云南小?？Х裙すz酶提取工藝的優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

李澤林，李夢(mèng)月，趙春燕，高燕，鄔文君，范江平，沈曉靜,2,3*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.昆明醫(yī)科大學(xué)云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，昆明 650201)

咖啡目前被超過80個(gè)國家種植，是茜草科(Rubiaceae)、咖啡屬(Coffea)植物，主要分布于中美洲、非洲、亞洲等地[1]。咖啡中含有大量的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、咖啡因等生物活性化合物，是世界上最受歡迎的飲料之一[2]。近年來，中國咖啡消費(fèi)量逐年增加，是世界上最大的咖啡潛在的消費(fèi)市場(chǎng)。云南小?？Х纫蚱洹皾舛豢唷⑾愣涣?、略帶果味”的獨(dú)特風(fēng)味而備受消費(fèi)者和國際咖啡市場(chǎng)喜愛[3]?？Х裙ぷ鳛榭Х壬a(chǎn)加工過程中第一副產(chǎn)物，其產(chǎn)量隨著咖啡消費(fèi)的增加而日益增長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，在云南小?？Х鹊纳a(chǎn)過程中，每年需處理的果皮殘?jiān)s39.68萬噸[4-5]，這些咖啡果皮除部分用作堆肥[6]或用于制作咖啡果皮茶[7]、果酒[8]等產(chǎn)品外，絕大部分仍被作為廢棄物丟棄，因而造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。近年來，有研究者提出從咖啡果皮中提取果膠，以達(dá)到分解咖啡果皮的目的，最終使其經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)際使用價(jià)值增加。

果膠是一種廣泛存在于高等植物初級(jí)細(xì)胞壁和細(xì)胞之間區(qū)域的酸性雜多糖，多為半乳糖醛酸及其衍生物[9-10]。因其具有良好的凝膠性、吸附性、乳化性、增稠性等，在食品工業(yè)中常被用作凝膠劑、增稠劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等[11-12]。此外，果膠結(jié)構(gòu)和組成比較特殊，具有抗腫瘤[13]、降血糖[14]、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力[15]以及調(diào)節(jié)慢性疾病等功能。目前，果膠的提取方法主要有酸提法、離子交換法、微波提取法、鹽析法、酶法等[16]。因此，從咖啡果皮中提取果膠一方面將解決咖啡生產(chǎn)中大量果皮帶來的環(huán)境問題，另一方面提取的果膠可用于食品、醫(yī)藥領(lǐng)域，滿足市場(chǎng)需求。

現(xiàn)有研究顯示熱水法提取的咖啡果膠具有較好的抑菌和抗氧化作用[17-18]。本研究擬在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化云南小?？Х裙すz的酶法提取工藝，并通過傅里葉紅外光譜檢測(cè)粗果膠的官能團(tuán)組成，旨在為云南小?？Х裙さ木C合利用及果膠產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南小粒咖啡果皮(阿拉比卡)：云南省保山市潞江壩；纖維素酶(10000 U/g)：瑪雅試劑有限公司；無水乙醇(分析純)：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；pH計(jì)電極保護(hù)液：上海雷磁儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIENTZ-48型打粉機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；Nexus 470 FTIR型傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Nicolet公司；SHZ-D(III)型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限公司；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將咖啡果皮在45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至含水率低于5%，打粉，過80目篩，備用。準(zhǔn)確稱取20 g咖啡果皮干粉，在pH 5.0下加入纖維素酶水解后過濾得到濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)將其濃縮至原體積的1/4，加入等體積的乙醇過夜沉淀，離心分離留沉淀，取少量蒸餾水溶解后真空冷凍干燥，計(jì)算果膠得率。

1.4 果膠提取單因素試驗(yàn)

1.4.1 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

考察提取時(shí)間對(duì)咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、pH 為5.0和料液比為1∶20，設(shè)置酶解時(shí)間分別為1，2，3，4，5 h，對(duì)果皮果膠進(jìn)行酶提取，測(cè)定果膠提取率。

