魚腥草黃酮類化合物提取、純化及抗氧化研究

魚腥草又名折耳根，學(xué)名為蕺菜，主要分布于中國(guó)、韓國(guó)、日本和東南亞等地區(qū)，資源非常豐富，是一種藥食同源的食物，常作為食材或者藥材應(yīng)用，在西南地區(qū)被人們廣泛食用。例如，魚腥草是西南地區(qū)的首席涼拌菜，還可以用作炒菜的原材料，深受人們喜愛[1]。同時(shí)，在中醫(yī)治療方面，可以將魚腥草曬干煮水喝或泡茶喝，具有清熱解毒、祛痰止咳、鎮(zhèn)痛止血等功效，用于治療肺炎、支氣管炎和慢性阻塞性呼吸道疾病[2]。根據(jù)目前研究，魚腥草中含有豐富的活性成分，如揮發(fā)油、黃酮類化合物和有機(jī)酸等，其中黃酮類化合物最為豐富[3]。研究表明，黃酮類化合物具有較好的生物活性，如抗氧化、抗癌、抗腫瘤、降血壓和預(yù)防心血管疾病等功能活性[4]。因此，研究魚腥草黃酮的提取及抗氧化活性研究具有重要的實(shí)際意義。

目前，有關(guān)魚腥草的研究大多集中于黃酮的提取，提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取及雙水相提取法等，而對(duì)于魚腥草黃酮的純化及抗氧化活性研究較少[1]。其中，超聲波輔助提取法主要是利用超聲波在介質(zhì)中的機(jī)械振動(dòng)及空化作用，提高黃酮的溶出效率[5]。一般，黃酮類化合物的抗氧化性主要體現(xiàn)在供氫能力，其結(jié)構(gòu)中的羥基和羰基可通過阻止自由基產(chǎn)生來發(fā)揮抗氧化作用。因此，本研究采用超聲波輔助法提取魚腥草中的黃酮，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化黃酮的提取條件，利用大孔樹脂D101對(duì)提取的黃酮進(jìn)行粗純化，并對(duì)比純化前后的抗氧化活性，旨在為開發(fā)魚腥草資源利用及新型保健食品、化妝用品、藥品提供一定的理論科學(xué)依據(jù)，具有重要的社會(huì)效益和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

魚腥草干制品，經(jīng)60 °C烘干，磨碎，過60目篩備用；蘆丁，維克生物科技有限公司；D101大孔樹脂，東鴻化工有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）與2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS），合肥巴斯夫科技有限公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉和過硫酸鉀（均為分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

WF-18超微粉碎機(jī)，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；KS-600D超聲波儀器，寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司；TDL-40B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FA2104B電子天平，上海市安亭電子儀器廠；V-1000分光光度計(jì)，翱藝儀器有限公司；THZ-100恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測(cè)定吸光度[6]。分別精密吸取蘆丁對(duì)照液（0.2 mg·mL-1） 0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL，分別放入50 mL的容量瓶中，加5% NaNO2溶液0.3 mL，充分搖晃后等待反應(yīng)6 min，滴加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液進(jìn)行搖晃后，等待反應(yīng)6 min，加4.00 mL 4% NaOH溶液反應(yīng)10 min，最后用70%乙醇定容，設(shè)空白對(duì)照，于510 nm處測(cè)吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.010 8x+0.013 7，R2=0.999 7。

1.2.2 超聲波輔助提取魚腥草黃酮

準(zhǔn)確稱取一定量的魚腥草粉末樣品，加入一定比例的乙醇溶液，然后利用超聲波提取一定時(shí)間，將提取液離心（4 000 r·min-1，10 min）后定容，作為待測(cè)液。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1）乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響。在料液比1∶20，超聲時(shí)間60 min的條件下，研究乙醇濃度為30%、40%、50%、60%和70%對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響。

（2）料液比（m∶V）對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響。在乙醇濃度50%，超聲時(shí)間60 min條件下，研究不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響。

（3）提取時(shí)間對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響。在料液比為1∶40，乙醇濃度50%的條件下，分別研究超聲提取時(shí)間30 min、40 min、50 min、60 min和70 min對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

