山羊胰腺腺泡細(xì)胞體外分離、純化、培養(yǎng)和鑒定

張?zhí)煳?燕愛飛 楊 超 程 艷 賀志雄* 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南省畜禽健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所公共技術(shù)中心，長沙410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

反芻動(dòng)物小腸內(nèi)過瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)的消化受到胰腺外分泌功能的限制[1]。胰腺淀粉酶分泌不足可導(dǎo)致40%的過瘤胃淀粉消化不完全[2]，表現(xiàn)出胰腺外分泌功能不足。開展胰腺腺泡細(xì)胞分離培養(yǎng)工作對(duì)于進(jìn)一步從細(xì)胞分泌、配體結(jié)合、底物攝取、蛋白質(zhì)合成或第二代信使等角度解析反芻動(dòng)物胰腺外分泌功能不足機(jī)制，并建立可能的營養(yǎng)調(diào)控策略具有重要意義。

在細(xì)胞水平上對(duì)胰腺外分泌功能的探索始于20世紀(jì)70年代[3]。并已逐步建立了各類動(dòng)物的胰腺腺泡細(xì)胞分離方法，包括人、豬、牛和鼠類等[4-7]。然而，目前尚未見山羊胰腺腺泡細(xì)胞的原代細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法相關(guān)報(bào)道。且在已有的培養(yǎng)方法中，消化各動(dòng)物胰腺腺泡細(xì)胞所使用的消化酶和消化時(shí)間各有不同，鑒定工作也鮮有報(bào)道。

膠原酶是在細(xì)胞解離工作中被廣泛應(yīng)用的消化酶，本試驗(yàn)主要評(píng)估不同濃度膠原酶Ⅳ和消化時(shí)間對(duì)山羊胰腺腺泡細(xì)胞的解離效果，優(yōu)化山羊胰腺腺泡細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，以期快速分離出足量且活性良好的胰腺腺泡細(xì)胞并穩(wěn)定培養(yǎng)，為反芻動(dòng)物胰腺外分泌功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

主要儀器包括：超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司)、恒溫?fù)u床(KYC-100C，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)、二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(3111，Thermo Fisher公司，美國)、全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countess?Ⅱ FL，Thermo Fisher公司，美國)、倒置熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica公司，德國)、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM880，Zesiss公司，德國)、共聚焦培養(yǎng)皿(BS-15-GJM，北京蘭杰柯科技有限公司)等。

主要試劑包括：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、無鈣鎂磷酸緩沖液(DPBS)、磷酸緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶消化液，均購自美國Gibco公司；膠原酶Ⅳ、重組人胰島素、表皮生長因子(EGF)，均購自德國Biofroxx公司；青鏈霉素混合液、慶大霉素、兩性霉素b、均購自北京索萊寶科技有限公司；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)，購自北京凱詩源生物科技有限公司；兔抗羧肽酶A1(CPA1)(一抗)，購自美國Proteintech公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(二抗)，購自上海翊圣生物科技有限公司；通用固定液，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；牛血清蛋白(BSA)，購自北京伊塔生物科技有限公司；TritonX-100，購自美國Sigma公司；抗熒光淬滅劑[含染核試劑4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)]，購自江蘇碧云天生物研究所。

具體試劑配制如下：1)清洗液配制。向PBS(500 mL)中加入100×青鏈霉素混合液，使青鏈霉素混合液稀釋成10×，文中稱10×清洗液，將配制好的清洗液分裝成實(shí)驗(yàn)室外用和內(nèi)用2部分，外用部分用于屠宰取樣時(shí)清洗胰腺組織，內(nèi)用部分用于消化解離時(shí)對(duì)胰腺組織反復(fù)清洗。試驗(yàn)前配制，用前先預(yù)冷。2)轉(zhuǎn)移液配制。向DMEM/F12培養(yǎng)基(50 mL)中加入100×青鏈霉素混合液，使青鏈霉素混合液稀釋成10×，文中稱10×轉(zhuǎn)移液。取樣完成后將胰腺組織置于轉(zhuǎn)移液中運(yùn)送至細(xì)胞培養(yǎng)室，轉(zhuǎn)移液起保護(hù)作用。試驗(yàn)前配制，使用時(shí)全程置于冰上。3)培養(yǎng)基配制。用DMEM/F12培養(yǎng)基(500 mL)配制，在試驗(yàn)過程中需用青鏈霉素混合液濃度不同的2種培養(yǎng)基，原代培養(yǎng)需將青鏈霉素混合液稀釋成10×，傳代培養(yǎng)稀釋成2×。此外還包含10%的FBS、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF、2.5 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素b。試驗(yàn)前配制。4)消化液配制。運(yùn)用DMEM/F12培養(yǎng)基將膠原酶Ⅳ配制成1.0和0.5 mg/mL 2個(gè)濃度的消化液，且都添加終濃度為0.001 mol/mL的EGTA。試驗(yàn)前配制，使用前37 ℃預(yù)熱。5)抗體稀釋。根據(jù)說明書用2%的BSA稀釋。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

