不同培養(yǎng)基和取樣方式對涇陽茯磚茶中冠突散囊菌計(jì)數(shù)的影響研究

秦 婧，舒 靜，劉 靜，石 菲，孟怡璠

（1.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西西安 710048；2.漢中市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)檢測中心，陜西漢中 723000）

產(chǎn)自陜西涇陽的茯磚茶歷史悠久，自明朝洪武年間至今已有600多年歷史。如今涇陽茯磚茶已經(jīng)成為陜西省地理標(biāo)志產(chǎn)品，成為陜西省對外的一張文化名片。茯磚茶屬于黑茶的一類，為后發(fā)酵茶，涇陽茯磚茶與其他種類的后發(fā)酵茶相比，其特殊之處在于“發(fā)花”這一加工工藝過程給茯磚茶帶來的自然益生菌體“金花”，學(xué)名為冠突散囊菌[1]。冠突散囊菌是一種真菌，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬，這種真菌經(jīng)過“發(fā)花”后在磚茶中形成直徑在100～175 μm的金黃色“金花”顆粒，故又稱“金花菌”[2]。由于冠突散囊菌以茯磚茶為基質(zhì)，經(jīng)發(fā)酵使得茯磚茶的成分發(fā)生了變化，產(chǎn)生了氧化產(chǎn)物和水解產(chǎn)物，以及有機(jī)酸等活性物質(zhì)，不僅形成了茯磚茶特有的色、香、味，也使茯磚茶具有調(diào)脂減肥、改善人體消化道功能、治療心血管疾病等保健功效[3]。

冠突散囊菌形成的“金花”顆粒與茯磚茶基質(zhì)和其他種類雜菌形成的菌落有較大的差別，且由于具有諸多對人體有益的功效，“金花”在茯磚茶中的數(shù)量和質(zhì)量是判斷茯磚茶質(zhì)量優(yōu)劣的一項(xiàng)重要且獨(dú)特的指標(biāo)。本文針對茯磚茶茶體“金花”菌落中冠突散囊菌的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測，使用不同的取樣方法進(jìn)行冠突散囊菌菌落的取樣，并采用多種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。在取樣方法的選擇上，由于地方標(biāo)準(zhǔn)《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽茯磚茶》（DBS 61/0006—2014）中并未規(guī)定取樣方法，本文采取傳統(tǒng)五點(diǎn)法作為第一種取樣方法。由于傳統(tǒng)五點(diǎn)法的取樣位置較為固定和集中，針對分散分布的菌落進(jìn)行采樣時(shí)難免發(fā)生錯(cuò)漏，有一定局限性，所以選擇對角線五點(diǎn)法作為第二種取樣方法，兩種取樣方法互為對比和補(bǔ)充。冠突散囊菌的檢驗(yàn)方法依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15-2016）[4]。但該法中采用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件并非冠突散囊菌的最適生長條件，且取樣方法并不能準(zhǔn)確地體現(xiàn)茶葉中冠突散囊菌的實(shí)際含量，對冠突散囊菌的檢測針對性也不強(qiáng)。所以在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）所規(guī)定的檢驗(yàn)方法上加以改進(jìn)，在該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的兩種瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加更適于真菌培養(yǎng)的察氏培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基方面的對比方案。綜上，本文旨在研究冠突散囊菌在3種培養(yǎng)基，即孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基上的生長情況，并且將傳統(tǒng)五點(diǎn)法取樣和對角線五點(diǎn)法取樣兩種取樣方法對冠突散囊菌生長的影響進(jìn)行對比。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

14批次茯磚茶樣品均來自陜西市場市售，編號為01～14。茯磚茶樣品的采集和制備過程均符合《緊壓茶 第3部分:茯磚茶》（GB/T 9833.3—2013）[5]中對茯磚茶感官品質(zhì)、理化指標(biāo)、衛(wèi)生指標(biāo)等的要求。

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基均來自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；霉菌培養(yǎng)箱為上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司生產(chǎn)的MJ-250BSH-Ⅱ型環(huán)保型霉菌培養(yǎng)箱，該型培養(yǎng)箱溫度波動(dòng)范圍為±0.5 ℃，滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）對培養(yǎng)箱溫度波動(dòng)范圍不大于±1 ℃的要求；均質(zhì)器采用寧波新芝生物科股份有限公司生產(chǎn)的SCIENTZ-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；電子天平、無菌吸管、無菌試管、恒溫水浴箱和顯微鏡等其他試驗(yàn)設(shè)備和材料的選擇均滿足《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3種培養(yǎng)基比對

（1）取樣。在研究3種培養(yǎng)基對冠突散囊菌的影響時(shí)，取樣方法統(tǒng)一采用傳統(tǒng)的五點(diǎn)法取樣，即距離茯磚茶四角1 cm處的4個(gè)點(diǎn)取樣、茯磚茶中心點(diǎn)取樣，每個(gè)點(diǎn)取樣5 g左右。