在得出3個(gè)因素最優(yōu)提取水平條件下，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)魚腥草黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 大孔樹脂純化

（1）樹脂的預(yù)處理。樹脂用無(wú)水乙醇浸泡24 h，用水清洗至無(wú)刺激性氣味，在5% HCl溶液浸泡2 h后用水洗至中性，2% NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性備用。

（2）靜態(tài)吸附解吸試驗(yàn)。在100 mL具塞磨口三角瓶中加入5 g處理活化后的樹脂，加入50 mL魚腥草粗提液，塞上磨口玻璃塞后在25 ℃條件下振蕩吸附20 h，取吸附上清液測(cè)黃酮濃度，計(jì)算比吸附量（式1）。然后用水清洗吸附樹脂表面雜質(zhì)，以50%的乙醇為洗脫液，25 ℃條件下恒溫振蕩解吸20 h，取解吸上清液測(cè)黃酮濃度，計(jì)算解析率（式2）及純度（式3）。

式中：C0為粗提液濃度，mg·mL-1；V0為粗提液體積，mL；C1為提純后濃度，mg·mL-1；V1提純后體積，mL；M為樹脂質(zhì)量，g。

式中：C2為洗脫液黃酮濃度，mg·mL-1；V2為洗脫液體積，mL；Q為比吸附量，mg·g-1；M為樹脂質(zhì)量，g。

純度=凍干復(fù)溶液中黃酮的含量/復(fù)溶前凍干樣

1.2.6 魚腥草黃酮抗氧化活性的測(cè)定

（1）DPPH自由基清除率的測(cè)定。將純化前后的魚腥草黃酮樣品稀釋至不同的濃度，分別為0.500 00 mg·mL-1、0.250 00 mg·mL-1、0.125 00 mg·mL-1、0.062 50 mg·mL-1和0.031 25 mg·mL-1，同時(shí)設(shè)置樣品空白組（不加提取液，利用提取溶劑代替）。按照J(rèn)ORAHOLMEN等[7]的方法測(cè)定DPPH自由基的清除能力。清除率計(jì)算公式為

式中：A0為無(wú)水乙醇與DPPH反應(yīng)后的吸光值；A1為樣液與DPPH反應(yīng)后的吸光值；A2為樣液與無(wú)水乙醇反應(yīng)后的吸光值。

（2）ABTS自由基清除率的測(cè)定。樣品處理同上，取0.2 mL提取液和2.0 mL ABTS+（7.4 mmol·L-1）反應(yīng)液室溫避光反應(yīng)6 min。同時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組A0，在734 nm下測(cè)定其吸光值，用抗壞血酸進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，具體詳細(xì)操作同上。ABTS自由基清除率計(jì)算公式為

式中：A0為（0.2 mL）無(wú)水乙醇+（2 mL） ABTS溶液的吸光值；As為（0.2 mL）樣品溶液+（2 mL）ABTS溶液的吸光值；Ac為（0.2 mL）樣品溶液+（2 mL）無(wú)水乙醇的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響

由圖1可知，魚腥草黃酮提取率隨乙醇濃度的增大呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，黃酮提取率最高。這是因?yàn)樵谝欢ㄒ掖紳舛确秶鷥?nèi)，黃酮的溶出率逐漸提高，但當(dāng)乙醇濃度超過50%時(shí)，魚腥草中的其他脂溶性成分也會(huì)溶出，影響黃酮的提取，導(dǎo)致黃酮的提取率降低。因此，乙醇濃度選擇50%。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響圖

2.1.2 料液比對(duì)魚腥草黃酮提取率的影響

由圖2可知，魚腥草黃酮的提取率隨提取液比例的增大逐漸提高，當(dāng)料液比降低至1∶40以下時(shí)，黃酮提取率增加幅度較為減緩。這是因?yàn)樵谝欢弦罕确秶鷥?nèi)，隨提取液比例的增大，物料與溶劑的接觸面積增大，黃酮的溶出率增大，而當(dāng)料液比降低至1∶40以下時(shí)，料液比對(duì)黃酮的溶出效率沒有明顯影響，而且過度增加溶劑添加量，會(huì)提高成本。綜合考慮，選擇料液比為1∶40。