1.4.2 酶添加量對(duì)果膠提取率的影響

考察酶添加量對(duì)咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定提取溫度為50 ℃、pH為 5.0、酶解時(shí)間為3 h和料液比為1∶20，設(shè)置纖維素酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，對(duì)果皮果膠進(jìn)行酶提取，測(cè)定果膠提取率。

1.4.3 pH值對(duì)果膠提取率的影響

考察pH對(duì)咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為3 h和料液比為1∶20，設(shè)置pH分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，對(duì)果皮果膠進(jìn)行酶提取，測(cè)定果膠提取率。

1.4.4 料液比對(duì)果膠提取率的影響

考察料液比對(duì)咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、提取溫度為50 ℃、pH為 5.0和酶解時(shí)間為3 h，設(shè)置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，對(duì)果皮果膠進(jìn)行酶提取，測(cè)定果膠提取率。

1.4.5 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響

考察提取溫度對(duì)咖啡果皮中果膠提取率的影響：固定纖維素酶添加量為1%、pH為 5.0、酶解時(shí)間為3 h和料液比為1∶20，設(shè)置提取溫度分別為35，40，45，50，55 ℃，對(duì)果皮果膠進(jìn)行酶提取，測(cè)定果膠提取率。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以果膠提取率為指標(biāo)，選取pH、提取溫度、酶添加量和料液比4個(gè)因素，通過四因素三水平響應(yīng)面分析法進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)(見表1)，得到最佳酶提取工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.6 紅外光譜檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取咖啡果膠樣品1 mg，采用KBr壓片法進(jìn)行檢測(cè)，在500～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，利用Origin 2020作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠提取單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)果膠提取率的影響

由圖1中a可知，隨著提取時(shí)間的增加，咖啡粗果膠提取率隨之上升；當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)，提取率達(dá)到最大值(8.31±0.36)%；超過3 h后，果膠提取率降低，原因可能是提取時(shí)間過長(zhǎng)，酶活性下降，導(dǎo)致果膠提取率變低。因此，提取3 h為最優(yōu)時(shí)間。

2.1.2 酶添加量對(duì)果膠提取率的影響

由圖1中b可知，當(dāng)酶添加量從0.5%增加到1.0%時(shí)，粗果膠提取率迅速達(dá)到最大值(9.4±0.79)%，但是當(dāng)酶添加量大于1.0%時(shí)，提取率出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)榉磻?yīng)底物在酶添加量為1.0%時(shí)剛好酶解完全，隨著酶添加量的增加可能起到相反的效果。因此，酶添加量1.0%為最優(yōu)值。

2.1.3 pH值對(duì)果膠提取率的影響

由圖1中c可知，隨著酶解液pH的增加，果膠提取率在pH值為5.0時(shí)達(dá)到最大值(10.1±0.97)%；pH值大于5.0，提取率降低。表明pH 5.0是纖維素酶的最適pH值，能夠最大限度釋放咖啡果膠。

2.1.4 料液比對(duì)果膠提取率的影響

由圖1中d可知，料液比為1∶20時(shí)，果膠提取率達(dá)到最大值(9.0±0.56)%；料液比大于1∶20時(shí)，提取率降低，原因是液體過少時(shí)反應(yīng)不充分，液體過多時(shí)稀釋了酶濃度使酶活力下降。因此，1∶20為最佳料液比。

2.1.5 提取溫度對(duì)果膠提取率的影響

溫度是影響酶活性最重要的條件之一。由圖1中e可知，提取溫度由35 ℃上升到50 ℃時(shí)提取率持續(xù)增加，并且在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值(10.42±0.87)%；但是當(dāng)提取溫度大于50 ℃時(shí)，果膠提取率降低，原因是溫度升高抑制了酶活性，從而降低了提取率。因此，溫度為50 ℃時(shí)最適宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，以果膠提取率(Y)為考察響應(yīng)指標(biāo)，建立其與pH(A)、提取溫度(B)、酶添加量(C)和料液比(D)的回歸模型，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù) 表

