7株羊源大腸埃希氏菌的分離鑒定及相關(guān)耐藥基因的研究

崔羽茜，丹雨晴，武慧敏，陳海霞，向 華*，任玉鵬，朱江江

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用，四川省重點實驗室，四川成都 610041)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)俗稱大腸桿菌，是一種常見的致病菌，不僅可以感染多種動物，還可以通過食物鏈或直接接觸傳播給人類，給人類帶來潛在威脅[1]。大腸埃希氏菌主要侵害6周齡內(nèi)的羔羊，以消化道為主要傳播途徑，以腹瀉和敗血癥為主要特征，感染率與病死率較高，給養(yǎng)羊業(yè)造成了很大的危害[2]。目前隨著養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)模化發(fā)展，抗生素作為治療大腸埃希氏菌感染的一類有效藥物，廣泛使用于畜禽的養(yǎng)殖過程中，但由于抗生素的不規(guī)范使用，造成大腸埃希氏菌耐藥性較為嚴(yán)重，耐藥譜增寬，甚至產(chǎn)生了多重耐藥的情況。近年來，研究者們對國內(nèi)外的不同大腸埃希氏菌分離菌株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果顯示大腸埃希氏菌的耐藥率較高，其中包括人和動物常用的抗生素卡那霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星等藥物[3-5]。

細(xì)菌耐藥性的來源有兩個途徑，分別是自身基因突變和耐藥基因的獲得。自身基因突變是一種自發(fā)性隨機事件，機率小，且不穩(wěn)定，無論抗菌藥物是否存在都有可能發(fā)生。但如果有抗菌藥物選擇壓力的存在，敏感細(xì)菌繁殖受到抑制甚至殺死，而攜帶有耐藥基因的突變菌株卻具有生存優(yōu)勢，最終留下耐藥亞群，是造成目前如此嚴(yán)峻耐藥局面的主要原因[6]。然而，目前關(guān)于大腸埃希氏菌耐藥基因的研究主要圍繞禽類和仔豬，對羊源大腸埃希氏菌的研究比較少，羊大腸埃希氏菌病的臨床治療和用藥資料不足。

因此，本試驗選取了11種抗生素對7株大腸埃希氏菌進(jìn)行藥物敏感性試驗，結(jié)合PCR方法，對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、喹諾酮類共24種耐藥基因進(jìn)行檢測分析，探索羊源大腸埃希氏菌的耐藥表型及耐藥基因的攜帶情況，以期為臨床中羊大腸埃希氏菌病的防控和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 四川省某規(guī)模化羊場，2021年存欄2 000只，采集50份小腸段，將采集樣品立即置于無菌采樣袋內(nèi)，冰盒內(nèi)保存，立即帶回實驗室進(jìn)行細(xì)菌學(xué)分析。

1.1.2 主要試劑 麥康凱培養(yǎng)基、胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic sony agar,TSA)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(Tryptic sony broth,TSB)、革蘭氏染色液、腸桿菌科生化鑒定管、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PremixTaq成都市蓉為基因生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Ladder Marker DL 2 000，US ERVRBRIGHT?INC公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 TC-96/G/H(b)C基因擴增儀，杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；Legend Micro 21高速離心機，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；DHG-9203A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離純化 在超凈工作臺內(nèi)，使用接種環(huán)將采集的50份小腸段，采用連續(xù)劃線法將其樣本分別接種于高壓滅菌后的麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察細(xì)菌的生長情況及菌落特征。選取在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后的單個粉紅色菌落進(jìn)行革蘭氏染色。染色鏡檢觀察到符合大腸埃希氏菌形態(tài)特征的細(xì)菌后，將菌落的剩余部分接種于TSB液體培養(yǎng)基當(dāng)中，置于37℃搖床培養(yǎng)16 h。挑取菌液在無菌條件下劃線接種于新的麥康凱培養(yǎng)基上，如此連續(xù)進(jìn)行3次純培養(yǎng)。對純化后的細(xì)菌再次進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 大腸埃希氏菌的鑒定

