采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（配APCI和ESI源）檢測核桃中的井岡霉素

井岡霉素，也被稱為有效霉素，是一種水溶性抗生素，其由吸水鏈霉菌井崗變種而產(chǎn)生，于20世紀(jì)末由上海農(nóng)藥研究所在江西井岡山地區(qū)土壤中采用篩選分離技術(shù)得到[1]。井岡霉素屬于七碳氨基環(huán)醇類抗生素，主要通過抑制真菌和昆蟲中海藻糖酶的活性來展現(xiàn)其出色的抗真菌活性以及抗蟲活性[2]。井岡霉素已經(jīng)被廣泛用于水稻紋枯病立枯絲核菌的殺菌和防治[3-4]。井岡霉素除了具有良好的防治植物病蟲害的作用外，還表現(xiàn)出良好的生物安全性，在植物、農(nóng)作物以及土壤中殘留較少，且殘留的微量井岡霉素不會(huì)被人體腸道吸收，可直接被排出體外，這一特性有助于減少農(nóng)藥殘留對(duì)人體健康的損害[5-7]。目前，已經(jīng)有近300種井岡霉素在我國獲得農(nóng)藥登記，鑒于其在農(nóng)業(yè)方面突出的作用，井岡霉素的檢測對(duì)于分析農(nóng)作物上的農(nóng)藥殘留量至關(guān)重要。

井岡霉素的傳統(tǒng)檢測方法主要有薄層色譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、氣相色譜法[11]、液相色譜法[12]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-15]等。其中，毛細(xì)管電泳法檢出限為0.2 μg·mL-1，靈敏度較低；氣相色譜法測定井岡霉素需要衍生，過程煩瑣，實(shí)驗(yàn)過程耗時(shí)長，需要操作人員對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)操作都有較高程度的掌握，實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易受人員因素影響；液相色譜法檢測井岡霉素時(shí)，在210 nm處有最大吸收，但多數(shù)物質(zhì)在該波長下有一定程度的吸收，容易引起基質(zhì)干擾，導(dǎo)致定性能力較差。因此，建立一種簡單高效的井岡霉素檢測方法對(duì)于井岡霉素以及其他農(nóng)藥殘留分析具有重要的意義。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）作為一種有效的檢測方法，受到研究人員的廣泛關(guān)注。該法可以將質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度與液相分離相結(jié)合，近年來在農(nóng)藥檢測中被廣泛應(yīng)用。目前現(xiàn)行有效的食品安全法規(guī)定的方法為GB 23200.74—2016，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的儀器設(shè)備為液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，配大氣壓化學(xué)電離源（APCI源）。但各檢測單位對(duì)APCI源的使用頻率較低，大部分單位都很少配置，主要使用電噴霧離子源（ESI源）。如果ESI源也能用于井岡霉素的檢測，則不限制檢測儀器的科學(xué)實(shí)驗(yàn)就可以減少成本，方便科學(xué)研究的分析檢測。

本文分別使用APCI源和ESI源同時(shí)對(duì)核桃中井岡霉素進(jìn)行了檢測分析，以期為井岡霉素的檢測分析提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃，新疆阿克蘇。

井岡霉素（純度99%，DRE）；乙腈、甲醇（色譜級(jí)，德國默克）；去離子水；HLB小柱，6 mL/200 mg，上海安譜。

1.2 儀器與設(shè)備

Q-sight 4500 PE液 相 色 譜-質(zhì) 譜/質(zhì) 譜 儀；QTRAP 6500三重四極桿-線性離子肼質(zhì)譜系統(tǒng)，美國AB Sciex公司；UPLC液相色譜系統(tǒng)，PE公司，美國AB Sciex公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品井岡霉素10 mg（精確至0.01 mg），用水溶液溶解并定容至10 mL容量瓶中，稀釋溶解得到濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，待用部分需冷藏避光保存。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。準(zhǔn)確吸取適當(dāng)體積的上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水溶液根據(jù)不同濃度需要給予稀釋，分別得到濃度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將上述工作液一式兩份分裝樣品瓶，待上機(jī)檢測，以井岡霉素濃度值為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.3.2 樣品處理

實(shí)驗(yàn)采用相同的前處理過程。稱取約2.5 g核桃樣品（精確至0.01 g），置于聚四氟乙烯離心管中，加入25 mL CH3OH溶液，用均質(zhì)器高速勻漿提取2 min，5 000 r·min-1離心7 min，收集上清液于另一個(gè)離心管中。離心后的殘?jiān)? mL CH3OH溶液重復(fù)上述提取步驟1次，合并上清液，在45 ℃水浴下氮吹濃縮至2.5 mL以下，待凈化。取氮吹濃縮后的待凈化溶液轉(zhuǎn)移到活化過的HLB固相萃取柱中，調(diào)整流速為1滴/s，過固相萃取柱，待溶液剛要全部流出，液面馬上要消失還沒有消失的時(shí)候，用2 mL水淋洗柱子，將全部的流出溶液和淋洗溶液收集到適當(dāng)體積的刻度試管中，加水定容至5.0 mL，混勻，過0.22 μm濾膜，分別供配備APCI源及ESI源的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。

