一種消減醬豆中游離酪氨酸的耐鹽菌的篩選及應(yīng)用研究

黃豆醬是一類(lèi)以大豆和面粉為主要原料，經(jīng)米曲霉等微生物發(fā)酵而成的一種色、香、味俱全的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。黃豆醬中人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)微生物分解后，更容易被人體吸收，也可以改善人體的腸道環(huán)境。在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中，許多微生物起著重要作用，米曲霉是主要的微生物，也包括芽孢桿菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等。

我國(guó)豆醬種類(lèi)中黃豆醬的產(chǎn)量最大，對(duì)黃豆醬的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程的研究比較深入。黃豆醬主要采用米曲霉進(jìn)行制曲，大曲成熟后，與鹽水混合，制成黃豆醬胚。黃豆醬胚的鹽分較高，使得大量霉菌生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而導(dǎo)致其呼吸代謝逐漸減弱直至停止，但有些適應(yīng)該環(huán)境的耐鹽或耐酸微生物開(kāi)始大量繁殖。發(fā)酵初期的黃豆醬胚中，米曲霉分泌的各種酶發(fā)揮了主要作用。原料中的蛋白質(zhì)被蛋白酶、肽酶降解為多肽、氨基酸等小分子物質(zhì)[1]；淀粉、纖維素等多糖物質(zhì)被淀粉酶降解為小分子的葡萄糖。黃豆醬發(fā)酵中期，耐鹽酵母菌和乳酸菌利用發(fā)酵初期形成的葡萄糖等物質(zhì)代謝生成乙醇、乳酸等呈味物質(zhì)。在黃豆醬的發(fā)酵后期，需定期翻、曬、露，以便通過(guò)陽(yáng)光紫外線照射，使溫度白天高晚上低，形成溫度差，進(jìn)而使發(fā)酵黃豆醬胚中各種有益菌種得到繁殖和生長(zhǎng)，增加醬豆酯香。

傳統(tǒng)的黃豆醬釀造工藝都是先將黃豆浸泡好，去掉泡豆水后將黃豆蒸煮，然后再進(jìn)行制曲和發(fā)酵，制成黃豆醬胚。但在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中，物料在蛋白酶、肽酶等酶的作用下，分解成多肽和氨基酸，氨基酸中的酪氨酸因溶解度僅為0.045%，很容易在釀造過(guò)程中析出，產(chǎn)生白點(diǎn)，嚴(yán)重影響黃豆醬的外觀品質(zhì)[2-3]。

制曲過(guò)程中大曲發(fā)酵產(chǎn)生的酶系難以控制，無(wú)法直接控制蛋白質(zhì)的水解過(guò)程不產(chǎn)生酪氨酸[4-5]。因此，為減少發(fā)酵產(chǎn)物中的酪氨酸水平，采取“添加消耗酪氨酸的耐鹽菌”的工藝，在后發(fā)酵過(guò)程中分解利用酪氨酸為氮源。這樣既減少了發(fā)酵產(chǎn)物中的酪氨酸，亦不增加發(fā)酵成本，提升了黃豆醬發(fā)酵產(chǎn)物的感官品質(zhì)，降低了黃豆醬在釀造過(guò)程中的白點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)，提升了黃豆醬整體經(jīng)濟(jì)效益。

本文通過(guò)篩選消減酪氨酸的耐鹽菌，用于黃豆醬釀造工藝。在黃豆醬發(fā)酵過(guò)程中，耐鹽菌消耗醬豆中游離的酪氨酸，有效降低黃豆醬發(fā)酵后期醬醪中游離酪氨酸的含量，使黃豆醬中游離酪氨酸的含量＜100 mg/100 g，從而避免了黃豆醬在貨架期產(chǎn)生白點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

釀造黃豆醬生產(chǎn)原料：黃豆、面粉、食鹽從市場(chǎng)采購(gòu)；滬釀3.042米曲霉菌種：由廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司提供；葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、麥芽汁培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基和瓊脂粉等從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、耐鹽菌擴(kuò)培系統(tǒng)、種曲機(jī)、NK式旋轉(zhuǎn)蒸煮鍋、發(fā)酵池、60 m3發(fā)酵罐等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 分離培養(yǎng)基及分離方法

檢測(cè)不同發(fā)酵罐中酪氨酸的含量，從低游離酪氨酸含量的發(fā)酵罐中取醬醪樣品，進(jìn)行分離。

耐鹽乳酸菌的分離：MRS培養(yǎng)基（1 L）、食鹽

100 g、碳酸鈣3 g，采用包埋法進(jìn)行分離。

耐鹽酵母菌的分離：麥芽汁培養(yǎng)基（1 L）、食鹽

100 g、瓊脂粉20 g，采用平板涂布法進(jìn)行分離。

1.3.2 耐鹽菌的菌落形態(tài)和菌體顯微形態(tài)

