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    基因工程中載體概述

    2022-10-13 09:54:54盛曹穎
    中學(xué)生物學(xué) 2022年8期
    關(guān)鍵詞:噬菌體宿主染色體

    盛曹穎

    (吳江高級中學(xué) 江蘇蘇州 215200)

    在基因工程中,外源基因自身很難進入宿主細(xì)胞,且在宿主細(xì)胞內(nèi)不能進行正常擴增、表達,許多載體便應(yīng)運而生??茖W(xué)家根據(jù)其完成的不同生物學(xué)效應(yīng),將其分為以下幾種:①克隆載體(cloning vector),又稱一般載體,一般在宿主外不能存活,有能自我復(fù)制、分子量小、拷貝數(shù)多等特點,主要用于擴增外源DNA片段;② 表達載體(expression vector),一般具有高強度的啟動子和核糖體的結(jié)合序列,能高效地產(chǎn)生較穩(wěn)定的mRNA,主要用于外源DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的高效表達;③穿梭載體(shuttle vector),可用于不同生物間復(fù)制。

    在這些載體中,克隆載體是最常見的載體,在基因工程中占有十分重要的地位。目前,科學(xué)家已構(gòu)建和應(yīng)用的克隆載體有數(shù)千種。根據(jù)其構(gòu)建所用的DNA來源,克隆載體可分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體載體等。

    1 質(zhì)粒載體

    質(zhì)粒(Plasmid)是人們廣泛應(yīng)用的克隆載體。它是細(xì)菌和真菌等細(xì)胞內(nèi)獨立存在的一種環(huán)狀DNA分子。幾乎所有的質(zhì)粒都帶有一個或多個基因。質(zhì)粒不影響宿主細(xì)胞的生存,但其帶有特殊功能的基因可以賦予宿主細(xì)胞某些抵御外界不利環(huán)境因素的特性。

    1.1 質(zhì)粒的生物學(xué)特性

    1.1.1 質(zhì)粒的復(fù)制

    幾乎所有的質(zhì)粒都含有復(fù)制起點。質(zhì)粒侵染宿主細(xì)胞后,不同質(zhì)粒復(fù)制的方式不同。根據(jù)是否攜帶一套促進DNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因(稱為基因),質(zhì)粒分為整合型質(zhì)粒和非整合型質(zhì)粒。整合質(zhì)??梢哉系剿拗骷?xì)胞染色體的DNA上進行復(fù)制,而非整合質(zhì)粒依賴于自身或宿主細(xì)胞體內(nèi)編碼的酶進行自主復(fù)制而實現(xiàn)擴增,具體過程如圖1所示。

    圖1 非整合質(zhì)粒和整合質(zhì)粒的復(fù)制過程模式圖

    1.1.2 質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù)

    質(zhì)粒的大小一般在1~250 kb之間。但是,科學(xué)家發(fā)現(xiàn)一般小于10 kb的質(zhì)粒才適合用于構(gòu)建克隆載體,而大的質(zhì)粒經(jīng)過一定的改造后亦可用于基因克隆。質(zhì)粒拷貝數(shù)是指在某一生物組中能夠找到質(zhì)粒的分子數(shù),目前對控制拷貝數(shù)的因素尚未了解,但發(fā)現(xiàn)每個質(zhì)粒具有的拷貝數(shù)在1~800之間。一般來說,一個可以應(yīng)用于實踐的克隆載體需要以大量的拷貝形式存在于細(xì)胞中,才能夠獲得大量的重組DNA。表1列出了幾種常用質(zhì)粒的大小與拷貝數(shù)的關(guān)系。

    表1 常用質(zhì)粒載體大小與拷貝數(shù)的關(guān)系

    1.1.3 質(zhì)粒的不相容性

    質(zhì)粒的不相容性是指利用同一復(fù)制系統(tǒng)的兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。其原因主要是在同一細(xì)胞中復(fù)制時,一般不相容的質(zhì)粒具有相同的復(fù)制子,會存在競爭,從而隨機被淘汰,導(dǎo)致在子細(xì)胞中只存在其中一種質(zhì)粒。