1.2.2.1 生化鑒定 在超凈工作臺中，從純培養(yǎng)的麥康凱培養(yǎng)基上長出的粉紅色菌落或者伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上長出的黑色帶有金屬光澤的菌落，用接種針挑取純化的待檢菌單菌落垂直接種到腸桿菌科生化鑒定管內(nèi)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h～48 h。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 參考董映輝[7]等人的研究，用16S rRNA引物進(jìn)行PCR鑒定，引物的序列及擴增片段長度見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增體系(25 μL)∶Taq酶12.5 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，其余用ddH2O補足。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測陽性的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與GenBank中登錄參考株進(jìn)行同源性分析，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥99%判定。

表1 16S rRNA引物信息Table 1 16S rRNA primer information

1.2.3 大腸埃希氏菌的增菌及保種 在超凈工作臺中，從純培養(yǎng)的麥康凱培養(yǎng)基上挑取單個菌落，加入準(zhǔn)備好的TSB液體培養(yǎng)基，封口，放入37℃恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)菌到對數(shù)生長期，將菌液和甘油按照3∶2進(jìn)行混勻，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 藥敏試驗 本試驗采用K-B紙片法。從培養(yǎng)17 h平板上的菌落上挑取數(shù)個單個菌落，直接接種9 g/L生理鹽水制成菌懸液，使用比濁儀調(diào)整懸液的濁度使其達(dá)到0.5麥?zhǔn)蠁挝弧Ｓ靡埔簶寣?50 μL菌懸液接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用無菌涂布棒涂抹均勻，使細(xì)菌密布于培養(yǎng)基的每個角落，藥物敏感紙片貼于培養(yǎng)基內(nèi)，保證每個藥敏片之間距離相等。放置37℃溫箱培養(yǎng)18 h后觀察有無抑菌圈及抑菌圈大小。用直尺測量肉眼觀察到的抑菌圈，抑菌圈的邊緣以肉眼看不到細(xì)菌生長為限，每個菌環(huán)測量3次取其平均值。按照世界臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會推薦的標(biāo)準(zhǔn)(見http://www.hangweimedia.com/support/t_doc/2018-03-09/6.html)，對7株大腸埃希氏菌進(jìn)行了15種抗菌藥物的耐藥性檢測，結(jié)果可分為敏感、中介、耐藥3種。

1.2.5 耐藥基因檢測 根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)合成四大類共24對耐藥基因引物，引物信息見表2，引物由上海生工生物工程有限公司合成。分別提取7株大腸埃希氏菌的DNA作為模板，進(jìn)行耐藥基因的PCR檢測，耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺類blaTEM-1基因、氨基糖苷類rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA、armA基因、四環(huán)素類Tet(A)、Tet(C)、Tet(D)、Tet(E)、Tet(L)、Tet(W)、Tet(O)、Tet(M)、Tet(K)基因，喹諾酮類qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、oqxA、qepA基因。PCR擴增體系：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O補足至25 μL。擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性5 s，退火溫度見表2，72℃延伸1 min，72℃再次延伸10 min，共35個循環(huán)。擴增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

表2 耐藥基因引物信息Table 2 Primer information for drug resistance genes

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及鏡檢

從所有樣品中分離出7株疑似大腸埃希氏菌，分離率為14%(7/50)。純培養(yǎng)后的細(xì)菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形、濕潤、半透明、隆起的乳白色中等大小菌落(圖1A);在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基形成黑色的帶金屬光澤的菌落(圖1B)；在麥康凱培養(yǎng)基上長出粉紅色菌落(圖1C)，符合大腸埃希氏菌的形態(tài)學(xué)特征。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，細(xì)菌為散在排列的革蘭氏陰性短桿菌(圖1D)。

2.2 大腸埃希氏菌的生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果見表3，7株經(jīng)過純培養(yǎng)的菌株均符合大腸埃希氏菌生化特征。

A.普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B.伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；C.麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；D.革蘭氏染色鏡檢結(jié)果A.Colony morphology on common agar medium;B.Colony morphology on eosinmeilan medium;C.Colony morphology on McConkey's culture medium;D.Results of Gram stain microscopic examination圖1 疑似大腸埃希氏菌的菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果Fig.1 Colony morphology and microscopic examination results of suspected Escherichia coli

表3 腸桿菌科GYZ-15e編碼鑒定結(jié)果Table 3 Identification of coding results of Enterobacteriaceae GYZ-15e

