魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測測量不確定度評定

段洪峰

(淮南市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，安徽淮南 232000)

喹諾酮類藥物(quinolones)，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，其發(fā)展迅速，目前已有四代產(chǎn)品。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性、毒副作用小、組織穿透力強、結(jié)構(gòu)簡單、給藥方便等特點，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，主要作用是促進(jìn)畜禽和魚類生長以及預(yù)防治療疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用于疾病防治，由于缺乏相應(yīng)的科學(xué)理論指導(dǎo)，長期不合理使用這類抗菌藥，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，在動物體內(nèi)積累產(chǎn)生一定的殘留，對人體健康構(gòu)成威脅，若長期食用被此類藥物殘留物染的食品，可能誘導(dǎo)人類病原微生物產(chǎn)生耐藥性和抗藥性，嚴(yán)重時，會對食用者產(chǎn)生直接毒性及潛在“三致”(致癌、致畸、致突變),從而影響該類藥物的臨床療效，控制喹諾酮類藥物在水產(chǎn)品中的殘留至關(guān)重要。因此，檢測水產(chǎn)品中喹諾酮類獸藥殘留并保證結(jié)果的可靠性十分重要，那么評定其不確定度就具有重要意義。目前常用的檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星能更加準(zhǔn)確的定量。

測量不確定度作為測量結(jié)果的一部分，合理表征了被測量值的分散性，對測量結(jié)果的可信性、可比性和可接受性都有重要影響，是評價測量活動質(zhì)量的重要指標(biāo)。該試驗采用農(nóng)業(yè)部1077號公告-1—2008方法對魚肉樣品中4種喹諾酮類獸藥殘留進(jìn)行檢測，待測草魚樣品來源于淮南市2021年風(fēng)險監(jiān)測抽樣。

1 材料與方法

PL602E、XA205DU電子天平(梅特勒-托利多)；I-Class XEVOTQ-Micro超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星液標(biāo)混標(biāo)，氘代環(huán)液沙星、氘代恩諾沙星內(nèi)標(biāo)混標(biāo)(天津阿爾塔)。

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋。準(zhǔn)確吸取環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星100 μg/mL的液標(biāo)混標(biāo)儲備液1 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度線配制成1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液A，再吸取A液1 mL置于10 mL容量瓶中配制成0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液B；用同樣的方法將內(nèi)標(biāo)混標(biāo)儲備液稀釋成1 μg/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液；吸取一定量的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液分別加入空白樣品中，經(jīng)過前處理上機(jī)得到濃度為5、10、20、50、100、200 ng/mL的工作曲線。

樣品前處理。稱取(5.00±0.02)g魚肉樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混合30 s，避光放置10 min,加入5 g無水硫酸鎂，渦旋混勻，再加入20 mL酸化乙腈，渦旋混合1 min,超聲提取10 min;7 000 r/min 離心5 min，取上清液于125 mL梨形瓶中。殘渣再重復(fù)提取一次，合并2次提取液，于40 ℃旋蒸至干。加1.0 mL甲醇溶液溶解殘留物并過0.2 μm濾膜，最后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

測定結(jié)果由儀器工作站按內(nèi)標(biāo)法自動計算，樣品中喹諾酮類獸藥殘留量按公式(1)計算。所有的數(shù)據(jù)均按照《數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定》方法進(jìn)行修約。

(1)

式中，為樣品中待測組分的含量(μg/kg)；為測定液中待測組分的濃度(ng/mL)；為樣品定容體積(mL)；為樣品稱樣量(g)。

2 結(jié)果與分析

依據(jù)JJF 1059.1—2012，評估不確定度時，應(yīng)該是集中精力分析貢獻(xiàn)最大的不確定度分量，然后合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，給出擴(kuò)展不確定度，最后準(zhǔn)確表述檢測結(jié)果。對檢測和校準(zhǔn)結(jié)果測量不確定度來源的識別應(yīng)從分析測量過程入手，即對測量方法、測量系統(tǒng)和測量程序進(jìn)行詳細(xì)研究。該試驗不確定度來源主要有樣品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液、方法回收率、樣品定容、結(jié)果重復(fù)性以及最小二乘法擬合曲線引入的不確定度，將所有不確定度來源進(jìn)行整理，然后再逐個進(jìn)行分析。魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測的不確定度來源如圖1所示。

