通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肝中19種磺胺類獸藥殘留

王展華，王一涵，施 貝，張文萍，朱蕾穎，張翀宇

(國家市場監(jiān)管重點實驗室(功能食品質(zhì)量與安全領(lǐng)域)，浙江省市場局重點實驗室(保健品質(zhì)量安全重點實驗室)，浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052)

磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)是一種以對位氨基苯磺酰胺(簡稱磺胺)為基本結(jié)構(gòu)的藥物?；前奉愃幬锞哂锌咕V廣、抗菌能力強、毒性小、易吸收、價格便宜等優(yōu)點。由于磺胺藥的抗菌機理為抑制微生物生長，高投藥量能夠明顯增加抑菌效果，為了達到抑菌效果，養(yǎng)殖戶在實際使用中存在濫用磺胺類藥物的現(xiàn)象?；前奉愃幬锿ㄟ^食品鏈進行富集，會導(dǎo)致消費者產(chǎn)生過敏反應(yīng)、腎臟損害、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道反應(yīng)。為了保障我國人民的食品安全，目前我國國家標準GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了動物源性食品中磺胺總量的最高殘留不得高于100 μg/kg。

目前用于動物性食品中磺胺類藥物殘留檢測的方法主要有液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)。近年來，液相質(zhì)譜聯(lián)用法因其檢出限度低、定量定性準確，成為動物源性食品中獸藥殘留檢測應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。用于液相質(zhì)譜聯(lián)用法檢測的樣品前處理技術(shù)主要有液液萃取、固相萃取。其中固相萃取又分為基質(zhì)分散固相萃取、吸附-洗脫式固相萃取、通過式固相萃取?；|(zhì)分散固相萃取主要用于簡單基質(zhì)的凈化，用于動物源性樣品凈化需要使用專用增強型脂質(zhì)型凈化材料，檢測成本較高，而且按樣品性質(zhì)按比例配制凈化材料用量，對于不同基質(zhì)的樣品通用性不強。吸附-洗脫式固相萃取是目前應(yīng)用最廣泛的固相萃取凈化技術(shù)，在動物源性藥物殘留的檢測中，通常使用水相提取溶液，凈化需經(jīng)過固相萃取柱活化、上樣、淋洗、洗脫等步驟，由于動物源樣品的水相提取液中會含有游離脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，在上樣、淋洗、洗脫步驟中極易堵塞固相萃取柱，導(dǎo)致試驗時間延長和樣品回收率不穩(wěn)定。通過式固相萃取是一種新型的固相萃取技術(shù)，在直接上樣、接收的同時又能夠有效保證去除基質(zhì)干擾，有效地解決了常規(guī)吸附-洗脫式固相萃取、步驟煩瑣、耗時長的缺點。筆者選取日常監(jiān)督抽檢中需要檢測的19種磺胺類藥物，以基質(zhì)較為復(fù)雜的豬肝為研究基質(zhì)，建立通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肝中19種磺胺類獸藥殘留的方法，并完成方法的穩(wěn)定性和適應(yīng)性的研究，以期滿足日常監(jiān)督抽檢中動物源性食品中磺胺類藥物快速檢測的需要，同時對動物源性磺胺類藥物殘留檢測標準制定和更新具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

試劑。標準品：乙?；前?純度99.0%)、磺胺吡啶(純度99.0%)、磺胺嘧啶(純度99.0%)、磺胺甲噁唑(純度99.6%)、磺胺噻唑(純度99.5%)、磺胺甲嘧啶(純度99.5%)、磺胺二甲異噁唑(純度99.8%)、磺胺甲噻二唑(純度99.4%)、苯甲?；前?純度99.3%)、磺胺二甲異嘧啶(純度99.0%)、磺胺甲氧噠嗪(純度99.2%)、磺胺氯噠嗪(純度99.1%)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(純度98.0%)、磺胺間二甲氧嘧啶(純度99.5%)、磺胺苯吡唑(純度99.8%),德國Dr.Ehrenstorfer公司；磺胺對甲氧嘧啶(純度99.5%)、磺胺間甲氧嘧啶(純度97.5%)，中國食品藥品檢定研究院；磺胺二甲嘧啶(純度100.0%)，中國藥品生物制品檢定所；酞磺胺噻唑(純度99.7%)，北京安譜公司。磺胺類藥物混合標準儲備液(濃度100 mg/L)，北京曼哈格公司。甲醇、乙腈(質(zhì)譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國sigma 公司)；ProElut PLS-A(200 mg，6 mL)固相萃取柱(北京迪馬公司)；Waters Acquity BEH C色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美國Waters公司)；0.22 μm PTFE過濾頭(美國Agilent公司)。

