云南大理地區(qū)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)流行情況調(diào)查與分析

衡昭君，黃建新，王開(kāi)勝，毛華明，楊建發(fā)1,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.大理農(nóng)林職業(yè)學(xué)院，云南大理 671003；3.玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，廣西玉林 537000；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201)

阿米巴原蟲(chóng)在自然界廣泛分布，可通過(guò)糞-口途徑、黏膜直接接觸等多途徑進(jìn)行傳播[1]。其中，寄生性的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)是可感染人和動(dòng)物的阿米巴原蟲(chóng)，可引起嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，雖然其主要病因是溶組織內(nèi)阿米巴，但內(nèi)阿米巴屬的其他成員可以寄生于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，而且可能是致病性的[2]。動(dòng)物可感染的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)種類很多，包括溶組織內(nèi)阿米巴(E.histolytica)、迪斯帕內(nèi)阿米巴(E.dispar)、莫氏內(nèi)阿米巴(E.moshkovskii)、波列基內(nèi)阿米巴(E.polecki)、結(jié)腸內(nèi)阿米巴(E.coli)和哈氏內(nèi)阿米巴(E.hartmanni)等[3]。目前僅報(bào)道溶組織內(nèi)阿米巴具有致病性，因此很少有人關(guān)注其他種屬。Matsubayashi M等[4]研究指出，在人類或動(dòng)物中E.polecki單一感染致病的可能性較小，但是與其他病原體混合感染可能加劇疾病嚴(yán)重程度，因此對(duì)于不同種類的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染都應(yīng)該引起重視。

目前對(duì)于阿米巴常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有病原學(xué)診斷、免疫學(xué)診斷和PCR診斷[5]。自阿米巴原蟲(chóng)在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，關(guān)于內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的研究重點(diǎn)集中在形態(tài)學(xué)觀察、病原分離培養(yǎng)和鑒定，關(guān)于不同動(dòng)物感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的主要蟲(chóng)種及種類分布研究報(bào)道相對(duì)較少[6-7]。本試驗(yàn)針對(duì)內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)18S rRNA基因設(shè)計(jì)引物，對(duì)云南大理的賓川、洱源、巍山3個(gè)地區(qū)隨機(jī)采集的奶牛糞樣進(jìn)行檢測(cè)，以了解該地區(qū)的感染狀況及奶牛感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的主要蟲(chóng)種及種類分布，以期為該地區(qū)內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染的防治提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2019年10月至2019年12月從大理賓川、洱源和巍山地區(qū)共采集了113份奶牛糞便樣品，其中賓川59份，洱源18份、巍山36份。將采集的樣品送至云南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，置于4℃冰箱，保存待用。

1.1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，美國(guó)OMEGA公司產(chǎn)品；10×Taqbuffer(Mg2+free)、dNTPs Mixture、MgCl2、r-Taq酶、DNA Marker DL 2000、6×Loading buffer等，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；GelStain核酸染料，北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 高速臺(tái)式離心機(jī)(Model CF-10)，Wise Spin公司產(chǎn)品；PCR儀(PTC-1148)，Bibby Scientific公司產(chǎn)品；瞬時(shí)迷你離心機(jī)(Min-6K)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；電泳儀(BG-subMINI)、紫外分析儀(WGD-30)，BAYGENE公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取適量糞便于燒杯中，加自來(lái)水?dāng)噭蚝笥?0目銅篩過(guò)濾至50 mL離心管中，平衡后3000 r/min離心3 min，棄上清，吸取250 μL沉淀，按照OMEGA公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(型號(hào)：Stool DNA Kit 200) 的說(shuō)明書(shū)提取樣品的DNA。對(duì)提取的DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)18S rRNA基因擴(kuò)增 基于小核糖體核苷酸(18S rRNA)基因?qū)悠愤M(jìn)行內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)檢測(cè)，參照Verweij J J等[8]設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體引物序列及相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)18S rRNA PCR基因擴(kuò)增引物Table 1 Table 1 PCR primers of 18 S rRNA gene Entamoeba

PCR反應(yīng)體系：雙蒸水15.875 μL，10×Taqbuffer(Mg2+free)2.5 μL，d NTPs Mixture 2.0 μL，MgCl21.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，r-Taq酶0.125 μL，模板DNA 1.0 μL。