2.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在1 500 bp左右出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶(圖2)。進(jìn)一步測序分析結(jié)果顯示，7個基因序列與GenBank中登錄的大腸埃希氏菌參考株序列同源性均高于99%，表明所分離的菌株為7株不同的大腸埃希氏菌。經(jīng)MegAlign分析，7株大腸埃希氏菌之間同源性為95.5%～99.0%(圖3)。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

藥物敏感性的結(jié)果顯示，7株大腸埃希氏菌對多西環(huán)素、慶大霉素、大觀霉素、丁胺卡那、氧氟沙星、左氧氟沙星和恩諾沙星等高度敏感；對阿莫西林全部耐藥；對氨芐西林、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥率分別為42.86%(3/7)、71.42%(5/7)、28.57%(2/7)(表4)。

表4 藥敏試驗結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity test

M.DNA Marker DL 2 000;1～7.依次為7株大腸埃希氏菌編號;N.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1-7.7 strains of Escherichia coli;N.Negative control圖2 16S rRNA PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.2 Gel electrophoresis of 16S rRNA PCR amplification products

2.5 大腸埃希氏菌多重耐藥結(jié)果分析

多重耐藥試驗結(jié)果顯示，并無對所選的抗生素全部耐藥的大腸埃希氏菌，且存在單獨耐藥的大腸埃希氏菌，7株菌株表現(xiàn)出一定的多重耐藥性，其中對3種抗菌藥物耐藥的菌株占42.86%(3/7)。

2.6 大腸埃希氏菌的耐藥基因檢測結(jié)果

耐藥基因檢測結(jié)果顯示(表5)，7株分離菌株中，β-內(nèi)酰胺類blaTEM-1基因檢測的攜帶率為100.00%；氨基糖苷類rmtB、rmtC、rmtD基因檢測的攜帶率均為14.29%；四環(huán)素類耐藥基因攜帶率為0～71.43%，其中Tet(A)基因攜帶率最高，為71.43%；喹諾酮類耐藥基因攜帶率為0～71.43%，其中qnrS、oqxA基因攜帶率最高，均為71.43%；其余耐藥基因攜帶情況見表5。

表5 耐藥基因檢測結(jié)果Table 5 Drug resistance gene test results

3 討論

大腸埃希氏菌主要引起羊的出血性胃腸炎及急性敗血癥，也會引起羊肺炎、成年羊流產(chǎn)、腦膜炎等的并發(fā)癥或混合感染[16]。檢測耐藥基因?qū)Ψ乐巩a(chǎn)生細(xì)菌耐藥性、探索細(xì)菌耐藥機制具有重要意義[17]。本研究從四川地區(qū)分離的7株大腸埃希氏菌對阿莫西林表現(xiàn)出全部耐藥，對氨芐西林、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥率分別為42.86%(3/7)、71.42%(5/7)、28.57%(2/7)，其中耐3種藥物菌株占分離菌株的42.86%(3/7)，說明從四川地區(qū)分離的羊源大腸埃希氏菌對常用的抗菌藥產(chǎn)生了較強的耐藥性，且呈現(xiàn)了一定的多重耐藥性。提示在發(fā)生該病時和日常防控中應(yīng)該合理使用抗生素，穿梭用藥以減少耐藥性產(chǎn)生。

大腸埃希氏菌耐藥性的產(chǎn)生不僅與使用抗菌藥物的頻率有關(guān)，還與攜帶的耐藥基因有關(guān)。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機制，它通過水解β-內(nèi)酰胺環(huán)從而滅活β-內(nèi)酰胺類抗生素[18]。其中TEM型酶是目前數(shù)量最多的一類β-內(nèi)酰胺酶，我國所分布的TEM酶以TEM-1型最常見[19]。本試驗中，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM-1的攜帶率高達(dá)100%，與舒剛[20]等人的研究中84.09%的檢出率相似，結(jié)合該養(yǎng)殖場的用藥情況，這可能與阿莫西林等抗菌藥物的長期使用有關(guān)。