本研究的試驗(yàn)過程根據(jù)中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)進(jìn)行。選取3月齡且健康狀況良好的雌性湘東黑山羊進(jìn)行屠宰，屠宰前禁食4 h以上。放血完畢后及時(shí)解剖暴露胰腺，在用預(yù)冷的10×清洗液不斷沖洗的同時(shí)，迅速采取胰腺組織。適當(dāng)剔除血管及筋膜，反復(fù)用10×清洗液清洗4～5遍后放入預(yù)先配制的10×轉(zhuǎn)移液中，置于冰上及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 消化酶的消化效率

在正式進(jìn)行山羊胰腺腺泡細(xì)胞分離培養(yǎng)前，先探索適宜的消化時(shí)間、消化酶濃度及消化酶種類，以尋求更高的消化效率。運(yùn)用1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ作為山羊胰腺腺泡細(xì)胞消化解離的消化液，尋找在山羊胰腺組織上適宜的消化時(shí)間，設(shè)置15、20、25、30和35 min連續(xù)5個(gè)消化時(shí)間梯度；在得到適宜的消化時(shí)間后，進(jìn)行1.0和0.5 mg/mL 2個(gè)濃度膠原酶Ⅳ消化液消化解離20 min后的比較；在驗(yàn)證過膠原酶Ⅳ的適宜濃度及消化時(shí)間后，用0.25%胰蛋白酶作為消化液來對(duì)比1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ。消化解離結(jié)束后進(jìn)行總細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活率檢測(cè)。

具體操作步驟如下：1)預(yù)先用DMEM/F12配制50 mL濃度為1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ，配制10 mL濃度為0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ及準(zhǔn)備10 mL 0.25%胰蛋白酶。為得到更多的單細(xì)胞及減少細(xì)胞碎片，在3種消化液中添加EGTA，終濃度稀釋至0.001 mol/mL。2)將取回的胰腺組織帶回?zé)o菌細(xì)胞培養(yǎng)室，將胰腺組織從轉(zhuǎn)移液中出。由于胰腺組織樣品量有限，將采集的胰腺組織切分成1 g重量小塊。3)將切分稱重完的胰腺組織塊置于超凈工作臺(tái)上。在10 cm培養(yǎng)皿中加適量10×清洗液，將組織塊浸泡于其中，仔細(xì)剔除胰腺組織上多余的筋膜及脂肪組織。之后用清洗液重復(fù)清洗2～3遍，洗完后將每份胰腺組織剪切成1～3 mm3的小塊，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中再用清洗液清洗3～5遍。1 000 r/min離心2 min，去除多余液體。4)取5份清洗完的并剪碎的組織塊各添加10 mL 1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ消化液，用錫箔紙包裹離心管避光置于37 ℃、80 r/min的恒溫?fù)u床上消化。設(shè)置15、20、25、30和35 min消化時(shí)間梯度。5)每個(gè)消化時(shí)間節(jié)點(diǎn)結(jié)束后迅速加入5 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化，反復(fù)吹打之后1 000 r/min離心5 min棄上清。6)再添加5 mL含F(xiàn)BS的DMEM/F12混勻沉淀，用70 μm的細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液，取每個(gè)離心管收集到的少量懸液在顯微鏡下觀察消化狀態(tài)，每個(gè)離心管取3個(gè)平行樣用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞活率檢測(cè)和細(xì)胞計(jì)數(shù)。7)再取2份清洗完且剪碎的組織塊置于15 mL無菌無酶離心管中，分別加入10 mL濃度為0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ和10 mL 0.25%胰蛋白酶。用錫箔紙包裹避光置于37 ℃、80 r/min的恒溫?fù)u床上消化20 min。之后重復(fù)步驟5)和6)。

