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    產(chǎn)甘草次酸內(nèi)生真菌GRE111的鑒定及發(fā)酵條件研究

    2022-10-13 04:00:10萬(wàn)璐閆佳佳尤夢(mèng)瑤鄭春英
    中國(guó)調(diào)味品 2022年10期
    關(guān)鍵詞:氮源內(nèi)生發(fā)酵液

    萬(wàn)璐,閆佳佳,尤夢(mèng)瑤,鄭春英*

    (1.黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心,哈爾濱 150500;2.黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150080)

    甘草是一種天然、低熱、安全的甜味劑[1],含有甘草皂苷、甘草黃酮、甘草多糖等多種次生代謝產(chǎn)物[2],具有抗菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]等多種活性作用;現(xiàn)被廣泛應(yīng)用于調(diào)味品、食品、醫(yī)藥等行業(yè)[6]。隨著甘草需求量的上漲及過(guò)度采挖,甘草已被列入國(guó)家《野生藥材資源保護(hù)管理?xiàng)l例》的二級(jí)保護(hù)植物[7],盡管栽培種植在某種程度上緩解了甘草的匱乏,但甘草生長(zhǎng)周期長(zhǎng),種植戶資金回籠慢。因此,尋找生產(chǎn)甘草次生代謝產(chǎn)物的新方法已成為研究熱點(diǎn)。

    植物內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物[8],將甘草內(nèi)生菌作為發(fā)酵菌株,采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘草次生代謝產(chǎn)物,這對(duì)開發(fā)新資源,生產(chǎn)新型功能性調(diào)味品具有重要意義。本文以分離自甘草根部的內(nèi)生真菌GRE111為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行次生代謝產(chǎn)物篩選及抑菌活性研究,并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化;同時(shí),對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定,以便為采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘草次生代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    供試菌為內(nèi)生真菌GRE111:分離自黑龍江省大慶地區(qū)野生甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)根部;NA、PDA培養(yǎng)基的配制方法參考文獻(xiàn)[9-10];金黃色葡萄球菌等11株受試菌:購(gòu)于黑龍江省微生物研究所;ITS序列通用引物ITS1、ITS4:由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;除液相用甲醇為色譜純級(jí)別外,其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    FL2200型高效液相色譜儀 浙江溫嶺福立分析儀器有限公司;HZQ-C型空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 發(fā)酵液的制備

    無(wú)菌條件下,取已活化的內(nèi)生真菌GRE111,加適量無(wú)菌水,制成 1×107CFU/mL種子液;取GRE111種子液,以5%(體積比)接種至裝液量為50 mL的PDA培養(yǎng)基后,置于空氣浴搖床培養(yǎng)14 d(28 ℃,140 r/min),終止發(fā)酵,抽濾,取濾液,作為發(fā)酵液供試品備用。

    1.3.2 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析

    內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析采用HPLC法。

    HPLC檢測(cè)條件:Venusil XBP-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm); 流動(dòng)相:甲醇-水-冰醋酸(85∶14∶1);流速 1 mL/min; 柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

    供試品液的制備:取1.3.1發(fā)酵液供試品10 mL,減壓回收至干(50 ℃,0.1 MPa),加1 mL甲醇溶解后,過(guò)濾(0.22 μm微孔濾膜),取濾液作為供試品溶液。

    對(duì)照品液的制備:精密稱取甘草次酸對(duì)照品適量,加甲醇溶解后,制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液備用。

    空白對(duì)照品液的制備:取PDA培養(yǎng)基10 mL,與供試品液的制備方法相同,制成空白對(duì)照品液。

    HPLC分析:分別取供試品液、對(duì)照品液及空白對(duì)照品液各10 μL注入HPLC儀器。

    1.3.3 內(nèi)生真菌GRE111抑菌活性分析

    取1.3.1發(fā)酵液,凍干,稱取適量,加甲醇溶解后制成0.1 mg/mL的甲醇提取物,分別以100 μg/mL鏈霉素和制霉素作為陽(yáng)性對(duì)照,以甲醇溶液為空白對(duì)照,參考文獻(xiàn)[11],采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液進(jìn)行抗菌活性分析。

