初發(fā)類風濕關節(jié)炎患者腸道微生物群落的基因組學特征分析

馬曉莉,郝春芳,郭東更,吳麗麗,張明珠,楊亞珊，陳坤婷，張英強，徐天宇，殷 喆，郭江濤

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種結締組織病，屬于免疫性疾病(AID)，其主要病理特征為關節(jié)炎癥、滑膜炎，并且伴有機體內多系統(tǒng)的免疫炎癥反應[1]。研究表明，腸道微生物的功能變化和構成與自身免疫性疾病存在緊密聯(lián)系，可能與RA疾病密切相關，其機理是腸道微生物及其代謝產物通過對機體免疫功能進行調節(jié)，進而影響自身免疫病的發(fā)生發(fā)展[2]。人體內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持離不開宿主免疫系統(tǒng)同微生物群之間的相互作用[3]。本研究借助高通量測序技術探究初發(fā)RA患者和健康人群體內腸道菌群的組成特點與差異，深入分析RA的腸道菌群特征，從而為RA的預防與治療提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選擇2020年8月至2021年10月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院住院的30例初發(fā)類風濕關節(jié)炎患者為RA組(RA組)，男9例，女21例，年齡28～71歲，平均年齡(52±10)歲。隨機選擇同期健康體檢人員30名為健康對照組(HC組)，男10例，女20例；年齡21～65歲，平均年齡(45±15)歲。2組年齡、性別等方面對比差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷、排除標準：(1)與美國風濕病學會和歐洲風濕病防治聯(lián)合會2010年確立的RA診斷標準相符[4]。(2)排除條件：①患有嚴重的心、腎、內分泌、消化、血液系統(tǒng)疾病者；②患有結締組織病(CTD)、干燥綜合征(SS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、強直性脊柱炎(AS)等自身免疫病或影響免疫功能的其他疾病者。③既往接受過抗風濕治療的患者；④曾使用激素治療的患者；⑤近3個月內使用過抗生素的患者；⑥曾接受胃腸動力藥治療的患者；⑦有胃腸炎病史的患者。

1.3 方法

1.3.1 腸道微生物群落的基因組學研究

1.3.1.1 糞便樣本的采集：按標準采集流程使用配套的糞便套裝收集患者清晨中間段新鮮糞便標本約200 mg，常溫保持運輸，3日內進行檢驗。

1.3.1.2 總DNA提取：采用QUBIT RNA HSAssay Kit、QUBIT dsDNA HS Kit試劑盒及QIAsymphony SP 核酸自動提取儀、Qubit 3.0核酸定量儀提取糞便細菌基因組總DNA，嚴格按照說明書進行實驗操作。

1.3.1.3 基因組測序：應用ION TORRENT平臺技術、Ion PGM基因組測序儀對細菌16 S rDNA V2、V3、V4、V6、V7、V8、V9可變區(qū)進行靶向高通量測序并構建文庫。按照樣品準備、擴增16S高變區(qū)及純化、測定文庫濃度、末端修復及純化、連接接頭及純化、擴增文庫及純化、測定文庫濃度順序進行，對篩選所得有效序列開展除雜，獲得優(yōu)化序列。

1.3.1.4 菌群多樣性分析：借助Shannon指數(shù)等完成稀釋曲線，對2組實驗對象的復雜度進行分析，結果顯示所測數(shù)據(jù)量完整，能夠反映樣本所有微生物的多樣性信息。最后對實驗數(shù)據(jù)進行OTU分析、Alpha樣品多樣性分析、LEfSe樣本組間差異性分析。

1.4 統(tǒng)計學方法：采用qiime2(version 2022.2)進行Alpha多樣性分析(Chao1、Goods_coverage、Observed_species、Shannon、Simpson等物種多樣性統(tǒng)計)，并使用biobakery LEFSe對效應量測量(LEfSe)后展開計算。相對豐度箱線圖繪制后使用軟件R(version 4.2.0)進行操作，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2組腸道菌群基因組測序OTU分析:初發(fā)RA組的腸道菌群豐度低于對照組，腸道菌群OUT總量上較對照組偏低，見圖1(封二)。在既定相似度下聚類獲得各樣品OUT數(shù)量，繪制Venn圖，2組合計75個OTU；RA組、HC組特有OTU個數(shù)分別為32個和4個，見圖2(封二)。

2.2 2組腸道菌群基因組測序Alpha分析:菌群多樣性比較顯示，2組多樣性指數(shù)分析中Chao1指數(shù)、Observe_species指數(shù)、Simpson指數(shù)、Goods_coverage指數(shù)方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，2組之間Shannon指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，RA組低于HC組，見表1。