1.3.2 原代山羊胰腺腺泡細(xì)胞分離

具體操作步驟如下：1)將采集的胰腺組織塊通過轉(zhuǎn)移液運(yùn)回細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室。在無菌超凈工作臺(tái)上將胰腺組織取出，置于盛有清洗液的10 cm無菌培養(yǎng)皿中仔細(xì)剔除胰腺組織上多余的筋膜及脂肪組織。2)再用DPBS清洗3～5遍后將胰腺組織剪切成1～3 mm3的小塊，使其能夠被移液槍吸取。將剪好的胰腺組織塊轉(zhuǎn)移到15 mL無菌無酶離心管中，用含10×青鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗5～6遍，最后1 000 r/min離心5 min棄上清。3)添加上述試驗(yàn)驗(yàn)證出的膠原酶Ⅳ 10 mL，用錫箔紙裹上離心管避光置于37 ℃、80 r/min的恒溫?fù)u床上消化20 min。4)消化結(jié)束后迅速加入5 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化，之后1 000 r/min離心5 min棄上清。5)添加5 mL含10% FBS、10×青鏈霉素混合液、2.5 μg/mL慶大霉素、2.5 μg/mL兩性霉素、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF的DMEM/F12混勻沉淀，用70 μm的細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液。6)600×g、5 min離心，去上清，重懸接種到培養(yǎng)皿，調(diào)整接種密度為3×105個(gè)細(xì)胞/cm2，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1 d后觀察貼壁及污染情況，若無問題則更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。此后每天換1次液，整個(gè)過程中盡量避免劇烈晃動(dòng)。

1.3.3 胰腺腺泡細(xì)胞的純化及傳代培養(yǎng)

在原代胰腺腺泡細(xì)胞傳第1代時(shí)進(jìn)行細(xì)胞純化工作。采取差時(shí)消化、差速貼壁及細(xì)胞刮取等方法來對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行純化。

差時(shí)消化：利用細(xì)胞之間對(duì)消化酶的敏感性存在差異以及胰腺腺泡細(xì)胞的自身特性對(duì)胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行純化。具體操作步驟如下：1)去除培養(yǎng)基后，靜置2 min，用加2 mL PBS輕輕沖洗，會(huì)有一定量的細(xì)胞脫落。2)迅速收集脫落的細(xì)胞到15 mL無菌無酶離心管中，加2 mL含10% FBS的DMEM/F12，輕輕吹打后1 000 r/min離心5 min棄上清，用1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種。3)向步驟1)培養(yǎng)皿清洗過的細(xì)胞中加入1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，搖晃鋪平后靜置2 min，不用放進(jìn)培養(yǎng)箱。加3 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化，輕輕沖洗，將脫落的細(xì)胞收集到無菌離心管中輕輕吹打幾下，1 000 r/min離心5 min棄上清，用1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種。4)向未脫落的細(xì)胞中加1.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化液，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中3 min；當(dāng)細(xì)胞完全消化脫落時(shí)加3 mL含10% FBS的DMEM/F12終止消化。1 000 r/min離心5 min棄上清，用1 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種。

差速貼壁：根據(jù)各細(xì)胞間貼壁的時(shí)間存在差異來純化得到胰腺腺泡細(xì)胞。具體操作步驟如下：1)結(jié)合上述差時(shí)消化接種的細(xì)胞，在接種后不同時(shí)間段觀察貼壁情況。2)若在各時(shí)間點(diǎn)觀察到有一定數(shù)量的貼壁細(xì)胞，則將懸液轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿繼續(xù)貼壁，原培養(yǎng)皿加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞刮?。航?jīng)過差時(shí)消化和差速貼壁處理后，會(huì)有形態(tài)比較均一的細(xì)胞成片生長。將形態(tài)均一、成簇生長的細(xì)胞用細(xì)胞刮子刮落，轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。或者將除形態(tài)均一、成簇生長以外的細(xì)胞刮去，沖洗過后繼續(xù)培養(yǎng)。

