山楂提取物與抗生素復(fù)配的抑菌作用研究

山楂屬薔薇科的一種，其果實具有很高的營養(yǎng)價值，還具有健脾消食、降血壓血脂、抗動脈粥樣硬化等功效[1]。山楂中含有多種活性物質(zhì)，其提取物安全無毒且含有一定的營養(yǎng)成分，可用于食品著色和飲料的配制等[2-3]。對于山楂提取物的抗菌作用，已有部分研究成果。姜珂等[4]研究了山楂提取物與β-內(nèi)酰胺類抗生素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的協(xié)同抑菌效果，呂曉楠等[5]研究了乳酸鏈球菌素（Nisin）與山楂提取液的復(fù)合抗菌效果。目前，關(guān)于山楂提取物與藥物復(fù)配后抗菌作用的研究相對較少。本研究采用一定的工藝提取山楂中的抑菌物質(zhì)，將其與抗生素復(fù)配后研究其協(xié)同抑菌性能，以期為山楂的綜合利用提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山楂：購自青島膠州市展記炒貨；大腸桿菌、變形桿菌：青島工學院微生物實驗室提供；阿莫西林分散片：中諾藥業(yè)；氯霉素片：廣東華南藥業(yè)集團；克拉霉素分散片：成都恒瑞制藥。

1.2 試驗設(shè)備

101-3A型電熱鼓風干燥箱，聯(lián)鯨電子科技有限公司；SW-CJ-1F型單人雙面超凈工作臺，智誠科技有限公司；HJPS-250型恒溫培養(yǎng)箱，智誠科技有限公司；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；GM-B2002電子天平，南京伯尼塔科學儀器有限公司；SE-750高速粉碎機，永康市圣象電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山楂活性物質(zhì)的提取

用自來水沖洗山楂，去籽，陰干，置于烘箱干燥后，粉碎、過篩，取40目的山楂粉，避光保存于磨口瓶中，備用。稱取原料粉末10 g，用70%的乙醇作萃取劑，按照20∶1的比例（70%乙醇∶原料粉末，mL∶g）加入。采用70 ℃超聲波萃取40 min后，進行真空抽濾，回收濾液，在同樣的條件下，再萃取濾渣3次，將濾液進行混合后旋蒸至10 mL，得到濃度為1 g·mL-1的山楂提取物。

1.3.2 抗生素與山楂提取物的復(fù)配方案

稱取克拉霉素、氯霉素粉末各100 mg，添加20 mL的蒸餾水進行溶解，使其溶液達到5 000 μg·mL-1，儲存溫度以4 ℃為最佳。將配制好的抗生素溶液與山楂提取物按1∶0、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7比例復(fù)配，測定復(fù)配液對大腸桿菌、變形桿菌的抑菌效果。

1.3.3 菌懸液的制備

菌種活化后，將菌種接種于牛肉膏液體培養(yǎng)液中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，計數(shù)并稀釋菌液濃度至1×107CFU·mL-1。

1.3.4 抑菌圈的測定

向平板中加入0.1 mL的大腸桿菌和變形桿菌的菌懸液，將其均勻涂布，再將6 mm直徑的滅菌濾紙片浸入復(fù)配溶液0.5 h，然后粘貼于培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿3片，濾紙片等間距排列，同時做空白對照試驗。將培養(yǎng)皿置于37 ℃的培養(yǎng)箱中進行24 h的培養(yǎng)，測量抑菌圈的直徑大小，記錄數(shù)據(jù)并計算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂提取物的抑菌作用

由圖1可知，1 g·mL-1山楂提取物對大腸桿菌、變形桿菌都有一定程度的抑制效果，且對變形桿菌的抑制較為明顯，達到了9.8 mm。20世紀50年代，人們開始對山楂的化學成分進行研究，證實其含有大量的黃酮以及有機酸、金絲桃甙、膽堿、維生素C等成分[1]。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是山楂提取物中含有的復(fù)雜活性成分對大腸桿菌及變形桿菌的生長產(chǎn)生了抑制作用。

