普洱茶揮發(fā)性風味物質(zhì)富集與分析技術研究進展

孫嘉卿，馮 濤，王 凱，莊海寧，宋詩清，姚凌云，孫 敏，王化田

(1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南昆明 6502301；3.上海市城建職業(yè)學院，上海 201415)

普洱茶是以云南大葉種曬青毛茶為原料，在地理標志保護范圍內(nèi)采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質(zhì)特征的茶葉。主要產(chǎn)自西雙版納、臨滄、普洱等地區(qū)。按其加工工藝及品質(zhì)特征，普洱茶分為濕熱作用陳化型普洱茶(生茶)，又稱為“后發(fā)酵茶”和渥堆微生物發(fā)酵型普洱茶(熟茶)2種類型。人們對茶葉的嗜好很大程度歸結(jié)于茶中各類揮發(fā)性成分綜合作用的結(jié)果——茶葉的風味物質(zhì)。對茶葉風味物質(zhì)的研究可以直觀地反映茶葉的香氣特征和不同的茶葉香氣之間的差異性。雖然風味物質(zhì)在茶葉中的含量很少，一般只占干物質(zhì)的0.01%～0.02%，但對茶葉品質(zhì)的貢獻率達25%～40%，是決定茶葉品質(zhì)的重要因素。近年來，普洱茶獨特的風味及保健功效也使其普及率越來越高，并于2020年入選中歐地理標志首批保護清單。關于其香氣活性物質(zhì)以及形成機理的研究已經(jīng)成為普洱茶學界研究的熱點課題。但從富集分析的角度看來，不同的技術手段對其風味物質(zhì)的研究影響，尤其是一些新興的技術手段在普洱茶領域的應用，也需要細致的總結(jié)，為普洱茶的生產(chǎn)、質(zhì)控和新產(chǎn)品的研發(fā)提供新的思路。

1 常用的普洱茶風味物質(zhì)富集技術

同時蒸餾萃取技術(simultaneous distillation and extraction,SDE)由于對中等至高沸點成分的物質(zhì)具有高萃取回收率，近年來運用廣泛，但對于強極性或親水性成分如酸性、醇溶性成分萃取效率較低。且SDE對樣品處理中高溫加熱次生反應劇烈，會導致原始普洱茶風味的破壞，尤其對一些熱敏性香氣組分影響較大,且會產(chǎn)生原來樣品中沒有的、加熱產(chǎn)生的后生物，易造成香氣物質(zhì)結(jié)構(gòu)變化；頂空固相微萃取(headspace solidphase microextraction,HS-SPME)與SDE不同，較有利于低沸點的強揮發(fā)性成分，尤其是一些酯類物質(zhì)。不足之處在于萃取纖維頭吸附容量有限，對揮發(fā)性成分的選擇性吸附易導致數(shù)據(jù)分析中香氣組成比例失衡，難以進行定量分析。溶劑輔助風味蒸發(fā)技術(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)的優(yōu)勢在于可以萃取出較大比例的極性揮發(fā)性物質(zhì)，香氣較為自然逼真。低真空度及低冷凝溫度控制能夠?qū)Σ枞~揮發(fā)性組分中低沸點的萜烯類香氣、熱敏性成分、在高溫下易降解的較高沸點的酯類香氣起到較好的保護作用，能對難揮發(fā)成分進行分離剔除，對含有多種不揮發(fā)成分且易發(fā)生凝聚的茶湯基質(zhì)具有較好的香氣分離效果，有利于醇類、脂肪酸類化合物的提取，但相對裝置和清洗較為復雜。表1列舉了一些已有富集方法和特征香氣成分的結(jié)果。

由表1可知，采用目前常用的富集技術得到的普洱熟茶中雜氧化合物含量較高，生茶中的雜氧化合物含量極低，芳樟醇及其氧化物的含量相對較高。由于茶葉風味物質(zhì)含量低微，組成復雜，且在提取過程中易發(fā)生氧化、聚合、縮合、基團轉(zhuǎn)移等復雜的化學反應，所以各種提取方法的定性定量結(jié)果有一定的差別，不同香氣提取方法均存在一定缺陷，有待開發(fā)靈敏度更高，次生反應更小的方法以全面了解普洱茶中的香氣成分。其次，可能由于成本較高，對于普洱茶風味的提取分析，已發(fā)表的研究均只應用SDE或HS-SPME等進行了一次提取分析，較少關注重現(xiàn)性，后面的研究中可嘗試多次試驗提高準確性。

