凱里紅酸湯細(xì)菌群落多樣性分析及其優(yōu)勢(shì)乳酸菌篩選

宮路路，李曉然，陳芳勇，王若曦，李潔*

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)系，貴州 遵義 563000；2.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500)

酸湯作為黔東南苗族、侗族的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在當(dāng)?shù)啬酥临F州十分流行。酸湯種類很多，占主導(dǎo)地位的有紅酸湯和白酸湯。紅酸湯主要由野生毛辣角(野生西紅柿)、當(dāng)?shù)氐睦苯芬约芭疵诪橹饕习l(fā)酵而成[1]。紅酸湯可以作為配料、調(diào)味品制作酸湯火鍋，有著獨(dú)特的色、香、味，能大大增進(jìn)人們的食欲[2]。研究報(bào)道表明，酸湯具有開胃健脾、降脂減肥等作用[3]。凱里紅酸湯火鍋底料、內(nèi)蒙古涮羊肉火鍋底料以及重慶火鍋底料被譽(yù)為中國(guó)三大特色火鍋底料。白酸湯主要由米湯或淘米水放在火塘邊自然發(fā)酵而成[4]。白酸湯可作為夏季的解暑飲料，清涼爽口，風(fēng)味獨(dú)特；用白酸湯為主要調(diào)味料制作凱里酸湯魚，名揚(yáng)中外[5]。當(dāng)?shù)赜芯渌渍Z(yǔ)叫“三天不吃酸、走路打躥躥”[6]，可見人們對(duì)酸湯的喜愛。

目前凱里酸湯的研究主要集中在發(fā)酵工藝以及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)[7-9]、酸湯中分離微生物的抗氧化活性、營(yíng)養(yǎng)成分分析、風(fēng)味物質(zhì)分析[10-11]、烹調(diào)方法對(duì)紅酸湯全反式番茄紅素含量的影響[12-14]、可培養(yǎng)微生物及其優(yōu)勢(shì)微生物篩選[15]、酸湯對(duì)動(dòng)物腸道微生物的影響[16-17]以及酸湯口服液的開發(fā)[18]等方面。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)(Illumina MiSeq)發(fā)展迅猛，逐漸應(yīng)用到酸湯微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析中[19-20]，極大地促進(jìn)了人們對(duì)酸湯中微生物組成的了解。其結(jié)果可指導(dǎo)酸湯中優(yōu)勢(shì)微生物分離，進(jìn)行純菌種發(fā)酵研究。鄭莎莎等研究了干酪乳桿菌H1發(fā)酵紅酸湯，探索了該菌對(duì)紅酸湯品質(zhì)以及特征代謝物的影響[21]。

本研究從凱里市采集到了3個(gè)酸湯樣品。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析樣品中細(xì)菌群落種類多樣性。根據(jù)多樣性分析結(jié)果，有目的地篩選酸湯中優(yōu)勢(shì)菌種，并對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，為紅酸湯的進(jìn)一步純菌種發(fā)酵研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

從凱里市采集到3個(gè)酸湯樣品，分別命名為ST9、ST10和ST22。ST9和ST10樣品為從凱里市某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的傳統(tǒng)發(fā)酵紅酸湯；ST22為凱里市某知名品牌生產(chǎn)的紅酸湯。樣品采集后裝入50 mL離心管中進(jìn)行收集，置于便攜式冰盒中，隨后立即運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃冰箱中保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DNA提取裂解緩沖液：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.75 mol/L 蔗糖；TE 緩沖液:10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0)；Premix Ex TaqTM：大連Takara公司；DNA 純化回收試劑盒：QIAquick Gel Extraction Kit；MRS合成培養(yǎng)基：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖：生工生物工程(上海)股份有限公司；甘油：天津試劑三廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；ZB-1090制冰機(jī)、普通冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；ABI 7200 PCR儀 美國(guó)ABI公司；水平電泳儀 Bio-Rad公司；微量移液器 德國(guó)Eppendorf公司；制膠板 北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 德國(guó)Syngen公司；羅氏GS-FLX測(cè)序儀 瑞士Roche公司；3-18K離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；Labnet 230V EU渦旋儀 美國(guó)Labnet公司；高壓滅菌鍋 日本TOMY公司。

1.4 數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件

Silva(Release 132，http://www.arb-silva.de)；mothur(version 1.41.1, http://www.mothur.org/)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 DNA提取