經(jīng)過以上處理得到形態(tài)均一、純度較高的胰腺腺泡細(xì)胞后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)用含10% FBS、2×青鏈霉素混合液、2.5 μg/mL慶大霉素，2.5 μg/mL兩性霉素、10 μg/mL胰島素、10 ng/mL EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。同時(shí)進(jìn)行胰腺腺泡細(xì)胞鑒定工作。

1.3.4 胰腺腺泡細(xì)胞的鑒定

利用免疫熒光技術(shù)對(duì)所培養(yǎng)的胰腺腺泡細(xì)進(jìn)行鑒定。具體操作步驟如下：1)將純化后的胰腺腺泡細(xì)胞接種到共聚焦小皿置于37 ℃、5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2)當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至70%以上時(shí)棄培養(yǎng)基，用1～2 mL PBS浸洗3次，每次3 min。3)添加1～2 mL常溫的4%多聚甲醛后將培養(yǎng)皿置于4 ℃固定細(xì)胞30 min，固定結(jié)束后吸出多聚甲醛，緩慢加入PBS浸洗3次，每次5 min。4)配制0.2% TritonX-100(PBS配制)加1 mL至培養(yǎng)皿，室溫下通透20 min。吸出0.2% TritonX-100，再用PBS浸洗3次，每次5 min。5)加入1 mL 2% FBS，室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后吸出封閉液，切勿再次浸洗，向培養(yǎng)皿加入足量的一抗(CPA1稀釋比例根據(jù)說明書，用2% BSA稀釋)，置于4 ℃過夜。6)次日取出培養(yǎng)皿，每孔加入1～2 mL PBS，浸洗3次，每次5 min，吸出PBS，加入足量的熒光二抗(FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG稀釋比例根據(jù)說明書，用2% BSA稀釋)，室溫下孵育1 h。7)加入2 mL PBS，浸洗3次，每次5 min，吸出PBS，加入抗熒光淬滅劑，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活率檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進(jìn)行初步整理后，采用SPSS 25.0軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 消化酶消化效率對(duì)比

圖1-a顯示出各消化時(shí)間顯微鏡下觀察得到的消化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)的數(shù)量并不多，存在更多數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞。隨消化時(shí)間的增長，解離得到的細(xì)胞密度逐漸增加，但組織碎片也隨之增多。圖1-b顯示隨消化時(shí)間的逐步延長，消化得到的總細(xì)胞數(shù)從1.407×106個(gè)/mL逐步增長到5.262×106個(gè)/mL。圖1-c顯示細(xì)胞活率在消化20 min時(shí)達(dá)到91%，消化20 min后細(xì)胞活率逐漸降低，消化時(shí)間為35 min時(shí)細(xì)胞活率低至74%，為5個(gè)消化時(shí)間節(jié)點(diǎn)最低值。

圖2顯示了1.0和0.5 mg/mL 2個(gè)濃度膠原酶Ⅳ消化胰腺組織20 min后的比較結(jié)果。顯微鏡下觀察消化狀態(tài)見圖2-a，結(jié)果顯示0.5 mg/mL的膠原酶Ⅳ存在著比單個(gè)細(xì)胞數(shù)量還多的細(xì)胞碎片，且單個(gè)細(xì)胞數(shù)量也明顯沒有1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ充足。圖2-b顯示0.5 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化得到的總細(xì)胞數(shù)為8.032×105個(gè)/mL，遠(yuǎn)低于1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化得到的總細(xì)胞數(shù)(2.275×106個(gè)/mL)。同時(shí)圖2-c顯示0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ消化的細(xì)胞活率(83%)也低于1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ消化的細(xì)胞活率(91%)。

a：消化狀態(tài)(100×)；b：總細(xì)胞數(shù)；c：細(xì)胞活率。

圖3-a顯示胰蛋白酶雖有較少的細(xì)胞碎片，但消化得到的總細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活率均低于膠原酶Ⅳ。圖3-b顯示0.25%胰蛋白酶解離胰腺組織20 min得到的總細(xì)胞數(shù)低于1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ消化得到的總細(xì)胞數(shù)。圖3-c顯示胰蛋白酶消化得到的細(xì)胞活率僅為80%，低于膠原酶Ⅳ消化得到的細(xì)胞活率(91%)。