    1.3.4 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵條件優(yōu)選

    1.3.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

    a.接種量對(duì)抑菌活性的影響

    將1.3.1中1×107CFU/mL種子液分別按3%、4%、5%、6%、7%、8%(體積比)的比例接種到50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)14 d(28 ℃,120 r/min),按1.3.3測(cè)定發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑菌活性(n=3)。

    b.裝液量對(duì)抑菌活性的影響

    將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量分別接入裝有20,30,40,50,60,70 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)14 d,其他操作同1.3.4.1中a。

    c.初始pH值對(duì)抑菌活性的影響

    將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH分別為4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0的PDA培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)14 d,其他操作同1.3.4.1中a。

    d.發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

    將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中,分別發(fā)酵培養(yǎng)8,10,12,14,16,18 d,其他操作同1.3.4.1中a。

    e.搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響

    將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中,分別發(fā)酵培養(yǎng)14 d,搖床轉(zhuǎn)速分別為100,120,140,160,180,200 r/min,其他操作同1.3.4.1中a。

    f.發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響

    將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量接入裝有50 mL初始pH為7.0的PDA培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng),搖床溫度分別設(shè)定為22,24,26,28,30,32 ℃,其他操作同1.3.4.1中a。

    g.碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

    分別選用0%、1%、2%、5%、10%(質(zhì)量和體積比)的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖作為碳源制備1.3.1中PDA培養(yǎng)基,并將1.3.1中1×107CFU/mL種子液以5%(體積比)的接種量分別接入裝有50 mL初始pH為7.0的培養(yǎng)基中,發(fā)酵培養(yǎng)14 d,其他操作同1.3.4.1中a。觀察不同質(zhì)量濃度的碳源對(duì)抑菌活性的影響(n=3)。

    h.氮源及其質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

    分別選用0%、0.5%、1%、1.5%、2%(質(zhì)量和體積比)的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨為氮源,加入1.3.1中PDA培養(yǎng)基中,其他發(fā)酵培養(yǎng)條件同1.3.4.1中g(shù)。觀察不同質(zhì)量濃度的氮源對(duì)抑菌活性的影響(n=3)。

    1.3.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

    根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果,選取碳源濃度、氮源濃度、接種量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因素,采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件,因素和水平見表1。

    表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平

    1.3.5 內(nèi)生真菌GRE111的鑒定

    內(nèi)生真菌GRE111形態(tài)學(xué)觀察:參考文獻(xiàn)[12]的方法,將GRE111置于平板PDA培養(yǎng)基上(28 ℃,14 d),觀察其菌落形狀、顏色、濃密程度、培養(yǎng)基內(nèi)菌絲形態(tài)、是否產(chǎn)色素等;同時(shí),取GRE111 PDA平板(培養(yǎng)時(shí)間3 d),將無(wú)菌蓋玻片傾斜扦入該平板中,繼續(xù)培養(yǎng)5 d后,取出,鑷取蓋玻片,置于顯微鏡下觀察,初步確定菌株的分類地位[13]。

    內(nèi)生真菌GRE111 ITS序列分析:參考文獻(xiàn)[14]的方法提取菌株GRE111 DNA,PCR產(chǎn)物純化,委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序工作。所測(cè)得序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),利用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定GRE111菌株的分類地位。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分分析結(jié)果

    采用HPLC法對(duì)內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液活性成分進(jìn)行分析,結(jié)果見圖1。

    圖1 GRE111發(fā)酵液活性成分分析結(jié)果

    由圖1可知,在內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液中含有甘草次酸,且空白對(duì)照無(wú)干擾,說(shuō)明內(nèi)生真菌GRE111為甘草次酸產(chǎn)生菌。