改良Schmidt等的方法，進(jìn)行樣品DNA提取[22-23]。提取的DNA采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)提取質(zhì)量，將提取質(zhì)量合格的DNA樣品保存，不合格樣品重新提取DNA，以得到合格的DNA樣品。

1.5.2 細(xì)菌16S rDNA區(qū)域目的基因擴(kuò)增

使用細(xì)菌16S rDNA通用引物，擴(kuò)增細(xì)菌V3～V4區(qū)域。引物序列：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)；806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：Premix Ex TaqTM聚合酶10 μL，模板基因組DNA， 0.5 μL，目的基因上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

吸取上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，用去離子水稀釋10倍，再按照原反應(yīng)條件擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)，減少PCR產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增[24]，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，-20 ℃保存PCR產(chǎn)物備用。

1.5.3 測(cè)序結(jié)果分類鑒定

根據(jù)barcode將測(cè)序序列分配到對(duì)應(yīng)的樣品中，去除barcode以及引物序列得到有效序列。使用mothur v1.43.1軟件包MiSeq SOP進(jìn)行序列拼接，去除質(zhì)量欠佳的序列，保留長(zhǎng)度大于400 bp的序列。運(yùn)用mothur v1.43.1軟件classify.seqs命令分析，結(jié)合Silva的SSU rRNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)V138分類信息[25]得到序列分類數(shù)據(jù)。

1.5.4 α多樣性指數(shù)分析

使用mothur中classify.seqs命令獲得樣品中微生物的群落結(jié)構(gòu)，rarefaction.single命令得到微生物Chao1、Refaction和ACE等指數(shù)。以同源性為97%劃分可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。根據(jù)以上處理計(jì)算樣品ACE、Chao1、Shannon以及覆蓋度，繪制Rarefaction曲線。

1.5.5 酸湯中微生物分離與保存

MRS培養(yǎng)基是分離乳酸菌的選擇性培養(yǎng)基。結(jié)合上述樣品多樣性分析，在屬水平上，酸湯中的優(yōu)勢(shì)微生物為乳桿菌屬。亦有研究發(fā)現(xiàn)紅酸湯中主要發(fā)酵菌群為乳酸菌[26]。類比肖甜甜等參考高通量分析進(jìn)行白酸湯中優(yōu)勢(shì)微生物篩選，本研究采用MRS選擇性培養(yǎng)基有目的地分離傳統(tǒng)發(fā)酵紅酸湯中優(yōu)勢(shì)乳酸菌。

取1 mL酸湯液體，經(jīng)無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，吸取20 μL稀釋倍數(shù)為10-6的稀釋液涂布于MRS瓊脂平板，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h。挑取具有不同形狀、大小的單菌落，在MRS瓊脂平板上進(jìn)行劃線，35 ℃靜置培養(yǎng)24 h。挑取不同生長(zhǎng)形態(tài)的單菌落至5 mL MRS液體試管中進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)束后，加入30% 甘油置于-80 ℃保存。

1.5.6 酸湯中細(xì)菌基因組DNA提取

將1.5.5中保存的菌株進(jìn)行解凍，利用微量移液器吸取20 μL菌液，接種到含有5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)出的菌液采用改良CTAB法提取該菌株基因組DNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，保存合格的DNA備用。

1.5.7 酸湯中細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

以上述提取的基因組DNA為模板，加入細(xì)菌16S rRNA通用引物F27(5′-AGAGTATGATCATGGCTCAG-3′)，R1492(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)擴(kuò)增靶基因[27]。擴(kuò)增體系為：Ex Taq 25.0 μL，F(xiàn)27和R1492引物各1.0 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 21.0 μL。按照程序95 ℃熱變性 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min 30 s，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，結(jié)束后72 ℃延伸10 min，以便得到足夠數(shù)量的目的DNA分子。

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定、純化，采用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列測(cè)定。所得測(cè)序核苷酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，用BLAST軟件與GeneBank中已知的16S rDNA核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，當(dāng)被檢菌株的核苷酸序列與參考菌株的同源性大于97%時(shí)，即確定為同一個(gè)菌種[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品序列信息和多樣性指數(shù)