    1.1.4 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性

    質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性是指在自然條件下,質(zhì)粒通過細(xì)菌接合作用可以轉(zhuǎn)移到新宿主細(xì)胞內(nèi)。有些質(zhì)粒(如質(zhì)粒pBR322)本身不能進行結(jié)合轉(zhuǎn)移,但含有轉(zhuǎn)移起始位點nic,借助于第三個質(zhì)粒(如ColK)編碼的轉(zhuǎn)移蛋白的作用,通過結(jié)合質(zhì)粒來進行轉(zhuǎn)移?;虿僮髦锌梢栽诓煌膹?fù)制單位上放入轉(zhuǎn)移必需的因子,通過順反互補來控制目的質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移。

    1.2 質(zhì)粒載體的種類

    按照不同的方式,質(zhì)粒分類不同。質(zhì)粒的基因所決定的主要特征是天然存在的質(zhì)粒最主要的分類依據(jù)。根據(jù)這一分類方法,質(zhì)粒可分為以下5種:①致育質(zhì)粒,又稱F質(zhì)粒,僅攜帶轉(zhuǎn)移基因,只具有促進質(zhì)粒間有性接合轉(zhuǎn)移的特征,如大腸桿菌中的F質(zhì)粒;②藥性質(zhì)粒,又稱R質(zhì)粒,攜帶有能夠賦予宿主細(xì)菌對某一種或多種抗菌劑的耐藥性基因,如抗氯霉素、氨芐青霉素或水銀;③Col質(zhì)粒,編碼一種能夠殺死其他細(xì)菌的大腸桿菌素蛋白,如大腸桿菌的ColE1質(zhì)粒;④降解質(zhì)粒,使宿主菌能夠代謝一些通常情況下無法利用的甲苯、水楊酸等分子,如惡臭假單胞菌中的TOL質(zhì)粒;⑤毒性質(zhì)粒,賦予宿主菌致病性,如根瘤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒,能夠在雙子葉植物中誘導(dǎo)冠癭瘤。

    1.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建

    由于野生質(zhì)粒往往存在許多缺陷,因此目前使用的質(zhì)粒載體大多是人工構(gòu)建的。每種質(zhì)粒的構(gòu)建思路和過程都十分相似,都是根據(jù)基因工程的需要,除去一些非必需元件,添加一些必需的元件,使其成為一種帶有多個單一限制酶切位點、多種強選擇標(biāo)記、低分子質(zhì)量、高拷貝、易于轉(zhuǎn)化、無感染性等優(yōu)點的理想載體。

    1.4 質(zhì)粒載體的應(yīng)用

    由于這類載體可以在細(xì)胞內(nèi)維持較高的拷貝數(shù),有利于擴增外源DNA,所以具有非常廣泛的應(yīng)用。例如,早期的pBR系列載體以及現(xiàn)在實驗室常用的Takala公司的pMD18-T載體等。這些載體可以把經(jīng)過PCR擴增或經(jīng)聚合酶處理3′末端加A的未知序列的DNA片段直接通過T-A克隆的方法插入載體,為載體構(gòu)建和未知DNA序列的鑒定提供了更加簡潔的解決方案。

    2 噬菌體載體

    與質(zhì)粒相比,噬菌體結(jié)構(gòu)要復(fù)雜些,雖然它們均可用于克隆和擴增特定的DNA片段,但是利用噬菌體感染細(xì)胞比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞更為有效,且克隆容量也明顯大于質(zhì)粒,已成為一種不可或缺的基因載體。

    2.1 噬菌體載體的生物學(xué)特性

    噬菌體是一類細(xì)菌病毒的總稱,不同種類的噬菌體顆粒在形態(tài)結(jié)構(gòu)上差別很大,其感染性強,依賴于細(xì)菌宿主細(xì)胞才能進行生長、繁殖。

    2.2 噬菌體載體的種類

    目前使用的噬菌體載體主要分為:①λ噬菌體衍生物,是最早使用的克隆載體,分為插入型載體和置換型載體兩類。②柯斯質(zhì)粒,是λ噬菌體cosDNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制原點DNA序列重組而成,具有兩種載體的優(yōu)點。③單鏈M13噬菌體,作為單鏈DNA載體,可用于基因定位誘變以及單鏈DNA探針制備。