PCR擴(kuò)增條件：95℃(預(yù)變性)5 min；95℃(變性)0.5 min，57℃(退火)0.5 min，72℃(延伸)0.5 min，40次循環(huán)；72℃(變性)2 min；16℃結(jié)束反應(yīng)。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×Loading buffer混勻后加入10 g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，加入DNA Marker DL 2000 ，120 V電壓30 min。在紫外凝膠成像設(shè)備中拍照，回收600 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序與結(jié)果 在NCBI上分析內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)18S rRNA相關(guān)序列，使用MEGA7.0鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，自展值為1 000。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 按照不同地區(qū)及不同養(yǎng)殖方式劃分計(jì)算感染率，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2)，計(jì)算P值，比較不同條件下大理奶牛的感染率是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染情況

PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，113份奶牛糞樣中共從34份樣品中成功擴(kuò)增出條帶大小約為600 bp的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng) 18S rRNA基因的目的片段，總陽(yáng)性率為 30.09%(34/113)。部分陽(yáng)性樣品擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 不同地區(qū)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染情況

通過(guò)對(duì)云南大理3個(gè)地區(qū)的113份奶牛新鮮糞便樣品進(jìn)行內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的18S rRNA基因位點(diǎn)擴(kuò)增，結(jié)果顯示，本次調(diào)查的3個(gè)地區(qū)中均檢測(cè)到內(nèi)阿米巴感染(表2)，其中感染率最高的為賓川(32.20%)，洱源和巍山兩地感染率一致，3個(gè)地區(qū)優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種皆為E.bovis，在賓川地區(qū)還檢測(cè)出Entamoebasp.MG107/BEL感染。經(jīng)卡方檢驗(yàn)結(jié)果，這3個(gè)地區(qū)之間感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 不同地區(qū)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染率及感染蟲(chóng)種Table 2 Infection rate and species of Entamoeba in dairy cows in different areas

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～4.樣本；N.陰性對(duì)照；P.陽(yáng)性對(duì)照。M.DNAMarker DL 2 000;1-4.Samples;N.Negative control;P.Positive control.圖1 奶牛內(nèi)阿米巴18S rRNA基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of 18SrRNA gene of Entamoeba in cows

2.3 不同養(yǎng)殖方式奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染情況

檢測(cè)結(jié)果顯示，散養(yǎng)的奶牛內(nèi)阿米巴的感染率為25%(3/12)，規(guī)?；B(yǎng)殖的奶牛內(nèi)阿米巴的感染率為30.69%(31/101)，不同養(yǎng)殖條件下感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，散養(yǎng)奶牛只有E.bovis的檢出，規(guī)?；B(yǎng)殖還有Entamoebasp.MG107/BEL感染(表3)。

表3 不同養(yǎng)殖方式奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染率及感染蟲(chóng)種Table 3 Infection rate and species of Entamoeba in dairy cows with different breeding styles

2.4 序列比對(duì)分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)18S rRNA基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增與測(cè)序，共從34份陽(yáng)性樣品中成功獲得序列信息。其中分別有32份和2份樣本的序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的E.bovis和Entamoebasp.MG107/BEL序列相似性均達(dá)到95%以上。選擇3個(gè)地區(qū)代表性序列進(jìn)行種系發(fā)育關(guān)系的構(gòu)建，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，本研究中的序列BC12與E.bovis(MT734236)位于同一進(jìn)化支上，EY27與Entamoebasp.(MZ752345)位于同一進(jìn)化支上，WS53、EY27和BC12皆屬于E.bovis，BC67與Entamoebasp.MG107/BEL(MT734612)位于同一進(jìn)化支上，親緣關(guān)系最近(圖2)。

圖2 云南省奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)18S rRNA基因種系發(fā)育關(guān)系Fig.2 Phylogenetic relationship of 18SrRNA gene of Entamoeba in dairy cows in Yunnan province