（2）稀釋和培養(yǎng)。檢測方法依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）。稱取25 g樣品，加入225 mL無菌生理鹽水，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min制成10-1的樣品勻液。取1 mL 10-1的樣品勻液注入含有9 mL無菌生理鹽水的試管中，在旋渦混合器上混勻，即為10-2的樣品勻液，依次稀釋得到10-3、10-4、10-5樣品勻液。選擇10-3、10-4、10-5樣品勻液，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL于2個(gè)無菌平皿內(nèi)，同時(shí)分別取1 mL無菌生理鹽水加入2個(gè)無菌平皿作空白對照。由于要比對3種培養(yǎng)基，每個(gè)稀釋度應(yīng)做3份樣液。加樣完成后，及時(shí)將20～25 mL冷卻至46 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻，待凝固后置（28±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第3 d開始每天觀察并記錄結(jié)果直至培養(yǎng)至第5 d，選取菌落數(shù)在10～150 CFU的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.2 兩種取樣方法比對

在研究兩種取樣方法的影響時(shí)，培養(yǎng)基統(tǒng)一采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基。分別采用傳統(tǒng)五點(diǎn)法和對角線五點(diǎn)法取樣，傳統(tǒng)五點(diǎn)法的取樣過程見1.2.1（1）。對角線五點(diǎn)法的取樣過程為選取茯磚茶茶體矩形的任一條對角線（本文統(tǒng)一選取左對角線）在其上均勻選取五點(diǎn)進(jìn)行取樣，每個(gè)點(diǎn)取樣5 g左右，其中首尾兩點(diǎn)須距離茯磚茶兩角1 cm。稀釋和培養(yǎng)的步驟見1.2.1（2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基比對

由表1可知，根據(jù)14組樣品的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上所培養(yǎng)的冠突散囊菌菌落計(jì)數(shù)相差不大，而在察氏培養(yǎng)基所培養(yǎng)的菌落計(jì)數(shù)則普遍結(jié)果更大。此外，察氏培養(yǎng)基不僅計(jì)數(shù)結(jié)果偏大，其上的“金花”形態(tài)較孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上的也要更大，形態(tài)更加不規(guī)則，不便于冠突散囊菌菌落的計(jì)數(shù)。孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基是常用的霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，而察氏培養(yǎng)基則常用于霉菌、真菌的鑒定。根據(jù)對3種培養(yǎng)基上菌落計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)和菌落形態(tài)的分析，察氏培養(yǎng)基不適合作為冠突散囊菌菌落的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，而孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基則均比較適合作為冠突散囊菌菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。

表1 3種培養(yǎng)基所測冠突散囊菌含量

2.2 取樣方法比對

由表2可知，即使取樣方法同為傳統(tǒng)五點(diǎn)法或同為對角線五點(diǎn)法，依然存在同一檢驗(yàn)員檢測數(shù)據(jù)重復(fù)性較差、同一組樣品結(jié)果不一致且不呈現(xiàn)任何規(guī)律性的問題。一些茯磚茶樣品從外觀上來看，“金花”菌落分布不均勻，且無論采取傳統(tǒng)五點(diǎn)法還是對角線五點(diǎn)法均存在取樣不均勻的問題。“金花”菌落位于茯磚茶的磚面和磚底的中部，磚表面1 cm區(qū)域通常沒有或極少有“金花”菌落的生長，故取樣位置不正確，極易造成冠突散囊菌菌落漏檢或菌落計(jì)數(shù)檢測不準(zhǔn)確[6]。這一點(diǎn)對于規(guī)格較小的茯磚茶茶體樣品（定義為重量低于100 g的樣品），無論傳統(tǒng)五點(diǎn)法和對角線五點(diǎn)法都存在取樣困難、檢測準(zhǔn)確度低的問題。

表2 2種取樣方法所測冠突散囊菌含量

2.3 操作要點(diǎn)分析

茯磚茶茶體樣品中冠突散囊菌菌落計(jì)數(shù)的檢測采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）。采用該標(biāo)準(zhǔn)在操作時(shí)需要注意的事項(xiàng)有：①必須用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1～2 min，不可僅手動(dòng)搖勻；②梯度稀釋時(shí)每個(gè)稀釋度的試管必須在渦旋混勻儀上混勻5～8 s，不可僅手動(dòng)搖勻。這是因?yàn)闃悠啡舨痪|(zhì)或混勻，冠突散囊菌的孢子無法充分釋放到稀釋液中，易造成檢測結(jié)果菌落數(shù)偏低或偏高，菌落計(jì)數(shù)檢測結(jié)果失真。

3 結(jié)論

綜上，察氏培養(yǎng)基不適合作為冠突散囊菌菌落計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基，而取樣方法對冠突散囊菌菌落計(jì)數(shù)的影響不明顯，且受到取樣人員手法、茯磚茶樣品菌落分布不均勻等因素的影響較大。