表1 不同富集方法及檢測技術鑒定普洱茶特征香氣成分

2 較有前景的新興富集技術

旋轉(zhuǎn)錐體柱蒸餾技術作為一種高效獨特的液-氣接觸蒸餾技術，主要是通過真空度降低物料沸點，以較低的溫度分離不同沸點的物質(zhì)。具有提取效率高、蒸餾時間短、產(chǎn)物香氣逼真的優(yōu)點，并且可靈活控制萃取的香味物質(zhì)的組成及特性，溫度可調(diào)節(jié)，方便清洗。近年來主要運用在低醇以及無醇飲料的制備。已經(jīng)逐漸受到天然植物香料領域的關注。高陽等首次使用該技術對龍井茶揮發(fā)油進行了提取，并和傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾技術制備的揮發(fā)油在得率、香氣成分、加香效果等方面進行了對比分析，發(fā)現(xiàn)SCC揮發(fā)油得率和鑒定出香氣成分均高于傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法，且香氣更加自然、逼真。在卷煙加香評吸結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，SCC揮發(fā)油能夠增加清新自然的茶香氣息，具有豐滿香氣、細膩柔和煙氣、改善余味的功效，能夠較好地提升卷煙的抽吸品質(zhì)，說明該技術在茶香香原料制備方面具有一定的優(yōu)勢和應用價值。目前雖暫未有采用該技術關于普洱茶的研究，但作為一項全新的蒸餾技術，隨著其理論技術的日益發(fā)展與完善，尤其在揮發(fā)性香氣物質(zhì)分離領域，會成為最有優(yōu)勢的商業(yè)化分離純化技術之一。其流動模式見圖1。

吹掃捕集技術是通過一定時間的吹掃，富集揮發(fā)性香氣成分，通常與熱脫附解吸相連，是利用熱脫附系統(tǒng)將萃取到的物質(zhì)進行熱脫附，然后通過GC-MS進行揮發(fā)性香氣成分的分離定性。具有操作簡單、靈敏度高和無需有機溶劑的特點。主要針對進行低至ppb級的微量揮發(fā)性組分所具有的高度富集作用和定量重現(xiàn)的特征測定，工作示意圖見圖2。蔡泳龍等對烏龍茶進行P&T-TD分析并得到關鍵呈香物質(zhì)；楊環(huán)等采用P&T-TD提取2種不同香型鳳凰單叢茶的香氣成分，發(fā)現(xiàn)P&T-TD法提取得到的成分種類多，不同香型的茶區(qū)別較大。張銘光等采用熱脫附-裂解色譜法測定不同制作工藝、不同存儲時間、不同存放地點的普洱茶色譜指紋圖譜，雖然植物成分受到破壞，但不同的植物都有其特有的裂解指紋信息，同時有些揮發(fā)組分可通過熱脫附解吸，獲得了更豐富的指紋信息。說明P&T-TD法作為一種新的天然產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)分析時的富集方法有很大的運用空間。

圖1 SCC中抽氣和進料液的流動模式Fig.1 Flow patterns of suction and feed liquid in SCC

圖2 吹掃捕集工作示意Fig.2 Schematic diagram of purging and trapping

ICECLES可以被看做是冷凍濃縮(freeze concentration,FC)和攪拌棒吸附(stir bar sorpyive extraction,SBSE)的結(jié)合，作為固相微萃取的改進，適用于濃縮水性樣品中的揮發(fā)性成分，萃取過程如圖3所示。主要有頂空吸附、浸入吸附和浸入頂空混合吸附3種采樣方法，吸附的物質(zhì)可用于溶劑洗脫解吸，也可在熱脫附裝置上進行熱解析，但更好地實現(xiàn)了痕量、超痕量物質(zhì)以及極性和更易揮發(fā)或熱穩(wěn)定差物質(zhì)的富集。Alluhayb等采用該技術對綠茶飲料風味物質(zhì)進行富集，比SBSE多得到56種物質(zhì)，顯示出其較強的風味富集能力。該技術雖暫無在普洱茶領域的應用，但也表明有很好的前景。

3 目前常用的普洱茶風味分析技術

氣相色譜和液相色譜作為風味分析最為主要的手段，已被廣泛應用，該研究主要對以下幾種分析技術進行論述。

圖3 ICECLES的樣品萃取過程Fig.3 Sample extraction process of ICECLES

E-nose作為一種區(qū)別于氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用等儀器，是通過氣體傳感器的相應圖譜識別樣品的揮發(fā)性香氣成分，并應用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對樣品整體揮發(fā)性香氣成分進行分析和評價，其給出的不是被測樣品中某種或某幾種成分的定性定量結(jié)果，而是樣品氣味的整體信息，也稱“指紋”數(shù)據(jù)。具有檢測范圍廣、速度快、前處理簡單方便等優(yōu)點，在氣味識別方面有獨特的優(yōu)勢，目前已被廣泛應用于普洱茶等級、品種的區(qū)分研究中(表2)。

由表2可見，近年來PEN3電子鼻由于其MOS傳感器陣列敏感度高，響應快(<10 s)且傳感器個數(shù)較多(10個)運用最為廣泛。但電子鼻技術仍存在一些不足，如傳感器會受環(huán)