    2.2 內(nèi)生真菌GRE111抑菌活性分析結(jié)果

    對(duì)內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性分析,結(jié)果見表2。

    表2 GRE111抑菌活性分析結(jié)果(n=3)

    由表2可知,甘草內(nèi)生真菌GRE111對(duì)10株致病菌均有一定的抑制作用,尤其對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用最強(qiáng)。

    2.3 內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵條件優(yōu)選結(jié)果

    2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.3.1.1 接種量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    在不同接種量條件下,GRE111發(fā)酵液的抑菌活性結(jié)果見圖2。

    由圖2可知,隨著GRE111接種量的增加,其發(fā)酵液的抑菌活性逐漸增強(qiáng),當(dāng)接種量為5%時(shí),GRE111的抑菌活性最強(qiáng),此后抑菌活性開始減弱。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能是隨著GRE111接種量的增加,菌株生長(zhǎng)密度增大,從而不利于抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

    2.3.1.2 裝液量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    不同裝液量對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見圖3。

    圖3 不同裝液量對(duì)抑菌活性的影響

    由圖3可知,裝液量在20%~50%范圍內(nèi)變化時(shí),GRE111抑菌活性逐漸增強(qiáng),當(dāng)裝液量持續(xù)增加時(shí),抑菌活性開始減弱,這可能是由于裝液量的增加稀釋了抑菌活性物質(zhì),從而使抑菌活性出現(xiàn)減弱的情況。

    2.3.1.3 初始pH值對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    不同初始pH值對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見圖4。

    圖4 不同初始pH值對(duì)抑菌活性的影響

    由圖4可知,當(dāng)發(fā)酵液初始pH值由4.0增至9.0時(shí),GRE111抑菌活性出現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),當(dāng)初始pH值為7.0時(shí),發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑為(26.71±0.04) mm左右,此后,隨著初始pH值的增加,GRE111抑菌活性開始減弱。上述結(jié)果表明,GRE111最適初始pH值為7.0。

    2.3.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見圖5。

    圖5 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)抑菌活性的影響

    由圖5可知,GRE111的抑菌活性隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加而表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min時(shí),抑菌活性最強(qiáng),但搖床轉(zhuǎn)速過(guò)快也會(huì)影響GRE111菌株的正常生長(zhǎng)。

    2.3.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

    GRE111在不同培養(yǎng)時(shí)間下的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見圖6。

    圖6 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響

    由圖6可知,在不同的發(fā)酵時(shí)間下GRE111的抑菌活性表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),這可能是由于GRE111菌株在發(fā)酵時(shí)間內(nèi),處于不同生長(zhǎng)期,使其產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的量有所不同。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為14 d時(shí),GRE111的抑菌活性最強(qiáng)。

    2.3.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    不同發(fā)酵溫度對(duì)GRE111抑菌活性的影響結(jié)果見圖7。

    圖7 不同發(fā)酵溫度對(duì)抑菌活性的影響

    由圖7可知,GRE111的抑菌活性隨著發(fā)酵溫度的增加表現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),28 ℃時(shí)發(fā)酵液的抑菌效果最好,此后,隨著溫度升高,發(fā)酵液的抑菌活性顯著下降,這可能是由于溫度過(guò)高不利于GRE111菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生。

    2.3.1.7 不同碳源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    不同碳源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見圖8。

    圖8 不同碳源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

    由圖8可知,碳源不同,菌株GRE111的抑菌活性也不同,當(dāng)葡萄糖為碳源,且其含量達(dá)到2%時(shí),GRE111菌株的抑菌活性最強(qiáng),因此選用2%的葡萄糖作為培養(yǎng)基的碳源含量。

    2.3.1.8 不同氮源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果

    不同氮源對(duì)抑菌活性的影響結(jié)果見圖9。

    圖9 不同氮源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響

    由圖9可知,GRE111的抑菌活性與氮源的選擇和濃度有關(guān)。當(dāng)1%蛋白胨作為氮源時(shí),GRE111菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng),因此選用1%的蛋白胨作為培養(yǎng)基的氮源。