3 討論

內(nèi)阿米巴屬原蟲(chóng)是可寄生于人和動(dòng)物腸道及其他內(nèi)臟器官的人獸共患原蟲(chóng)，屬內(nèi)種類較多[3]，廣泛存在于水和土壤中，可攜帶許多病原體，起到病原體的貯存宿主和傳播媒介的作用，嚴(yán)重危害人和動(dòng)物的健康[9]。大理州年溫差小，四季如春，適合肉牛和奶牛的生長(zhǎng)繁衍[10]，但是大理的養(yǎng)殖業(yè)存在受內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)侵害的風(fēng)險(xiǎn)，因此，有必要對(duì)該地區(qū)的奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染情況進(jìn)行調(diào)查。

3.1 大理地區(qū)奶牛感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)情況分析

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大理奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染率為30.09%(34/113)。與國(guó)外有關(guān)牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染的研究報(bào)道相比，Nolan M J等[11]對(duì)烏干達(dá)國(guó)家公園牲畜內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染率的研究發(fā)現(xiàn)牛和山羊感染率分別為80.0%和60.0%；Masuda A[12]等發(fā)現(xiàn)日本和牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)總感染率為72%。與國(guó)內(nèi)有關(guān)牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)調(diào)查結(jié)果相比，任玫[13]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)青海耗牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染率36.32%；胡蘇輝[14]在河北和天津地區(qū)檢測(cè)的奶牛內(nèi)阿米巴感染率為33.27%；趙霞等[15]在奶牛、黃牛和水牛中分別檢測(cè)到的感染率為9.89%、7.12%和13.21%。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果普遍比國(guó)外感染率低的原因可能是因?yàn)椴煌瑖?guó)家地理環(huán)境、采樣季節(jié)、樣品來(lái)源及養(yǎng)殖方式不同的影響，具體情況還需要進(jìn)一步分析原因。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)報(bào)道的大部分結(jié)果一致，而與趙霞等[15]相差較大，據(jù)筆者調(diào)研可知，其原因可能是趙霞等人選擇的是染色后鏡檢進(jìn)行檢查，而本試驗(yàn)選擇的PCR方法，PCR方法精確度更高，靈敏度更好，結(jié)果更加準(zhǔn)確，有更高的檢出率。由此可見(jiàn)，國(guó)內(nèi)外內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的感染率普遍較高，可能是因?yàn)榘⒚装驮x(chóng)普遍存在環(huán)境中，不易去除，容易通過(guò)環(huán)境傳播。

3.2 影響奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染差異分析

本研究采集了大理賓川、洱源和巍山3個(gè)地區(qū)糞樣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)賓川感染率最高(32.20%)，其余兩地感染率一致(27.78%)。從地理位置上來(lái)看，賓川縣位于大理州東部，洱源縣位于大理州北部，巍山縣位于在大理州南部，3個(gè)地區(qū)處于不同方位，賓川感染率高于洱源和巍山，洱源、巍山兩地感染率一致，但總體來(lái)看3個(gè)地區(qū)感染率差異不明顯，皆存在嚴(yán)重的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染。大理地處云南西部，氣候溫暖，雨量充沛，四季如春，適合寄生蟲(chóng)繁殖和傳播，但大理州內(nèi)不同地點(diǎn)感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)是否存在明顯差異，還需要進(jìn)一步采集不同地點(diǎn)大量樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。

本試驗(yàn)結(jié)果分析顯示，規(guī)?；B(yǎng)殖奶牛感染率(30.69%)略高于散養(yǎng)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染率(25%)。內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)生活方式簡(jiǎn)單，包囊在脫離宿主后可以存活很長(zhǎng)時(shí)間，且因?yàn)榘覍?duì)外界環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，一般難以去除，因此，包囊可以長(zhǎng)時(shí)間存在于環(huán)境中，污染養(yǎng)殖環(huán)境。散養(yǎng)奶牛較規(guī)?；B(yǎng)殖奶牛擁有更大的活動(dòng)范圍，因此它們之間彼此有相對(duì)較低的接觸率，互相感染可能性就會(huì)降低，而規(guī)?；酗曫B(yǎng)易造成內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的重復(fù)感染和交叉感染。但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)兩者差異不顯著，說(shuō)明云南大理奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染率較高。本次調(diào)查的奶牛除1頭為犢牛外，其余均在1歲～3歲，因此年齡對(duì)內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染是否存在影響不能得出結(jié)論，以后的研究可以取不同年齡階段的奶牛糞樣來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 大理地區(qū)奶牛感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)種類及遺傳進(jìn)化分析