樣品進(jìn)行高通量測(cè)序后得到3個(gè)樣品的細(xì)菌群落，見表1。按照同源性≥97%劃分OTUs，3個(gè)樣品的細(xì)菌群落共得到276個(gè)OTUs。比照16S rRNA的Silva數(shù)據(jù)庫(kù)，將所有細(xì)菌群落分為12個(gè)細(xì)菌門，69個(gè)屬。從ACE指數(shù)來(lái)看，細(xì)菌群落豐度ST10>ST9> ST22；從Shannon指數(shù)可以看出，ST22酸湯樣品的多樣性高于傳統(tǒng)發(fā)酵的酸湯ST9和ST10。ST22為工業(yè)化生產(chǎn)的酸湯產(chǎn)品，推測(cè)與其發(fā)酵工藝復(fù)雜性有關(guān)。從Chao1指數(shù)可以看出，ST10的值最大，說(shuō)明其群落結(jié)構(gòu)豐度最高。從覆蓋度可以看出，3個(gè)樣品的覆蓋度都比較高。

表1 基于序列相似度為97%的細(xì)菌豐度

根據(jù)Rarefaction文件繪制Rarefaction稀釋曲線，見圖1。

圖1 序列相似度為97%的細(xì)菌Rarefaction評(píng)估

由圖1可看出大部分曲線尚未達(dá)到平臺(tái)期，處于一直上升的狀態(tài)，說(shuō)明測(cè)序得到的樣品序列不能全部反映其微生物群落的多樣性。然而從覆蓋率數(shù)據(jù)分析，所有樣品都在90%以上，最低為92%，最高達(dá)到了95%，顯示樣品中的主要優(yōu)勢(shì)微生物種類基本得到了呈現(xiàn)。

2.2 細(xì)菌群落多樣性分析

將3個(gè)樣品序列與Silva SSU rRNA 數(shù)據(jù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)菌群落具有一定差異性。由圖2可知，ST9中檢測(cè)到5個(gè)門，分別為Firmicutes， Proteobacteria，Actinobacteriota， Bacteroidota， Patescibacteria。其中厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢(shì)菌門，其序列數(shù)占總序列數(shù)的86.16%，其次是變形菌門(Proteobacteria)，占比13.32%，其余門的占比低于0.4%。ST10中檢測(cè)到9個(gè)門，分別為Firmicutes，Proteobacteria，Actinobacteriota，Bacteroidota，Bacteria_unclassified，Bdellovibrionota，Campilobacterota，Patescibacteria，Deinococcota。其中厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢(shì)菌門，其序列數(shù)占總序列數(shù)的92.81%，占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；其次是變形菌門(Proteobacteria)，占比5.71%，其余門的占比低于0.6%。ST22中檢測(cè)到4個(gè)門，分別為Proteobacteria，F(xiàn)irmicutes，Bacteroidota， Actinobacteriota。其中厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌門，其序列數(shù)分別占總序列數(shù)的54.81%和39.77%，其他兩個(gè)分別為Bacteroidota占比4.55%，Actinobacteriota占比0.87%。對(duì)比上述結(jié)果，3個(gè)樣品菌群結(jié)構(gòu)存在著很大差異，但基本優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，與王琪琪等研究的紅酸湯中優(yōu)勢(shì)菌門基本一致。

圖2 酸湯樣品中細(xì)菌在門的分類水平分布

由圖3可知，在屬的分類水平上，ST9酸湯樣品中有44個(gè)屬，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高，達(dá)42%，其他屬所占比例小于3.00%(最大為2.04%)。ST10酸湯樣品中有44個(gè)屬，乳酸桿菌屬(Lactobacillus)豐度最高(83.50%)；其次為假單胞菌屬(Catenococcus，7.74%)，其他屬所占比例小于2.00%(最大為1.27%)。ST22酸湯樣品中有45個(gè)屬，各個(gè)屬占比較均勻。假單胞菌屬(Catenococcus)占比最高(16.27%)，其次為芽孢桿菌屬(Bacillus，16.73%)，Aeribacillus占比5.50%，Staphylococcus占比4.95%，Proteus占比4.80%，Halomonas占比4.74%，Lactobacillus占比4.51%，Stenotrophomonas占比3.57%，Lelliottia占比2.40%?？梢姡瑢俚目倲?shù)相差不大，但相應(yīng)各屬所占比例各不相同。ST9和ST10優(yōu)勢(shì)比較明顯的屬為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)，ST22優(yōu)勢(shì)菌屬為假單胞菌屬(Catenococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，其他屬占比較少。