觀察分離得到的耐鹽菌的菌落形態(tài)，用牙簽挑取少量菌體置于載玻片上，滴加少量的蒸餾水，蓋上蓋玻片，然后通過(guò)顯微鏡觀察耐鹽菌的顯微形態(tài)。

1.3.3 小試規(guī)模確定目標(biāo)耐鹽菌消減游離酪氨酸的效果

①耐鹽菌的制備。將目標(biāo)耐鹽菌按照現(xiàn)有工藝進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)培液，備用。②醬醪的制備。取200 g成熟大曲，與濃度為18%的300 g鹽水混合均勻，盛裝于1 L三角瓶中，制得新鮮的醬醪。③耐鹽菌的添加。菌種的添加比例為醬醪的5%；試驗(yàn)一：將耐鹽酵母菌添加于新鮮的醬醪中；試驗(yàn)二：將耐鹽乳酸菌添加于新鮮的醬醪中；試驗(yàn)三：將耐鹽酵母菌和乳酸菌分別按照5%醬醪比例添加至同一瓶的新鮮醬醪中，添加自來(lái)水于醬醪中的樣品為對(duì)照樣品。④醬醪發(fā)酵。將醬醪于30 ℃左右進(jìn)行發(fā)酵，分別取發(fā)酵時(shí)間為7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和63 d的醬豆樣品，送檢樣品的游離酪氨酸指標(biāo)，根據(jù)游離酪氨酸的含量變化，確認(rèn)分離得到的耐鹽菌降低游離酪氨酸效果。

1.3.4 小試規(guī)模優(yōu)化目標(biāo)耐鹽菌的添加工藝

分別取發(fā)酵時(shí)間為7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d、56 d和63 d的醬豆樣品，送檢樣品的游離酪氨酸指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)，分別確定目標(biāo)耐鹽菌的最佳添加時(shí)間、添加量、添加后起效時(shí)間。

1.3.5 中、大試規(guī)模驗(yàn)證耐鹽菌消減酪氨酸的效果

將篩選的目標(biāo)耐鹽菌按照生產(chǎn)工藝進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，得到擴(kuò)培液，備用。取成熟的大曲，與濃度為16%的鹽水按照1∶2.0的比例進(jìn)行混合制醪，泵至60 m3發(fā)酵罐中，將耐鹽菌擴(kuò)培液，分別按照5%的添加比例添加至醬醪中，以未添加擴(kuò)培液的發(fā)酵罐為對(duì)照罐，常溫發(fā)酵，取7 d、14 d、21d、28 d、35d、42 d、49 d、56 d和63 d的醬豆樣品，檢測(cè)主要理化指標(biāo)。

1.3.6 各指標(biāo)檢測(cè)方法

（1）游離酪氨酸測(cè)定。參照GB 5009.124—2016使用高效液相色譜法[8]。

（2）理化指標(biāo)測(cè)定?？偹釁⒄誈B 12456—2021使用自動(dòng)電位滴定法測(cè)定；氨基酸態(tài)氮參照GB 5009.235—2016使用酸度計(jì)法測(cè)定；還原糖參照GB 5009.7—2016使用直接滴定法測(cè)定；鹽分參照GB/T 5009.39—2003使用直接滴定法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選得到的耐鹽菌及其菌落形態(tài)和顯微鏡形態(tài)

由表1可知，一共分離得到了8株耐鹽菌，其中有4株為酵母菌，1株為短桿菌，2株球形細(xì)菌，1株乳酸菌，分離得到的耐鹽菌大部分為酵母菌。

表1 從新鮮醬醪中分離的菌種編號(hào)、形態(tài)和類(lèi)型表

2.2 小試規(guī)模確定目標(biāo)耐鹽菌消減游離酪氨酸的效果

由表2可知，菌1和菌4分別添加到醬醪中，在發(fā)酵至20 d左右時(shí)，醬豆中游離酪氨酸含量大大降低，這兩株耐鹽菌消減酪氨酸效果最好。

表2 不同醬豆中游離酪氨酸含量變化情況表

2.3 小試規(guī)模優(yōu)化目標(biāo)耐鹽菌的添加工藝

2.3.1 耐鹽菌的添加時(shí)機(jī)確定

由表3可知，在發(fā)酵0 d、14 d、28 d、42 d的醬醪中添加耐鹽菌，均能使醬豆中的游離酪氨酸下降，但在發(fā)酵0 d即投料當(dāng)天添加耐鹽菌，消減游離酪氨酸的效果最好。