圖1 不確定度來源Fig.1 Sources of uncertainty

標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定度來源主要有標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋和標(biāo)準(zhǔn)溶液添加。

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋引入的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行兩級稀釋，用到100、10 mL容量瓶以及1 000 μL移液槍，不確定度來源主要有容量瓶和移液槍的校準(zhǔn)、溫度、重復(fù)性，不確定度分量如下。

100 mL容量瓶引入的不確定度。

(2)溫度變化引入的不確定度。容量瓶檢定溫度為22 ℃，實驗室溫度變化為±4 ℃，甲醇的膨脹系數(shù)為0.001 24，甲醇的體積變化△=±0.496 mL，按矩形分布，則溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.290 mL。

(3)重復(fù)性引入的不確定度。10次重復(fù)稱量得到標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.023 mL，則重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.023 mL。

100 mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.290 mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.002 9。

10 mL容量瓶引入的不確定度。計算過程同“...”，容量允差為±0.020 mL，校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.008 mL，溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.029 mL，10次重復(fù)稱量得到標(biāo)準(zhǔn)偏差0.003 mL，重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.003 mL，則10 mL容量瓶引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.030 mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.003 0。

標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的不確定度。用50、200 μL移液槍添加6個濃度點繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，不確定度來源主要有校準(zhǔn)、重復(fù)性、溫度;按矩形分布，計算過程同“..”，標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度(add)=0.046 0。

樣品定溶液為3%甲醇水溶液，用1 000 μL移液槍移取，計算過程同“..”；校準(zhǔn)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=5.8 μL，溫度變化引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=4.7 μL，重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=1.4 μL，則樣品定容引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=7.6 μL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為(V)=0.007 6。

在重復(fù)性條件下對樣品進(jìn)行9次獨立測試，采用貝塞爾公式法計算標(biāo)準(zhǔn)不確定度，測試結(jié)果及不確定度如表2～3所示。

表1 各組分的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表2 重復(fù)測量結(jié)果

表3 各組分的不確定度

采用6個濃度點各測定一次，用最小二乘法擬合成直線得到不同濃度的響應(yīng)值()的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線=+C，由于內(nèi)標(biāo)峰面積參與響應(yīng)值計算，故不考慮內(nèi)標(biāo)的不確定度，具體數(shù)據(jù)如表4所示。計算公式如下：

表4 最小二乘法擬合曲線的不確定度

接下表

計算合成各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式如下：

利用合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和結(jié)果的平均值計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度()，擴(kuò)展不確定度=()×，采用置信概率為95%，包含因子=2，結(jié)果表述如表5。

表5 樣品的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3 結(jié)論與討論

在日常檢測活動中評定不確定度是必不可少的，目的是為了評價測量結(jié)果的可靠性，能更加直觀地發(fā)現(xiàn)整個試驗過程中影響測量結(jié)果的各類因素，通過分析各類因素的測量不確定度對試驗的各個部分進(jìn)行補充、優(yōu)化，從而降低各不確定度分量給結(jié)果帶來的影響，讓測量結(jié)果更加準(zhǔn)確。魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測試驗采用的是空白基質(zhì)添加曲線，然后再用與樣品相同的前處理方法進(jìn)行處理，用這種方式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線可以盡可能減小樣品前處理、基質(zhì)等帶來的誤差影響，使測量結(jié)果更加準(zhǔn)確；與大多數(shù)用溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗的不確定度評定有所不同，魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測測量不確定度評定增加了標(biāo)準(zhǔn)曲線添加所引入的不確定度，最后通過觀察所有的不確定度分量的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的不確定度帶來的影響不容忽視，說明評定標(biāo)準(zhǔn)曲線添加引入的不確定度是有必要的。影響測量結(jié)果的不確定度分量不僅只有魚肉中喹諾酮類獸藥殘留檢測測量不確定度評定中計算的最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率以及標(biāo)準(zhǔn)溶液等，還有很多其他因素對測量結(jié)果能產(chǎn)生影響，如抽樣、樣品制備、凈化時間、儀器設(shè)備等，將來都應(yīng)該要納入不確定度的評定中。