2.2 山羊胰腺腺泡細(xì)胞的純化及傳代培養(yǎng)

在前述優(yōu)化的消化酶濃度和消化時(shí)間基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步開展山羊胰腺腺泡細(xì)胞的純化和傳代培養(yǎng)。在1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化20 min后，用70 μm的細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液，600 r/min多次離心后調(diào)整細(xì)胞懸液為3×105個(gè)細(xì)胞/cm2進(jìn)行接種。接種后在顯微鏡下觀察，圖4-a顯示細(xì)胞形態(tài)不均一，以成團(tuán)成簇生長的細(xì)胞為主，雜細(xì)胞較多。因此我們開展了細(xì)胞純化工作。

a：消化狀態(tài)(100×)；b：總細(xì)胞數(shù)；c：細(xì)胞活率。

a：消化狀態(tài)(100×)；b：總細(xì)胞數(shù)；c：細(xì)胞活率。

pancreatic acinar cells

當(dāng)原代細(xì)胞貼壁達(dá)90%以上后，我們通過差時(shí)消化、差速貼壁及細(xì)胞刮取等方法將原代細(xì)胞純化后在進(jìn)行傳代培養(yǎng)。圖4-b顯示在純化后，各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)明顯更加均一，主要為成簇生長呈“鵝卵石”狀的細(xì)胞。圖4-c顯示傳代培養(yǎng)至第5代依然保持形態(tài)。

a：純化前各時(shí)間點(diǎn)山羊胰腺腺泡細(xì)胞；b：純化后各時(shí)間點(diǎn)山羊胰腺腺泡細(xì)胞；c：純化后第5代山羊胰腺腺泡細(xì)胞。

2.3 山羊胰腺腺泡細(xì)胞鑒定

通過免疫熒光技術(shù)利用抗原抗體反應(yīng)對(duì)山羊胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行鑒定。CPA1是胰腺腺泡細(xì)胞特異性表達(dá)的蛋白，因此我們選取CPA1作為目標(biāo)蛋白。運(yùn)用CPA1抗體作為一抗識(shí)別腺泡細(xì)胞中的CPA1，再用帶熒光的二抗與一抗結(jié)合來顯示CPA1蛋白。當(dāng)目標(biāo)蛋白、一抗和二抗結(jié)合在一起，在激光共聚焦顯微鏡下激發(fā)熒光才能顯色呈陽性。若未顯色則說明目標(biāo)蛋白與抗體沒有發(fā)生反應(yīng)。據(jù)此，首先設(shè)置了不加一抗僅用二抗孵育的對(duì)照組(圖5-a)，結(jié)果沒有激發(fā)綠色熒光，僅顯示經(jīng)染核試劑DAPI顯色的藍(lán)色細(xì)胞核部分，結(jié)果未顯示陽性。當(dāng)運(yùn)用CPA1抗體對(duì)第1代細(xì)胞進(jìn)行孵育，再與二抗結(jié)合時(shí)，細(xì)胞中的CPA1與CPA1抗體成功反應(yīng)，激發(fā)綠色熒光，結(jié)果顯示陽性(圖5-b)。之后又對(duì)第5代細(xì)胞進(jìn)性鑒定，同樣顯示出陽性(圖5-c)。由此成功鑒定出本試驗(yàn)分離并純化培養(yǎng)的細(xì)胞為山羊胰腺腺泡細(xì)胞。

a：空白對(duì)照(100×)；b：第1代細(xì)胞(200×)；c：第5代細(xì)胞(100×)