    2.3 噬菌體載體的構(gòu)建

    由于野生型的噬菌體DNA中含有較多的限制位點,不適合作為基因克隆的載體。因此,構(gòu)建噬菌體載體時需要切除多余的限制位點以及非必需的區(qū)段,才能將其改造成適用的克隆載體。不同的噬菌體載體構(gòu)建方式不同,λ噬菌體衍生物主要集中在消除多余的限制性酶切位點和去除λDNA中一些對其生命周期無關(guān)的非必需區(qū)段;單鏈M13噬菌體先插入一個大腸桿菌的lac操縱子片段和選擇標(biāo)記,再加入多克隆位點MCS。

    2.4 噬菌體載體的應(yīng)用

    噬菌體載體主要用于建立cDNA文庫,具體過程是先將某種生物的一系列cDNA分子先通過置換或插入的方法與合適的噬菌體載體重組,或不經(jīng)過包裝直接轉(zhuǎn)染受體菌細(xì)胞,或在體外包裝成噬菌體顆粒后轉(zhuǎn)導(dǎo)受體菌細(xì)胞。這樣所形成的噬菌斑群體就是該生物個體的cDNA基因。除此之外,噬菌體載體還可用于克隆外源目的基因,在生化和遺傳學(xué)研究中有著非常廣泛的應(yīng)用。

    3 病毒載體

    3.1 病毒載體的生物學(xué)特性

    病毒復(fù)雜而精致的結(jié)構(gòu)可以高效轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制和表達,這是作為載體的基礎(chǔ)。在外源基因?qū)胝婧耸荏w細(xì)胞的各種方法中,最為常用的便是利用病毒載體感染宿主細(xì)胞的途徑,不同的病毒載體具有不同的表達特點。目前常用的介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的病毒有腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和痘病毒等。

    3.2 病毒載體的種類

    病毒表達載體大體可分為病毒顆粒載體(插入外源性DNA后,隨病毒的繁殖進行復(fù)制和表達)和改建的病毒DNA混合型載體(不能形成病毒顆粒,重組體在真核細(xì)胞內(nèi)像質(zhì)粒一樣隨宿主細(xì)胞的基因復(fù)制而復(fù)制)。其中后者是目前廣泛使用的。

    3.3 病毒載體的構(gòu)建

    目前,科學(xué)家已研究出多種病毒載體,特別是腺病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,其構(gòu)建過程首先對病毒的基因組進行改造,使之能攜帶相關(guān)的病毒元件和外源基因,之后包裝成重組病毒載體,進行侵染。

    3.4 病毒載體的應(yīng)用

    由于病毒載體可以介導(dǎo)外源基因在真核細(xì)胞中高效表達,可以用于實驗室基礎(chǔ)研究,如建立特定基因瞬時或穩(wěn)定表達的細(xì)胞系,也可以表達治療性基因用于臨床基因治療,如治療Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥和B型血友病。

    4 人工染色體載體

    4.1 人工染色體載體的生物學(xué)特性

    當(dāng)克隆基因組非常龐大的人類基因組等真核生物基因組時,往往需要克隆幾百甚至數(shù)十萬堿基對的DNA片段。此時,克隆載體需要具備更大的承載量,科學(xué)家便建構(gòu)了人工染色體載體。人工染色體載體具備著絲粒、端粒和復(fù)制起始區(qū)域三種必需成分,才能保證其能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地自主復(fù)制、分離,并隨細(xì)胞分裂平均分配到兩個子細(xì)胞中,從而保證人工染色體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性。

    4.2 人工染色體載體的種類

    人工染色體載體含有天然染色體基本功能單位,目前科學(xué)家已開發(fā)出多種類型的人工染色體載體,實驗室常用酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)、人類人工染色體(HAC)等。

    4.3 人工染色體載體的構(gòu)建

    不同種類的人工染色體載體的構(gòu)建不同,但是大體原理相同,如將細(xì)菌接合因子、酵母或人類染色體DNA上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)、端粒區(qū)與質(zhì)粒裝配在一起。

    4.4 人工染色體載體的應(yīng)用

    人工染色體載體主要應(yīng)用于基因分離、基因組圖譜制作以及基因組序列分析,并且在基因治療領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。例如,基因治療過程中,較大的外源DNA片段和人工染色體重組成功后,通過電穿孔技術(shù)導(dǎo)入宿主細(xì)胞,重組體在宿主細(xì)胞內(nèi)作為一條獨立的染色體進行復(fù)制和分裂,并在宿主細(xì)胞中表達出正常功能的蛋白,以治療由于基因缺陷或基因突變導(dǎo)致的遺傳疾病。

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