試材。豬肝樣品購于浙江省內(nèi)不同農(nóng)貿(mào)市場。

儀器與設(shè)備。Shimadzu LC-30A高效液相色譜儀(日本島津公司)；SCIEX Triple Quad 5500-QTRAP Activated質(zhì)譜儀(美國ABSciex公司)；Milli-Q超純水儀(德國默克密理博公司)；LYNX 6000 超速離心機(美國熱電公司)；XPE205分析天平(瑞士梅特勒公司)；MultiReax多通道旋渦混合器(德國Heidolph公司)。

標準溶液的配制。

磺胺類藥物單標標準儲備液的配制。準確稱取乙?；前?、磺胺吡啶等19種標準品分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解后定容，配成1 mg/mL的磺胺類藥物儲備液，在-18 ℃冷凍保存。

磺胺類藥物單標標準工作液的配制。分別精密移取25 μL標準儲備液，用初始流動相稀釋至50 mL，配成500 μg/L的磺胺類藥物中間液，使用時，分別精密移取各單標中間液用初始流動相稀釋至所需濃度。

磺胺類藥物標準混合工作液的配制。精密量取100 μL 磺胺類藥物混合標準儲備液，用初始流動相稀釋至10 mL，配成1 mg/L磺胺類藥物中間液，使用時，分別精密移取適量的中間液，用空白基質(zhì)稀釋至所需質(zhì)量濃度，配制成混合標準工作液。

樣品前處理。精密稱取5 g均質(zhì)后的試樣于50 mL離心管中，加入乙腈-水(=80/20)20.0 mL，超聲提取10 min后，于MultiReax多通道旋渦混合器中渦旋提取30 min，6 000 r/min 高速離心20 min，取4.0 mL上清液過ProElut PLS-A固相萃取柱后，用2.0 mL乙腈-水(=80/20)淋洗，收集全部流出液。將全部流出液45 ℃下氮吹近干，1.0 mL甲醇-乙腈-水混合溶液(=1/1/18)復(fù)溶，復(fù)溶液使用0.22 PTFE過濾頭過濾至進樣瓶，待測。

色譜質(zhì)譜條件。

色譜條件。島津LC-30AD超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Applied Biosystems Qtrap 5500三重四級桿質(zhì)譜儀，包括二元泵，在線脫氣，自動進樣器；色譜柱為Waters Acquity BEH C(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫35 ℃；流動相為0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液(=1/1)(B)；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B，2～8 min，10%～80%B，8～11 min，80%～10%B；流速0.35 mL/min；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件。離子源為TurboV 電噴霧(ESI)離子源；電離方式為正離子；霧化電壓(IS)5 500 V；離子源溫度(TEM)500 ℃；霧化氣壓力(GS1)275.79 kPa；輔助加熱氣壓力(GS2)275.79 kPa；碰撞室入口電壓(EP)10 V；碰撞室出口電壓(CXP)13 V；碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)、定性離子對、定量離子對見表1。

表1 磺胺類藥物保留時間、定性、定量離子對及碰撞電壓和去簇電壓

接下表

2 結(jié)果與分析

分離色譜柱的選擇。選擇ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)進行分離試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)進行分離時，3種同分異構(gòu)體(磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶)在該色譜柱不能得到很好分離；而使用Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱，3種同分異構(gòu)體分離良好且峰型良好，響應(yīng)較高。Waters ACQUITY UPLC BEH-C屬于端基封尾的色譜柱，可以改善峰形，且耐受pH也更廣。因此，該研究最終選擇Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱作為分離柱。

液相色譜條件的優(yōu)化。在現(xiàn)有液相色譜檢測磺胺類藥物的研究方法中均采用了甲醇、乙腈為有機相和0.1%甲酸水為水相，該研究對比了甲醇+0.1%甲酸水、乙腈+0.1%甲酸水，發(fā)現(xiàn)在有機相為乙腈的情況下，磺胺對甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺間甲氧嘧啶這3個同分異構(gòu)體無法有效分離，而有機相為甲醇時，磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡唑等出峰時間較晚，最終采用了0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸甲醇-乙腈混合溶液(=1/1)(B)，在此流動相條件下19種物質(zhì)均能很好的分離。該研究進一步對梯度洗脫條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)待測目標物均良好分離，多反應(yīng)監(jiān)測提取離子流圖見圖1。