Y=8.00-8.333E-003A-0.30B+0.50C+0.37D+0.40AB+0.38AC-0.95AD-1.31BC-0.65BD+0.100CD-2.01A2-1.00B2-0.81C2-0.79D2。

由表3可知，對(duì)回歸模型方差進(jìn)行分析， 回歸模型顯著(P<0.05)，模型決定系數(shù)R2=0.7318>0.7，說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，該擬合方程能較好呈現(xiàn)出果膠提取率與各因素間的關(guān)系。失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取工藝具有可行性。模型中，一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、AC、AD、BC、BD、CD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)粗果膠提取率均有影響，但是只有BC(P<0.05)和A2(P<0.01)具有顯著性，根據(jù)F值可以得出各因素對(duì)提取率的影響順序?yàn)槊柑砑恿?料液比>提取溫度>pH。

表3 回歸模型方差分析及模型顯著性檢驗(yàn)

續(xù) 表

2.2.2 交互作用分析

根據(jù)回歸分析結(jié)果制作相應(yīng)的等高線圖和響應(yīng)面曲線圖，見圖2。

圖2 各因素交互作用對(duì)果膠得率影響的三維曲面和等高線

隨著提取溫度的升高，咖啡果膠提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)；隨著pH的增加，咖啡果膠提取率也呈現(xiàn)先升到最大值后緩慢下降的趨勢(shì)。pH(A)與提取溫度(B)的等高線圖接近圓形，說明兩因素的交互作用不顯著，但是相互影響(見圖2中a)。隨著酶添加量的增加和pH的增大，果膠提取率逐漸升高，達(dá)到最高值后呈下降趨勢(shì)，pH(A)與酶添加量(C)的等高線圖接近圓形，說明兩因素的交互作用不明顯(見圖2中b)。隨著酶添加量的增加，果膠提取率緩慢增大，在達(dá)到最大值后迅速降低；隨著提取溫度的增加，果膠提取率先迅速升高到最大值之后逐漸降低；由酶添加量和提取溫度的等高線圖可知，等高線沿著酶添加量軸密集且呈橢圓形，說明提取溫度(B)和酶添加量(C)的交互作用顯著(P<0.05)(見圖2中c)。隨著料液比(D)和酶添加量(C)的增加，咖啡果膠提取率增大，但是兩者交互作用不顯著(見圖2中d)，這些結(jié)果與前人的研究報(bào)道相似[19-20]。綜上所述，各因素對(duì)咖啡果膠的提取率均相互影響，但是只有提取溫度(B)和酶添加量(C)的交互作用顯著，影響提取的主次順序?yàn)槊柑砑恿?料液比>提取溫度>pH。

2.2.3 模型驗(yàn)證

通過模型優(yōu)化確定咖啡果膠的最佳工藝條件：提取溫度為45 ℃，溶劑pH 為4.9，酶添加量為1.5%及料液比為1∶24.65，理論上得到咖啡果膠提取率為9.18%。以上預(yù)測(cè)最優(yōu)的工藝條件重復(fù)3次試驗(yàn)，得到實(shí)際的咖啡果膠提取率為(10.30±1.28)%，與理論預(yù)測(cè)值接近且無顯著差異，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)和模擬試驗(yàn)中咖啡果膠的提取率。

2.3 紅外光譜結(jié)果分析

圖3 云南小粒咖啡果皮果膠的紅外光譜

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了云南小?？Х裙ぶ泄z的提取工藝，表征了所得粗果膠的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，云南小粒咖啡果皮果膠的最優(yōu)酶提取工藝條件為提取溫度45 ℃、pH 4.9、酶添加量1.5%及料液比1∶24.65，提取率為9.18%。紅外光譜表明，咖啡果膠是具有典型多糖結(jié)構(gòu)的酸性雜多糖。本研究將為云南小?？Х裙すz的開發(fā)利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。