表2 不同型號電子鼻在普洱茶風味領域的應用

境溫濕度等影響，存在隨時間漂移的現(xiàn)象。特征變量的選取以及不同的數(shù)據(jù)處理方法對研究結(jié)果會產(chǎn)生影響，只有當電子鼻與其他分析儀器的數(shù)據(jù)融合分析，數(shù)據(jù)篩選與處理的研究更加多元化、準確化、規(guī)范化，電子鼻才能在普洱茶研究中向著實用化的方向不斷發(fā)展，才可實現(xiàn)更加全方位、多角度的檢測。

GC-O是利用人的鼻子嗅聞經(jīng)氣相色譜柱分離后的各個餾分，以檢測香味樣品的氣味組成的方法。嗅聞后與檢測器鑒定的化學成分對應，對揮發(fā)性成分進行描述分析。GC-O在普洱茶領域的應用見表3，可見GC-O在對風味物質(zhì)香氣分路的歸類方面應用較廣，能夠鑒定出普洱茶主要的風味特征以及對應的風味物質(zhì)，且相比AEDA稀釋法和DF檢測頻率法，主要的檢測方法為時間強度法。

表3 GC-O在普洱茶風味領域的應用

4 新興分析技術

現(xiàn)已有研究將 GC-IMS用在鑒別咖啡豆，快速識別蜂蜜、橄欖油等的不同產(chǎn)地、品種、等級，以及在線監(jiān)測鑒別綠茶、新會柑普茶(新會茶枝柑和普洱茶結(jié)合)風味變化，實現(xiàn)了“風味看得見”。該技術結(jié)合GC的突出分離特點進行定量分析和離子遷移譜儀的高靈敏度、快速響應，具有大氣壓及室溫下即可進行定性分析的優(yōu)勢，有很大的發(fā)展空間。同時若能進一步完善 GC-IMS 的數(shù)據(jù)庫的 VOCs 信息，并將分析結(jié)果與化學計量學方法結(jié)合，則更有利于探明不同種類所研究物質(zhì)的活性化合物。但尚未有針對普洱茶的相關研究文獻。IMS工作原理見圖4。

圖4 IMS工作原理Fig.4 Working principle of IMS

原位電離質(zhì)譜技術是結(jié)合原位離子化技術與質(zhì)譜技術，在敞開式環(huán)境下進行快速離子化的一類質(zhì)譜分析技術。由于其前處理簡單，以及綠色環(huán)保、快速、無損檢測等特點也越來越多地被應用于食品、藥物研究、臨床研究、組學、環(huán)境物質(zhì)、化學品研究等領域。其中實時直接分析(direct analysis in real time，DART)尤其具有實時、超快、耐鹽、兼容機制、廣譜的特征。在茶葉領域，張麗等就利用此方法與質(zhì)譜結(jié)合對不同產(chǎn)地和不同級別的碧螺春紅茶進行分析，發(fā)現(xiàn)茉莉內(nèi)酯、百里香酚、檸檬烯等為其特征香氣成分。Prchalová 等對草藥茶(含茴香、甘菊、蕁麻、椴樹、薄荷、百里香等)中特征化合物如糖苷、黃酮類化合物、酚類和萜類物質(zhì)進行了分析研究。在普洱茶領域也可以利用此技術進行分析鑒定其特征化合物，原位質(zhì)譜離子化范圍見圖5。

風味輪是將茶葉的風味用專業(yè)描述語按類型整理成圓盤形狀(圖6)。李向波等首次將普洱茶風味輪的繪制應用于茶葉感官分析；張穎彬等基于中國茶葉感官審評術語基元語素建立的中國茶葉風味輪，為茶葉感官特征的定性定量研究提供了較為全面和系統(tǒng)的描述語體系。若能在2者基礎上建立考察不同產(chǎn)地、等級、工藝特征、貯藏發(fā)酵條件等各類影響因素的專屬普洱茶的風味輪，將會在普洱茶感官評價角度提供更為全面客觀的評價，彌補普通感官評價準確性的缺乏，使感官評價和交流有可靠的依據(jù)，有助于產(chǎn)品質(zhì)量控制、不同風味形成機理的研究、辨析茶葉區(qū)分優(yōu)劣。

圖5 原位質(zhì)譜離子化范圍Fig.5 Ionization range of in situ mass spectrometry

圖6 擬建立的普洱茶風味輪Fig.6 Flavor wheel of Pu’er tea to be established

5 結(jié)語

隨著新興技術的發(fā)展，對普洱茶風味物質(zhì)的研究將越來越深入。未來的研究中應抓住不同富集方法和分析技術的優(yōu)缺點，針對普洱茶風味物質(zhì)的特性，最大效能地發(fā)揮普洱茶中不同特征風味物質(zhì)在不同領域的應用。同時積極拓寬普洱茶的應用領域和產(chǎn)業(yè)鏈。通過普洱茶與煙草、中醫(yī)藥等方面的結(jié)合以及芳香療法等發(fā)揮普洱茶香氣更大的作用。