3 討 論

胰腺在各物種之間，以及各物種不同年齡階段的生長發(fā)育、功能機(jī)理都有著極大地差異。因此現(xiàn)今依舊沒有一個(gè)在各物種上能夠穩(wěn)定分離胰腺腺泡細(xì)胞原代培養(yǎng)的方法。當(dāng)前在已經(jīng)原代培養(yǎng)成功的胰腺腺泡上進(jìn)行的研究也還存在著諸多疑問。例如，不同物種胰腺腺泡細(xì)胞上的膽囊收縮素(CCK)受體類型及分布存在差異，甚至于不具有CCK受體，且隨著生長發(fā)育也有一定變化，然而，反芻動(dòng)物隨生長發(fā)育胰腺腺泡細(xì)胞上CCK受體圖譜未見報(bào)道[8]；胰腺腺泡細(xì)胞的自噬機(jī)制很大程度上影響著胰腺外分泌功能，然而，自噬的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制并未研究透徹[9]；胰腺內(nèi)分泌對(duì)胰腺外分泌影響的全部意義也尚不清楚[10]；腺泡細(xì)胞內(nèi)消化酶原提前激活的調(diào)控機(jī)制尚未得到統(tǒng)一解答[11]；原代培養(yǎng)胰腺腺泡不能穩(wěn)定傳代等存在一系列疑問[7]；原代培養(yǎng)的胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定也鮮有報(bào)道。因此，山羊胰腺腺泡細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的建立有助于對(duì)胰腺外分泌功能及其他生理機(jī)制在細(xì)胞水平上的研究。

在細(xì)胞分離的過程中能否得到數(shù)量足夠且形態(tài)完整活性良好的腺泡細(xì)胞，取決于消化酶的類型的使用。膠原酶和胰蛋白酶在一般消化解離細(xì)胞的工作中較為常見。與胰蛋白酶相比，膠原酶具有溫和的剪切力，膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，能夠更好地將組織塊解離成單個(gè)細(xì)胞[12]。本試驗(yàn)還在消化液中運(yùn)用了EGTA(一種鈣離子螯合劑，能夠破壞細(xì)胞間的連接而不影響細(xì)胞的完整性)，這進(jìn)一步使得分離得到的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞[13]。

自1972年胰腺腺泡細(xì)胞運(yùn)用膠原酶被首次分離成功后，由此在報(bào)道的腺泡細(xì)胞解離工作中膠原酶被更為廣泛的使用[14]。但山羊的胰腺組織在消化解離的過程中可能與其他物種對(duì)消化液的要求有差異，因此膠原酶的消化時(shí)間及濃度需要驗(yàn)證，確定適宜的消化時(shí)間及濃度，以期得到良好的山羊胰腺腺泡細(xì)胞。在人胰腺腺泡細(xì)胞的分離試驗(yàn)中，研究人員運(yùn)用0.8 mg/mL的膠原酶P消化人胰腺組織，但并沒有描述清楚具體的消化時(shí)間[4]。在小鼠和豬的胰腺腺泡細(xì)胞分離工作中，分別運(yùn)用了2 mg/mL膠原酶ⅠA消化30 min和2 mg/mL膠原酶Ⅱ消化40 min得到胰腺腺泡細(xì)胞[5-6]。Jayaveni等[7]運(yùn)用1 mg/mL膠原酶Ⅲ將剪碎的牛胰腺組織消化15 min或更長時(shí)間進(jìn)行牛胰腺腺泡細(xì)胞的分離培養(yǎng)。在上述試驗(yàn)中使用了不同類型的膠原酶，消化時(shí)間也各有差異，并且均沒有介紹消化后的總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率等消化效率指標(biāo)。因此在本試驗(yàn)中各指標(biāo)需要進(jìn)一步驗(yàn)證，運(yùn)用1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ作為消化液濃度，設(shè)置5個(gè)消化時(shí)間節(jié)點(diǎn)尋求適宜消化時(shí)間。由本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，得到的總細(xì)胞數(shù)隨著消化時(shí)間的延長逐漸增多。細(xì)胞活率在15 min時(shí)低于20 min，造成這樣的原因可是是由于在消化前對(duì)胰腺組織進(jìn)行機(jī)械剪切，造成組織塊表面較多的損傷細(xì)胞。而20 min進(jìn)一步消化出更多的未損傷細(xì)胞，所以20 min細(xì)胞活率高于15 min。而隨著消化時(shí)間的延長細(xì)胞活率逐漸降低，這應(yīng)該是消化過度造成的。因此選取總細(xì)胞數(shù)相對(duì)適宜、細(xì)胞活率較高的20 min進(jìn)行后一步的試驗(yàn)，因?yàn)檩^高的細(xì)胞活率可避免接種后的污染風(fēng)險(xiǎn)。此外，在后期的試驗(yàn)中希望在較短的培養(yǎng)時(shí)間能得到足量的第1代貼壁細(xì)胞，因此需尤其注重得到的細(xì)胞具有較高活力，使解離得到的細(xì)胞具有較高的貼壁效率。