磺胺類藥物適合在電噴霧離子源(ESI)的正離子模式下進行檢測，使用500 μg/L的磺胺類藥物中間液，使用Analysis軟件在正離子模式掃描下，根據(jù)相應(yīng)物質(zhì)的分子量確定一級質(zhì)譜的掃描范圍，分別進行一級質(zhì)譜掃描找到母離子，進行二級質(zhì)譜掃描確定出2～3個相應(yīng)較高的子離子，最后通過多反應(yīng)檢測掃描優(yōu)化相應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化結(jié)果見表1。

該研究選取了ProElut PLS-A(200 mg，6 mL)和ProElut PLS(200 mg，6 mL)2種固相萃取柱進行了比較凈化，其中ProElut PLS(200 mg，6 mL)固相萃取柱是國家標準GB 31658.17—2021中推薦使用的親水親脂平衡固相萃取柱，采用的凈化模式是吸附-洗脫模式，該模式在實際操作過程中樣品容易堵塞固相萃取柱，導(dǎo)致試驗時間較長，而ProElut PLS-A采用直接通過模式，無吸附系統(tǒng)過程，縮短了試驗時間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ProElut PLS固相萃取柱對豬肝樣品進行凈化的回收率普遍低于ProElut PLS-A固相萃取柱的樣品。該研究使用ProElut PLS-A固相萃取柱對樣品進行凈化。

磺胺類藥物為極性物質(zhì)，常用的甲醇乙腈對磺胺類藥物均有較好的提取效果。與甲醇相比，乙腈可以有效地沉淀蛋白質(zhì)，且乙腈對糖類和脂肪的溶解度低于甲醇，該研究采用乙腈為提取溶劑。有研究表明，當乙腈水溶液濃度小于60%時無法使蛋白質(zhì)完全變性，而使用純乙腈，樣品外部蛋白質(zhì)快速變性，產(chǎn)生包裹效應(yīng)，使組織內(nèi)部的藥物無法被充分提取。經(jīng)綜合考慮，該研究中采用80%的乙腈水溶液作為提取溶劑。

該研究采用空白基質(zhì)添加標準溶液的峰面積(A)與初始流動相中標準物質(zhì)的峰面積(B)考察基質(zhì)效應(yīng)

圖1 19種化合物的提取離子流圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 19 compounds

(ME)。試驗結(jié)果(圖2)表明，凈化過的樣品依然存在基質(zhì)效應(yīng)，目前消除基質(zhì)效應(yīng)的方法有同位素稀釋和基質(zhì)標準曲線2種方法，在該研究中使用基質(zhì)標準曲線的方法來消除基質(zhì)效應(yīng)。

采用混合標準工作液使用空白基質(zhì)配制成2～80 μg/L的系列標準溶液，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明，磺胺類藥物在豬肝基質(zhì)中在2～80 μg/L線性關(guān)系良好(>099)；在5 g空白豬肝基質(zhì)樣品中加入500 μL混合標準工作液(1 000 μg/L)，理論加標濃度為10.0 μg/kg，按照已建立方法檢測，信噪比>10為定量限，信噪比>3為檢出限。從表2可以看出，該方法的19種磺胺類藥物的定量限遠低于GB 31658.17—2021規(guī)定的標準要求(10 μg/kg)，可滿足日常監(jiān)督檢測的需求。

圖2 19種磺胺類藥物在豬肝臟基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.2 Matrix effects of 19 sulfonamides in porcine liver matrix

表2 19種磺胺類藥物的線性方程、決定系數(shù)、檢出限和定量限

分別選取了3個濃度梯度水平對空白樣品進行加標試驗，每個濃度水平測定6次，計算加標回收率和RSD值，檢驗結(jié)果如表3所示。19種磺胺類藥物在豬肝樣品中的回收率為74.0%～123.2%，RSD均小于10%，表明該方法穩(wěn)定、可靠。

利用建立的方法對杭州市售豬肝樣品20批次進行19種磺胺藥物殘留檢測，測定結(jié)果均為未檢出，說明目前杭州市售豬肝質(zhì)量較好。

3 結(jié)論

該研究建立了通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豬肝中19種磺胺類獸藥殘留的方法。豬肝中19種磺胺類藥物在方法的液相條件下均得到了很好的分離，同時方法采用的通過式ProElut PLS-A固相萃取柱的凈化方法減少了試驗步驟，節(jié)約了樣品處理所需要的時間。經(jīng)試驗方法學驗證，該方法檢出限、回收率、精密度均優(yōu)于現(xiàn)行國家標準，適用于大批量動物源性食品中磺胺類藥物殘留的快速篩查和定量。

表3 19種磺胺類藥物的加標回收率及其RSD(n=6)