    2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

    表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    表4 方差分析

    由表3和表4可知,影響GRE111抑菌活性的因素順序?yàn)樘荚促|(zhì)量濃度>氮源質(zhì)量濃度>接種量>發(fā)酵時(shí)間。其中碳源質(zhì)量濃度對(duì)GRE111抑菌活性的影響極顯著,氮源質(zhì)量濃度對(duì)抑菌活性的影響顯著,發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌活性無(wú)顯著影響,GRE111的最優(yōu)發(fā)酵條件為A2B3C2D2,即碳源(葡萄糖)質(zhì)量濃度為1.0%,氮源(蛋白胨)質(zhì)量濃度為1.0%,接種量為5%(體積比),培養(yǎng)時(shí)間為14 d。綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,GRE111的最佳發(fā)酵條件為:葡萄糖2%,蛋白胨1%,裝液量50%,接種量5%,初始pH值7.0,培養(yǎng)時(shí)間14 d,搖床轉(zhuǎn)速140 r/min。

    分別采用最佳發(fā)酵條件及1.3.1發(fā)酵條件將內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵培養(yǎng)后進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,采用最佳發(fā)酵工藝條件培養(yǎng)GRE111后,其抑菌活性為(28.30±0.50) mm,比對(duì)照組的抑菌活性提高3.32 mm。

    2.4 內(nèi)生真菌GRE111的鑒定結(jié)果

    2.4.1 內(nèi)生真菌GRE111形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

    GRE111菌落在培養(yǎng)7 d后,菌落直徑為7 cm左右,綠色,基質(zhì)黃色,菌落絮狀,菌絲密集,邊緣整齊,緊貼培養(yǎng)基,見圖10中a。GRE111產(chǎn)分生孢子,分生孢子的頂端形成掃帚狀的枝,最后一級(jí)分枝為小梗,由小梗形成鏈狀排列的分生孢子,見圖10中b。

    a.GRE111菌落形態(tài) b.GRE111孢子顯微結(jié)構(gòu)

    2.4.2 內(nèi)生真菌GRE111 ITS序列分析結(jié)果

    甘草內(nèi)生真菌 GRE111 DNA,PCR擴(kuò)增后獲得1條500 bp的特異性條帶,將測(cè)序結(jié)果在 GenBank中進(jìn)行Blast同源性比對(duì),然后用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖11),內(nèi)生真菌 GRE111 序列與青霉屬產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum, No.AJ608949.1)的相似度達(dá)到了99%,序列的同源性相似度為 99%。

    圖11 內(nèi)生真菌GRE111 系統(tǒng)發(fā)育樹

    綜合GRE111形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果,將甘草內(nèi)生真菌GRE111鑒定為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。

    3 結(jié)論

    從甘草根部分離得到一株可以產(chǎn)甘草次酸的內(nèi)生真菌GRE111,甘草次酸是甘草甜素主要成分甘草酸的苷元,具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種活性[15]。此外,該菌株具有較好的抑菌活性,發(fā)酵工藝經(jīng)優(yōu)化后,最佳發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度1.0%,蛋白胨質(zhì)量濃度1.0%,初始pH值7.0,裝液量50%,接種量5%,培養(yǎng)時(shí)間14 d,搖床轉(zhuǎn)速140 r/min;該條件下,GRE111抑菌活性比未優(yōu)化前提高了3.32 mm;內(nèi)生真菌GRE111鑒定為產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum)。產(chǎn)黃青霉是一種重要的工業(yè)用真菌[16],常用于抗生素、食品及飲料的生產(chǎn)。上述結(jié)果為采用內(nèi)生真菌GRE111發(fā)酵生產(chǎn)甘草次酸調(diào)味品奠定了基礎(chǔ)。

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