在驗(yàn)證適宜消化時(shí)間的過程中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞碎片的存在，因此嘗試將消化液濃度降低，將1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ降低到0.5 mg/mL，在消化20 min的情況下，結(jié)果顯示細(xì)胞碎片確實(shí)少了許多，但單個(gè)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞活率并不理想。在其他胰腺腺泡細(xì)胞的原代培養(yǎng)工作中，研究人員們同樣也運(yùn)用了1.0 mg/mL膠原酶，但膠原酶的類型不同[7]。由于胰腺自身的自噬、分泌消化酶等特異性，存在胰腺組織壞死及細(xì)胞損傷的情況[15]，因此本試驗(yàn)并未嘗試用低濃度的消化酶去延長消化時(shí)間，以得到更多的單個(gè)細(xì)胞。另外，胰腺腺泡細(xì)胞的自我損傷也是細(xì)胞分離難度較高、細(xì)胞生長不穩(wěn)定的主要原因[11]，因此消化酶濃度和消化時(shí)間的把控極為重要。

在各種細(xì)胞培養(yǎng)的工作中，0.25%胰蛋白酶常作為原代細(xì)胞解離的消化液來使用，但在胰腺組織上的運(yùn)用較為少見，Guo等[16]運(yùn)用胰蛋白酶冷消化法解離犢牛胰腺腺泡細(xì)胞，但其消化時(shí)間相對(duì)較長。在與1.0 mg/mL膠原酶Ⅳ對(duì)比的試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，0.25%胰蛋白酶在同等條件下消化效率并不如膠原酶Ⅳ，雖說在顯微鏡下觀察后發(fā)現(xiàn)0.25%胰蛋白酶消化得到的細(xì)胞碎片相對(duì)較少。但細(xì)胞碎片的問題經(jīng)過多次摸索發(fā)現(xiàn)，在600 r/min離心5 min，重復(fù)2次可以有效清除細(xì)胞碎片的存在。

胰腺腺泡細(xì)胞雖然在胰腺組織中占比極高，但是在原代培養(yǎng)的過程中不免會(huì)分離出胰腺中的其他細(xì)胞，因此在培養(yǎng)過程中對(duì)分離的腺泡細(xì)胞進(jìn)行了細(xì)胞純化工作。分離的原代細(xì)胞主要依靠流式細(xì)胞術(shù)、差時(shí)消化、差速貼壁及細(xì)胞刮取等方法進(jìn)行細(xì)胞純化。但由于物種的原因，山羊胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行基因編輯存在極高的難度，另外就是抗體的缺乏，導(dǎo)致在工作中難以運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)來純化分離得到的山羊胰腺腺泡細(xì)胞。因此本試驗(yàn)運(yùn)用了差時(shí)消化、差時(shí)貼壁、細(xì)胞刮取等方法相結(jié)合來對(duì)腺泡細(xì)胞進(jìn)行純化工作。這些手段相結(jié)合在保證成本的前提下，能夠得到較為純的細(xì)胞。雖說這3種方法主要依靠細(xì)胞形態(tài)來判斷純化得到的細(xì)胞，但本試驗(yàn)在之后進(jìn)行了細(xì)胞的鑒定工作。由此也可驗(yàn)證純化細(xì)胞工作的可行性。