圖1 山楂提取物的抑菌作用圖

2.2 克拉霉素復(fù)配液對變形桿菌的抑菌作用

由圖2可知，克拉霉素和山楂提取物復(fù)配可以增強對變形桿菌的抑菌作用，最佳復(fù)配比例為1∶5，此時抑菌圈直徑為13.7 mm。繼續(xù)增加山楂提取物用量，復(fù)配物效價下降，可能是提取物中過多的復(fù)雜成分與克拉霉素產(chǎn)生了拮抗作用，也可能是山楂提取物偏酸性，隨著山楂提取物比例增加，復(fù)配液的pH值減小，減弱了克拉霉素的抑菌活性。

圖2 克拉霉素復(fù)配液對變形桿菌抑菌作用圖

2.3 克拉霉素復(fù)配液對大腸桿菌的抑菌作用

由圖3可知，當復(fù)配比例為1∶0到1∶5時，抑菌圈的直徑逐漸增大，說明克拉霉素和山楂提取物復(fù)配可以增強對大腸桿菌的抑菌作用，復(fù)配比例為1∶5時抑菌效果最好，抑菌圈直徑為13.0 mm。克拉霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其抑菌機理是通過與細胞核糖體50S亞基結(jié)合，從而抑制細菌蛋白質(zhì)的合成，具有較強的抑菌能力。繼續(xù)增加山楂提取物用量，復(fù)配物的效價降低，其原因可能是提取物中的多種組分與克拉霉素有一定的拮抗性，或者是pH值減小影響了克拉霉素的抑菌效果。

圖3 克拉霉素復(fù)配液對大腸桿菌抑菌作用圖

2.4 氯霉素復(fù)配液對變形桿菌的抑菌作用

由圖4可知，氯霉素和山楂提取物復(fù)配明顯地增強了對變形桿菌的抑菌作用，且復(fù)配比例為1∶4時，抑菌效果最好，抑菌圈直徑為28.8 mm，為單獨使用氯霉素時的1.72倍。有學者研究顯示氯霉素與維生素C合用會導(dǎo)致抗菌藥物的抗菌活性顯著下降[6]，本實驗中克拉霉素復(fù)配液在1∶5時抑菌效果最好，而氯霉素則是在復(fù)配比為1∶4時抑菌效果較好，推測其原因可能是山楂提取物中含有豐富的維生素C，復(fù)配比為1∶5時，維生素C對抗菌活性的影響超過了氯霉素與提取物中其他活性物質(zhì)復(fù)配時的協(xié)同抑菌作用。

圖4 氯霉素復(fù)配液對變形桿菌抑菌作用圖

2.5 氯霉素復(fù)配液對大腸桿菌的抑菌作用

由圖5可知，氯霉素和山楂提取物復(fù)配增強了對大腸桿菌的抑菌作用，當復(fù)配比例為1∶4時，抑菌效果最好，抑菌圈直徑為19.2 mm。氯霉素的抗菌機理是通過抑制肽?；D(zhuǎn)移酶的活性，進而抑制蛋白質(zhì)的合成，屬抑菌性廣譜抗生素，所以無論是變形桿菌還是大腸桿菌，其抑菌圈直徑都較大，抑菌作用較強。

圖5 氯霉素復(fù)配液對大腸桿菌抑菌作用圖

3 結(jié)論

本試驗選用山楂作為主要原料，經(jīng)過烘干、粉碎等處理之后，再經(jīng)超聲波提取、真空抽濾等措施獲得山楂提取物，并將山楂提取液與抗生素通過不同比例進行復(fù)配，通過測定抑菌圈直徑大小，對其抑菌效果進行研究，以此來確定最佳復(fù)配比例。試驗結(jié)果表明，克拉霉素復(fù)配液的復(fù)配比例在1∶5時對供試菌的抑菌效果最好，而氯霉素復(fù)配液復(fù)配比例在1∶4時對供試菌的抑菌效果最好。山楂提取物與氯霉素復(fù)配時協(xié)同增效抑菌效果較好，其次是克拉霉素。當超過一定復(fù)配比例時，山楂提取物和抗生素復(fù)配液的抑菌效果均會有所下降。