在對(duì)18S rRNA基因的序列進(jìn)行Blast比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有32份樣品為E.bovis，2份樣品為Entamoebasp.MG107/BEL，E.bovis為大理地區(qū)奶牛感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)種，結(jié)果符合Stensvold C R等[16]的研究，即?？苿?dòng)物中內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染的流行蟲(chóng)種為E.bovis。目前從牛體內(nèi)檢測(cè)出的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)種類有E.bovis、Entamoebasp.RL2、Entamoebasp.RL4、Entamoebasp.RL5、Entamoebasp.RL9、E.moshkovskii和Entamoebasp.MG107/BEL[12,17]。國(guó)際上報(bào)道的從奶牛體內(nèi)檢出的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)種類只有E.bovis[18]。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大理地區(qū)奶牛主要感染E.bovis，符合前人的研究，同時(shí)還檢出了Entamoebasp.MG107/BEL感染，豐富了奶?？筛腥緝?nèi)阿米巴原蟲(chóng)蟲(chóng)種。內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)分布范圍廣泛，易感動(dòng)物較多[19]，目前國(guó)際上僅公認(rèn)E.histolytica是唯一具有致病性的內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)[20]，對(duì)動(dòng)物和人具有侵襲性。但也有學(xué)者提出內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)其他蟲(chóng)株雖然不具有致病性，但是在某些病原體作用下，可能會(huì)加重疾病嚴(yán)重程度。根據(jù)遺傳進(jìn)化樹(shù)分析顯示，本研究獲得的多個(gè)序列，均與參考序列E.bovis聚在同一分支，最后與內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)其他種屬匯成一大分支。雖然目前研究及進(jìn)化樹(shù)皆顯示E.bovis不屬于人畜共患內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)蟲(chóng)種，但是對(duì)于此蟲(chóng)種可能攜帶傳播其他病原體的作用不能忽視。

3.4 大理地區(qū)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的防治

水源性和食源性傳播是內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)主要傳播方式，同時(shí)鼠類和昆蟲(chóng)能作為傳播媒介，這就導(dǎo)致內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)很容易在人和動(dòng)物中自然傳播[5]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)大理3個(gè)地區(qū)奶牛均存在內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)感染，因此，應(yīng)引起重視，并加強(qiáng)防控。首先，在奶牛日常管理中，應(yīng)保持飲水和養(yǎng)殖環(huán)境衛(wèi)生，消滅養(yǎng)殖場(chǎng)周?chē)箢惡屠ハx(chóng)，切斷傳播途徑；同時(shí)，對(duì)于規(guī)?；膛?chǎng)應(yīng)該及時(shí)清理糞便，做好無(wú)害化處理，避免對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境造成污染；對(duì)于散養(yǎng)戶應(yīng)該加強(qiáng)防控宣傳，做好個(gè)人防護(hù)；奶牛和養(yǎng)殖人員接觸較多，應(yīng)同時(shí)對(duì)人和奶牛進(jìn)行定期檢查；大理州氣候溫暖濕潤(rùn)，要做好牛舍防雨和墊料干燥處理；對(duì)于已感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的奶牛選用甲硝唑進(jìn)行隔離治療，當(dāng)糞便中無(wú)內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)檢出1周后才可放回牛舍中飼養(yǎng)。

本次檢測(cè)結(jié)果表明，在云南大理地區(qū)奶牛中存在E.bovis和Entamoebasp.MG107/BEL感染，豐富了奶牛感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)蟲(chóng)種，其中E.bovis為大理地區(qū)中奶牛感染內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)種。雖然E.bovis并不感染人，但有研究表明內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)可攜帶其他病原體，與其他病原體協(xié)同作用加強(qiáng)疾病反應(yīng)，從而影響人和動(dòng)物的健康，因此需要引起注意并加強(qiáng)防控。本研究結(jié)果明確了云南大理地區(qū)奶牛內(nèi)阿米巴原蟲(chóng)的流行情況和主要種屬，為制定有效的防控措施提供數(shù)據(jù)支持。