圖2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響圖

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)魚腥草總黃酮提取率的影響

由圖3可知，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，魚腥草黃酮提取率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，而當(dāng)超聲時(shí)間超過50 min后，魚腥草黃酮的提取率顯著降低。這是因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi)，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，魚腥草溶質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加快，增大了黃酮的溶出速率，但當(dāng)超聲時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)破壞魚腥草黃酮的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率降低。因此，超聲時(shí)間選擇50 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響圖

2.2 正交試驗(yàn)

由表1可知，RB＞RA＞RC，即料液比是黃酮提取率最大的影響因素，其次是乙醇濃度與超聲時(shí)間。同時(shí)，根據(jù)K值大小得到黃酮最佳提取工藝條件為A1B3C3組合，即乙醇濃度為40%、料液比為1∶50、超聲時(shí)間為60 min，此時(shí)黃酮的提取率為4.764%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果表

2.3 黃酮的粗純化

將魚腥草黃酮粗提物在D101大孔樹脂振蕩吸附20 h后，測(cè)得吸附后黃酮濃度為2.606 mg·mL-1，經(jīng)計(jì)算得出比吸附容量為5.27 mg·g-1，利用50%濃度乙醇水溶液對(duì)魚腥草黃酮物質(zhì)解吸，解吸率為94.87%。純化前后提取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇凍干復(fù)溶后，最終測(cè)得黃酮的純度提高了2.59倍。

2.4 純化前后魚腥草黃酮的體外抗氧化活性的測(cè)定

由圖4可知，魚腥草黃酮和維生素C對(duì)ABTS自由基的清除能力隨其濃度的增大逐漸升高，當(dāng)濃度升高至0.125 00 mg·mL-1后，對(duì)ABTS的清除能力趨于平緩。與未純化黃酮相比，尤其在低黃酮濃度條件下，黃酮經(jīng)純化后對(duì)ABTS的清除率顯著提高，當(dāng)黃酮濃度為0.500 00 mg·mL-1時(shí)，未純化黃酮對(duì)ABTS自由基的清除能力為94.54%，黃酮提純后的清除能力高達(dá)97.93%，純化后對(duì)ABTS自由基的清除能力顯著提高，說明黃酮經(jīng)純化后其抗氧化活性提高。

圖4 純化前后魚腥草黃酮對(duì)ABTS自由基清除能力的影響圖

由圖5可知，魚腥草黃酮和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除能力隨其濃度的增大逐漸增強(qiáng)，而當(dāng)濃度增大至0.125 00 mg·mL-1后，樣品對(duì)DPPH的清除能力趨于平緩。維生素C的抗氧化能力顯著高于魚腥草黃酮。在濃度低于0.125 00 mg·mL-1時(shí)，與未純化黃酮相比，純化后的黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力顯著提高，即低濃度下，黃酮純度越高，其抗氧化活性越強(qiáng)。這是因?yàn)槲醇兓狞S酮提取液含有較多的雜質(zhì)，與黃酮之間發(fā)生相互作用形成復(fù)合物，影響了黃酮提供氫的能力，導(dǎo)致抗氧化活性減弱，而純化后的黃酮，純度相對(duì)提高，可以增強(qiáng)黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力，說明純化對(duì)黃酮類化合物的應(yīng)用具有重要的意義。

圖5 純化前后魚腥草黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的影響圖

3 結(jié)論

本文主要通過超聲波輔助法提取魚腥草中的黃酮類化合物，對(duì)黃酮進(jìn)行粗純化，并通過DPPH和ABTS自由基的清除能力研究黃酮的抗氧化活性。研究表明魚腥草黃酮的最佳提取條件為乙醇濃度40%、料液比1∶50、超聲時(shí)間60 min，此時(shí)黃酮的提取率為4.764%。經(jīng)D101型大孔樹脂粗純化后，純度提高了2.59倍，經(jīng)純化處理后，黃酮的體外抗氧化活性顯著提高，且與濃度呈一定的相關(guān)關(guān)系。該研究為魚腥草的開發(fā)利用及功能食品的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。