1.3.3 儀器條件

前處理完成后，將經(jīng)過相同步驟處理的樣品溶液分裝到不同樣品瓶中，上機(jī)待測。實(shí)驗(yàn)使用相同填料及規(guī)格的色譜柱（色譜柱為安捷倫C18色譜柱100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫均為40 ℃，流動(dòng)相A均為CH3OH，流動(dòng)相B均為0.05%的CH3COONH4緩沖溶液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)儀器狀態(tài)的不同，參數(shù)略有差異，APCI源流速為0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量為2 μL，APCI源洗脫梯度見表1。ESI源流速為0.4 mL·min-1，進(jìn)樣量為5 μL，ESI源洗脫梯度見表2。

表1 APCI源梯度洗脫條件表

表2 ESI梯度洗脫條件表

2 結(jié)果與分析

2.1 定性信息確認(rèn)

實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品和待測物的儀器保留時(shí)間和離子對(duì)豐度比進(jìn)行定性分析。ESI離子對(duì)譜圖見圖1，APCI離子對(duì)譜圖見圖2（圖中濃度為2.0 ng·mL-1）。APCI源及ESI源的保留時(shí)間及結(jié)果偏差見表3，相對(duì)離子豐度比及結(jié)果偏差見表4。從結(jié)果可見標(biāo)準(zhǔn)品與待測物之間的保留時(shí)間與出峰狀態(tài)足夠相近，偏差均能夠滿足定性要求。

表4 APCI源及ESI源相對(duì)離子豐度比結(jié)果及偏差表

圖1 ESI離子對(duì)譜圖

圖2 APCI離子對(duì)譜圖

表3 APCI源及ESI源保留時(shí)間及偏差表

2.2 線性方程

按照1.3.1實(shí)驗(yàn)方法配制2～200 μg·L-1濃度范圍的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝樣品瓶分別上機(jī)檢測。APCI源及ESI源均在2～200 μg·L-1性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，具體結(jié)果見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果表

2.3 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

在10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、100 μg·kg-13個(gè)加標(biāo)濃度下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，3個(gè)濃度水平分別重復(fù)3次、7次、3次。如表6所示，APCI源井岡霉素在核桃中的平均回收率為81.8%～87.2%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～7.0%，定量限為5.79 μg·kg-1；ESI源井岡霉素在核桃中的平均回收率為81.8%～86.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.1%～12.0%，定量限為8.66 μg·kg-1。

表6 APCI源及ESI源檢出限、準(zhǔn)確度結(jié)果表

3 結(jié)論

APCI源與ESI源均適用于核桃中井岡霉素的檢測。實(shí)驗(yàn)在APCI源進(jìn)樣量更小的情況下，APCI源的定量限依然明顯低于ESI源，靈敏度更高，但不完全是離子源的原因，可能還與色譜條件、儀器狀態(tài)等其他因素有關(guān)。若實(shí)驗(yàn)對(duì)靈敏度要求較高，則選用APCI源更合適。

兩種離子源的質(zhì)譜儀檢測下，待測物在2～200 ng·mL-1線性關(guān)系均能夠滿足相關(guān)，R2均大于0.99；在不同加標(biāo)水平下平均回收率在60%～120%（APCI源方法檢測回收率為78.4%～98.8%；ESI源方法檢測回收率為80.7%～107.9%）；偏差結(jié)果均小于22%（APCI源方法檢測偏差為2.0%～7.8%；ESI檢測方法偏差為1.1%～12.0%），多項(xiàng)指標(biāo)均滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的技術(shù)要求。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，相同的樣品處理操作下，ESI源結(jié)果的穩(wěn)定性盡管同樣滿足要求，但是相比于APCI源較差些（偏差結(jié)果也同樣反映此問題，ESI源偏差值更大）；同樣樣品小瓶移至APCI源檢測，結(jié)果重現(xiàn)性更好。但是并不能完全歸因于離子源原因，可能還與儀器設(shè)備的廠家不同、硬件原理各有差別、質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)各不相同以及每臺(tái)儀器狀態(tài)也具有一定的隨機(jī)性等有關(guān)，因此ESI源結(jié)果穩(wěn)定性較差的原因有待進(jìn)一步研究。