氨基糖苷類藥物的耐藥機制之一是16S rRNA甲基化酶(16S RNA methylase,Rmt)的介導(dǎo)，它是通過改變氨基糖苷類抗生素的作用靶位，將甲基集團(tuán)添加到16S rRNA的特定核苷酸上，從而干擾氨基糖苷類抗生素與核糖體的結(jié)合[21]。現(xiàn)階段研究表明，甲基化位點主要有2個，分別是核苷酸G1405的N7位和核苷酸A1408的N1位[22]。本研究檢測的7種氨基糖苷類耐藥基因中，rmtB、rmtC、rmtD的檢出率均為14.29%(1/7)，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，rmtC主要在日本流行[23]，rmtD主要在巴西流行[24]，中國主要流行armA和rmtB[25]。本試驗首次在我國西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)rmtC和rmtD耐藥基因，提示氨基糖苷類耐藥基因可由流行的armA和rmtB向不常見的rmtC和rmtD進(jìn)行轉(zhuǎn)變演化。

Tet屬于6個外排泵家族中的MFS家族(主要協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白超家族)外排泵，MFS家族是一種交替開放模型，轉(zhuǎn)運蛋白能夠在向胞外開放和向胞內(nèi)開放的構(gòu)象之間變化，轉(zhuǎn)運蛋白上的底物結(jié)合位點暴露在細(xì)胞膜的不同側(cè)，底物從細(xì)胞膜的一側(cè)結(jié)合到蛋白上，而從另一側(cè)被釋放[26]。Tet主要與細(xì)菌對四環(huán)素耐藥性有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，Tet外排泵突變可介導(dǎo)細(xì)菌對部分四環(huán)素類藥物產(chǎn)生耐藥。大多數(shù)四環(huán)素外排泵對四環(huán)素具有抗藥性，但對第二代多西環(huán)素的抗藥性較差[27]，這與本試驗的結(jié)果相符。Tet(A)是革蘭陰性菌中最常見的四環(huán)素抗性決定簇[28]，近年來的國內(nèi)外研究都表明，Tet(A)這一外排基因都在檢測樣本中大量檢出，根據(jù)其主動外排的耐藥特性，提示可以通過研究外排泵的抑制劑或者導(dǎo)致外排泵突變的藥物來使其主動外排系統(tǒng)表達(dá)的活躍度降低，以此達(dá)到使耐藥菌的耐藥性能下降的目的。

喹諾酮類藥物的耐藥機制主要有作用靶點DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的突變、介導(dǎo)喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的獲得和染色體的突變[15]。介導(dǎo)喹諾酮類耐藥質(zhì)粒的獲得，是近年來主要研究的一種耐藥機制，如已發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)喹諾酮類低水平耐藥的qnrA、qnrS、qnrB、qnrD和qnrC基因，多藥轉(zhuǎn)運泵出系統(tǒng)家族中外排泵qepA和oqxA等，這些基因位于質(zhì)粒上，故被稱為質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)因子[29]。本試驗檢測的7種喹諾酮類耐藥基因中，qnrS、oqxA基因的攜帶率達(dá)到71.43%(5/7)，qnrD的攜帶率達(dá)到57.14%(4/7)，但是7株分離株對3種喹諾酮類藥物均不表現(xiàn)耐藥性。這3種基因?qū)儆诮閷?dǎo)質(zhì)粒的獲得這一種機制，但并沒有引起7株大腸埃希氏菌產(chǎn)生耐藥性，這與王婧[30]等人的研究中提到的，質(zhì)粒的獲得一般只引起低水平耐藥這一觀點相符。盡管PMQR基因僅引起細(xì)菌對喹諾酮類藥物低水平耐藥，但其可使細(xì)菌突變頻率增高﹐誘發(fā)細(xì)菌產(chǎn)生高水平的耐藥，可對染色體介導(dǎo)的喹諾酮耐藥起重要的輔助作用，或促進(jìn)編碼DNA促旋酶的基因的突變和編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的基因的突變，從而引起高水平的耐藥[26,31]。此外，PMQR基因位于質(zhì)粒上，導(dǎo)致喹諾酮耐藥性在人畜病原菌間的迅速擴散成為可能﹐存在引發(fā)公共安全事件的風(fēng)險，需在生產(chǎn)實踐中密切關(guān)注和跟蹤監(jiān)測，嚴(yán)控PMQR因子向多樣化擴展。

本研究通過了解四川某規(guī)?；B(yǎng)殖場羊源大腸埃希氏菌的耐藥表型及耐藥基因的攜帶情況，可為該羊場的大腸埃希氏菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。