鑒于胰腺腺泡細(xì)胞分泌消化酶的特殊性，在之前各物種培養(yǎng)原代腺泡細(xì)胞時(shí)都討論了細(xì)胞存活時(shí)限[4-7]。早先原代培養(yǎng)的胰腺腺泡細(xì)胞存活時(shí)間比較短，隨著消化酶、消化時(shí)間和培養(yǎng)基等影響因素的不斷優(yōu)化，目前胰腺腺泡細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間大概在2周左右。但體外培養(yǎng)細(xì)胞所需的條件肯定是存在缺陷的，因此原代細(xì)胞應(yīng)該總是處于一個(gè)應(yīng)激的狀態(tài)。近來也有報(bào)道，胰腺腺泡細(xì)胞極易化生為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞[17]，如果長時(shí)間培養(yǎng)可能會(huì)導(dǎo)致這樣的情況發(fā)生。因此在本試驗(yàn)中，我們更期望得到與原組織更為接近的細(xì)胞。所以在細(xì)胞量足夠的情況下更希望得到第1及第2代細(xì)胞。為保證細(xì)胞的活性，本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中添加了EGF，同為防止腺泡細(xì)胞自身分泌消化酶的影響，在培養(yǎng)基中添加了10%的特級(jí)FBS。在這些條件的影響下，保證了本試驗(yàn)中胰腺腺泡細(xì)胞在第1代及第2代有了良好的完整性及活性。

在胰腺腺泡細(xì)胞分離成功后，由于考慮到胰腺腺泡細(xì)胞自身分泌胰蛋白酶可能造成其不容易貼壁，因此擔(dān)心分離培養(yǎng)的細(xì)胞是否是預(yù)期得到的胰腺腺泡細(xì)胞。盡管胰腺腺泡細(xì)胞的分離培養(yǎng)已有過一些報(bào)道，但鑒定工作并不多見。鑒于原代培養(yǎng)的山羊胰腺腺泡細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定工作鮮有報(bào)道，另外也為了驗(yàn)證純化工作的可行性，因此展開了山羊胰腺腺泡細(xì)胞的鑒定工作。一開始試驗(yàn)效仿Jayaveni等[7]運(yùn)用α-淀粉酶抗體來進(jìn)行鑒定工作，但經(jīng)過多次試驗(yàn)及調(diào)整并未顯示陽性，分析可能是物種的原因造成的。因此決定選用其他抗體進(jìn)行鑒定。CPA1是一種在胰腺腺泡細(xì)胞中產(chǎn)生的鋅金屬蛋白酶，在飲食蛋白C端支鏈和芳香族氨基酸的裂解過程中發(fā)揮作用，最早于1929年從牛胰腺提取物中鑒定出該酶[18]。在醫(yī)學(xué)上，CPA1被確定為胰腺腺泡細(xì)胞癌的標(biāo)志物，但在運(yùn)用胰腺組織做免疫組化時(shí)，正常胰腺組織中的腺泡細(xì)胞也能被CPA1抗體染色呈陽性，且相較于胰蛋白酶等其他標(biāo)志物具有更高的靈敏度[19-20]。受此啟發(fā)，本試驗(yàn)運(yùn)用CPA1抗體來進(jìn)行山羊胰腺腺泡細(xì)胞的鑒定工作，這也是CPA1抗體首次運(yùn)用于原代培養(yǎng)的胰腺腺泡細(xì)胞鑒定工作中。試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了胰腺腺泡細(xì)胞鑒定的可行性。

4 結(jié) 論

湘東黑山羊胰腺組織經(jīng)1.0 mg/mL的膠原酶Ⅳ消化20 min，得到2.275×106個(gè)/mL總細(xì)胞數(shù)及91%的細(xì)胞活率，相同條件下消化效率優(yōu)于0.5 mg/mL膠原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶。采用差時(shí)消化、差速貼壁和細(xì)胞刮取等方法純化原代細(xì)胞，得到活性良好且形態(tài)均一呈“鵝卵石”狀的山羊胰腺腺泡細(xì)胞。純化后的山羊胰腺腺泡細(xì)胞能夠穩(wěn)定傳5代以上，且形態(tài)不發(fā)生改變。通過兔抗CPA1作為一抗對(duì)第1代及第5代山羊胰腺腺泡細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示陽性。綜上所述，本試驗(yàn)方法能夠在短時(shí)間內(nèi)成功分離并培養(yǎng)山羊胰腺腺泡細(xì)胞。