圖3 酸湯樣品中細(xì)菌在屬的分類水平分布

2.3 MRS平板涂布培養(yǎng)結(jié)果

將酸湯樣品ST9、ST10和ST22進(jìn)行一定稀釋，然后在超凈工作臺(tái)中涂布MRS瓊脂平板，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(部分結(jié)果見圖4中a和b)。

圖4 MRS瓊脂培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)

由圖4可知，MRS瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出了乳白色菌落，各菌落形狀差異不大，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好。

2.4 平板劃線分離結(jié)果

從平板MRS瓊脂培養(yǎng)基上挑取單菌落，然后進(jìn)行MRS瓊脂平板劃線分離菌株。部分菌株的劃線分離結(jié)果見圖5。

圖5 細(xì)菌平板劃線分離

由圖5可知，部分菌落離散性不是很好，應(yīng)進(jìn)一步劃線分離。

2.5 菌種鑒定結(jié)果

結(jié)合純培養(yǎng)技術(shù)，從樣品ST9中分離得到12株細(xì)菌，分別為2株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、1株Weissellaminorgene、9株枯草桿菌(Bacillussp.)。從樣品ST10中分離得到14株菌，分別為11株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、1株溶血性葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、1株戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)、1株肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)；從樣品ST22中分離得到3株菌，分別為2株貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、1株芽孢桿菌(Bacillussp.)，見表2。

表2 菌種鑒定結(jié)果

3 結(jié)論

從高通量測(cè)序分析到乳酸菌分離鑒定來(lái)看，傳統(tǒng)發(fā)酵酸湯中細(xì)菌種類多樣性低于工業(yè)化生產(chǎn)的酸湯產(chǎn)品。高通量測(cè)序分析顯示酸湯中優(yōu)勢(shì)菌為乳桿菌和芽孢桿菌，與純培養(yǎng)分離的結(jié)果基本一致。工業(yè)化生產(chǎn)的酸湯細(xì)菌多樣性豐富，可造就酸湯豐富多樣的口味。多樣化的細(xì)菌種類對(duì)酸湯的風(fēng)味影響很大，使工業(yè)化酸湯占有很大優(yōu)勢(shì)。

從可培養(yǎng)技術(shù)來(lái)看，酸湯樣品中分離得到的細(xì)菌多為乳酸菌和芽孢桿菌。在酸湯發(fā)酵后期，乳酸菌是酸湯發(fā)酵的主要微生物[29]。呈現(xiàn)出生長(zhǎng)繁殖加快，可形成酸性低pH發(fā)酵環(huán)境；同時(shí)乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可產(chǎn)生一些抑菌物質(zhì)，抑制其他腐敗菌生長(zhǎng)，并能夠?qū)λ釡L(fēng)味形成起到重要作用[30]。同時(shí)在3個(gè)樣品中也分離到了一些芽孢桿菌。研究報(bào)道表明，芽孢桿菌在食品發(fā)酵中起著重要的作用。芽孢桿菌具有豐富的酶類系統(tǒng)[31]，為生產(chǎn)豐富多樣的酸湯風(fēng)味奠定了基礎(chǔ)，可生產(chǎn)出具有理想感官特性的發(fā)酵食品[32]，是一類具有潛力的益生菌[33]。自然發(fā)酵的酸湯品質(zhì)受家庭作坊生產(chǎn)習(xí)慣的影響較大，一定程度上影響酸湯產(chǎn)品風(fēng)味，造成品質(zhì)不均的現(xiàn)象。采用微生物純培養(yǎng)技術(shù)，從傳統(tǒng)發(fā)酵中篩選優(yōu)勢(shì)乳酸菌作為發(fā)酵劑，是未來(lái)酸湯生產(chǎn)的一個(gè)方向。大自然中微生物資源豐富，從傳統(tǒng)發(fā)酵酸湯中尋找微生物資源，得到適合酸湯發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵劑，生產(chǎn)出品質(zhì)穩(wěn)定、具有獨(dú)特風(fēng)味的酸湯，可以很好地促進(jìn)凱里酸湯名片的打造，對(duì)于推廣凱里酸湯起到促進(jìn)作用。