烷等25種物質(zhì)載荷值均為0.559，則主成分2正相關(guān)主要反映了醇類、烷類、烯類、胺類物質(zhì)的信息，主成分2負(fù)相關(guān)物質(zhì)棕櫚油酸和棕櫚酸甲酯載荷值絕對值較大，則主成分2負(fù)相關(guān)主要反映了酸類、酯類物質(zhì)的信息；主成分3正相關(guān)的物質(zhì)糠醇、2,6-二甲基吡嗪、己二酸二辛酯的載荷值較高，則主成分3正相關(guān)主要反映了醇類、酯類和雜環(huán)類物質(zhì)的信息，主成分3負(fù)相關(guān)物質(zhì)棕櫚油酸、油酸、對甲氧基肉桂酸辛酯、糠醛、2,5-二甲氧基甲苯等11種物質(zhì)，均具有較大矩陣，則主成分3負(fù)相關(guān)主要反映了酸類、酯類、胺類、醛類物質(zhì)的信息。

由表4可知，主成分1、主成分2、主成分3的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到72.761%，說明111種揮發(fā)性物質(zhì)可以分別用主成分1、主成分2和主成分3進(jìn)行主成分分析。

根據(jù)表1、表3、表4中揮發(fā)性物質(zhì)含量、載荷值、特征值數(shù)據(jù)計(jì)算出7個樣品中的第1、第2、第3主成分值，然后以第2主成分為X坐標(biāo)，第1主成分為Z坐標(biāo)，第3主成分為Y坐標(biāo)，作散點(diǎn)圖(見圖2)。以第2主成分為X坐標(biāo)，第1主成分為Z坐標(biāo)，第3主成分為Y坐標(biāo)，作分散圖(見圖3)，代表表3中111種揮發(fā)性物質(zhì)在主成分1、主成分2、主成分3中的分布情況。

圖2 甘草進(jìn)行不同美拉德反應(yīng)時間后揮發(fā)性成分的主成分分散圖

圖3 甘草進(jìn)行不同美拉德反應(yīng)時間后揮發(fā)性成分的主成分散點(diǎn)圖

由圖2可知,7個樣品根據(jù)距離遠(yuǎn)近分為3個區(qū)域，其中對照樣品與其他時間美拉德反應(yīng)樣品距離較遠(yuǎn)，表明其主成分差異較大；20，40，60，80 min美拉德反應(yīng)樣品距離較近，表明其主成分差異較??；100 min和120 min美拉德反應(yīng)樣品距離較近，表明其主成分差異較小。

由圖3可知，對照樣品主要包括甲基酮環(huán)己酯、甲基-10-甲基月桂酸酯、棕櫚油酸、1-十九碳烯等的揮發(fā)性主成分，集中在主成分1的負(fù)半軸、主成分2的正半軸和主成分3的正半軸；100 min美拉德反應(yīng)樣品主要包括2,3-二氫苯并呋喃、2-乙?；量?、5-甲基-2-呋喃甲醇等的揮發(fā)性主成分，集中在主成分1的正半軸、主成分2的正半軸和主成分3的負(fù)半軸；120 min美拉德反應(yīng)樣品主要包括乙酸糠酯、1-十五烯、甲基環(huán)戊烯醇酮、2-乙基-6-甲基吡嗪等的揮發(fā)性主成分，集中在主成分1的正半軸、主成分2的正半軸和主成分3的正半軸。

3 結(jié)論

以甘草為原料制備水提物，然后與焦糖化料液混配，分別經(jīng)過0，20，40，60，80，100，120 min 7個時間進(jìn)行美拉德反應(yīng)，用氣質(zhì)聯(lián)用儀和主成分分析法分析數(shù)據(jù)，得出揮發(fā)性物質(zhì)的種類包括酸類、醇類、酯類、醛類、烯類、酮類、酚類、烷類、胺類、雜環(huán)類等110種，發(fā)現(xiàn)在100 min美拉德反應(yīng)處理后揮發(fā)性物質(zhì)的含量、種類都是最多的，與120 min美拉德反應(yīng)樣品的揮發(fā)性成分差異不大，但含量差別較大，其中雜環(huán)類、醇類和酯類物質(zhì)具有特征的焦甜香味,與嗅香評價結(jié)果一致，可作為香料添加劑應(yīng)用于食品等行業(yè)，也為甘草加工工藝提供一定理論基礎(chǔ)。