表3 不同添加時(shí)機(jī)發(fā)酵醬豆中游離酪氨酸的含量表

2.3.2 耐鹽菌的添加比例確定

由表4可知，按0.5%、1.0%添加到醬醪中消減酪氨酸的效果不明顯，添加2.5%、5.0%和10.0%的耐鹽菌到醬醪中降酪氨酸的效果明顯。說(shuō)明添加耐鹽菌的量是降低酪氨酸的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，菌量少，達(dá)不到降酪氨酸的效果。添加比例為2.5%時(shí)，消減酪氨酸效果也非常明顯，但發(fā)酵前期還是存在高含量的游離酪胺酸，耐鹽菌慢慢生長(zhǎng)起來(lái)后，酪氨酸下降較快，但是存在白點(diǎn)隱患；5.0%和10.0%的添加量對(duì)降酪氨酸的效果差別不大，說(shuō)明添加5.0%的耐鹽菌已經(jīng)飽和，添加5.0%以上的菌量對(duì)降酪氨酸的效果提升影響不大，故添加量最適為5.0%。

表4 不同添加比例發(fā)酵醬醪中酪氨酸的含量表

2.3.3 耐鹽菌的起效時(shí)間確定

由表5可知，在發(fā)酵0 d添加耐鹽菌，每周送檢醬豆中游離酪氨酸，判斷耐鹽菌的起效時(shí)間。在發(fā)酵初期，0～7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組醬豆中游離酪氨酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而增加，在發(fā)酵14～21 d，游離酪氨酸含量消減迅速，說(shuō)明添加的耐鹽菌在醬醪中14～21 d作用明顯。

表5 確定消減酪氨酸的耐鹽菌的起效時(shí)間表

由表1～5可知，在低酪氨酸的醬醪中篩選到了2株消減游離酪氨酸的耐鹽菌，一株為酵母菌，另外一株為乳酸菌，對(duì)其關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，說(shuō)明在發(fā)酵投料時(shí)就添加該2株耐鹽菌，單個(gè)菌株添加量為5%，或者混合菌株添加量為5%時(shí)，對(duì)消減醬豆中的游離酪氨酸效果最好。添加該耐鹽菌后，耐鹽菌在發(fā)酵14～21 d，大大降低醬豆中游離酪氨酸，解決白點(diǎn)隱患。

2.4 目標(biāo)耐鹽菌添加到黃豆醬工藝的中試驗(yàn)證

由表6可知，與對(duì)照組相比，添加了耐鹽菌菌1、菌4、菌1+菌4混合菌的試驗(yàn)組的黃豆醬中游離酪氨酸大大降低，幾乎檢不出來(lái)，且試驗(yàn)組的理化指標(biāo)和風(fēng)味、顏色與對(duì)照組沒(méi)有明顯區(qū)別。說(shuō)明添加黃豆醬耐鹽菌酵母菌，既能降低黃豆醬游離酪氨酸的含量，也沒(méi)有對(duì)理化指標(biāo)、風(fēng)味、顏色等造成負(fù)面影響，篩選到的耐鹽菌降酪氨酸效果較好，達(dá)到了預(yù)期目標(biāo)。

表6 試驗(yàn)組與對(duì)照組發(fā)酵黃豆醬胚理化指標(biāo)表

2.5 目標(biāo)耐鹽菌添加到黃豆醬工藝的大試驗(yàn)證

由表7可知，與對(duì)照組相比，添加了耐鹽菌菌1、菌4、菌1+菌4混合菌的試驗(yàn)組的黃豆醬中游離酪氨酸大大降低，幾乎檢不出來(lái)，且試驗(yàn)組的理化指標(biāo)和顏色與對(duì)照組沒(méi)有明顯區(qū)別，添加耐鹽菌的風(fēng)味均優(yōu)于對(duì)照組，同時(shí)添加耐鹽乳酸菌和酵母菌的醬豆風(fēng)味優(yōu)于添加單一耐鹽菌的，醬香味更濃郁。

表7 試驗(yàn)組與對(duì)照組發(fā)酵黃豆醬胚理化指標(biāo)表

3 結(jié)論

低酪氨酸含量的黃豆醬樣品中，分離得到2株消減游離酪氨酸效果明顯的菌株，分別為酵母菌和乳酸菌；將這2株耐鹽菌同時(shí)用于黃豆醬釀造工藝，在醬醪配制階段添加5%的耐鹽菌，發(fā)酵20 d左右時(shí)，使黃豆醬中的游離酪氨酸含量控制在＜100 mg/100 g，從而避免了黃豆醬在貨架期產(chǎn)生白點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。添加耐鹽菌工藝釀造的黃豆醬在總酸、氨基酸態(tài)氮、鹽分等主要理化指標(biāo)方面與對(duì)照樣無(wú)明顯差異，黃豆醬風(fēng)味有所提高，在解決黃豆醬白點(diǎn)的基礎(chǔ)上提高了黃豆醬品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了黃豆醬工藝的升級(jí)。