表1 2組Alpha diversity指數(shù)差異性分析

2.3 2組腸道菌群基因組測序LEfSe樣本分析:菌群結構和菌群差異分析得出，2組在門、科、屬水平上差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，初發(fā)RA患者組放線菌門(Actinobacteria)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、厚壁菌科(Clostridiales Family XIII Incertae Sedis)相對豐度與健康對照組相比較明顯增加(P<0.05)。初發(fā)RA患者組木假單胞菌屬(Paraprevotella)、Tyzzerella屬、類桿菌屬(Coprobacter)相對豐度與健康對照組相比則明顯減少(P<0.05),見圖3-圖4(封二)。

3 討論

腸道所含微生物種類超過了1000種，對300萬以上的細菌基因(微生物組)進行編碼，其數(shù)量為人類基因數(shù)量的150倍[5]。目前包括高通量測序在內的各項基因測序技術的提高使得研究者對人體微生物的構成和作用能夠進行更深入的分析。研究者不再局限于對腸道菌群能夠調節(jié)機體營養(yǎng)代謝、抵抗病原體、維持腸道黏膜屏障完整等作用的研究，而更加重視其在維持宿主免疫應答反應。腸道菌群發(fā)生紊亂會致病菌的數(shù)量異常提高，可導致腸道黏膜屏障的完整性受損、炎性細胞聚集、分泌趨化因子等多種促炎因子，幫助T細胞遷移并激活外周B細胞，使其分化為成熟的漿細胞產生大量自身抗體作用于關節(jié)滑膜，最終導致了免疫相關性關節(jié)炎的發(fā)生[6]。

類風濕關節(jié)炎是較為多見的自身免疫病之一，其主要機制與環(huán)境因素、免疫系統(tǒng)、遺傳因素之間相互作用相關。有研究表明，腸道菌群失調與多種自身免疫性疾病與代謝性疾病存在聯(lián)系，如干燥綜合征(SS)[7]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、強直性脊柱炎(AS)、糖尿病(DM)、動脈硬化性腦梗死[8]等。16SrDNA可揭示生物物種的特征核酸序列，成為分析細菌的系統(tǒng)發(fā)育及分類鑒定的最佳指標。本次試驗的樣本測序深度具合理性，豐度分布曲線表明各樣本的菌群豐富度及均勻度皆較好，經由coverage 指數(shù)可知，此項試驗中的樣本菌群對于多數(shù)菌種具備良好覆蓋率。經測序發(fā)現(xiàn)，RA病人腸道菌群多樣性、豐富度均低于健康人群，這與國內外多項研究結果一致。提示RA病人體內存在腸道菌群紊亂。有研究證明，腸道菌群多樣性降低，腸道內環(huán)境之間平衡被破壞，會導致黏膜免疫功能異常，可成為多種自身免疫性疾病的重要誘因[2]。

人體腸道微生物的構成為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門與擬桿菌門4大類。其中擬桿菌門及厚壁菌門相對豐度達90%以上，變形菌以及放線菌等其他菌相對豐度則在10%以下，此類腸道菌群結構對于腸道穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮著重要作用。腸道菌群失調會導致免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生[9]。此項實驗借助軟件LEfSe開展線性判斷分析(LDA)得出：①門上對比結果顯示：RA組糞便中放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度明顯增加，與譚迪等學者的研究結果一致。已有研究報道稱放線菌門(Actinobacteria)在 RA、多發(fā)性硬化癥(MS)、潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩病(CD)等自身免疫病患者中數(shù)量明顯增多[10]，說明此類細菌可能在自身免疫炎癥過程中發(fā)揮了重要作用，甚至直接參與其中。②科上比較得出，RA患者厚壁菌科相對豐度顯著升高,同有關研究結果一致。厚壁菌門的梭菌屬于一種革蘭氏陽性厭氧菌，對人體營養(yǎng)物質代謝發(fā)揮著關鍵性作用。梭菌可經由發(fā)酵飲食所含的可溶性纖維產生短鏈脂肪酸(SCFA)以促進維生素的合成。動物模型試驗結果顯示，口服SCFAs可以提高Treg細胞含量，使得淋巴細胞介導的自身免疫疾病病情得到改善[11]。另有報道結果顯示，口服SCFAs對于Treg、Th1以及Th17這3類細胞的發(fā)育有促進作用，使得子宮炎與腎臟炎癥變得更加嚴重[12]。也有試驗結果顯示，喂食SCFAs的小鼠，可經由加強K/Bx N血清轉移誘導AIA，導致K/Bx N小鼠患多發(fā)性關節(jié)炎，表現(xiàn)為類似于RA的軟骨、骨的破壞。轉移K/Bx N小鼠血清能夠在大多數(shù)小鼠品系中誘導關節(jié)炎[13]?？粕媳容^得出，RA患者雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)相對豐度顯著升高。Bifidobacteriaceae可單獨誘導Th17細胞，并且在小鼠模型中促進自身免疫性關節(jié)炎，而動物雙歧桿菌和長雙歧桿菌則可誘導IFN-γ和TNF-α，促進炎癥反應[14]。③屬上比較得出RA組類桿菌屬(Coprobacter)、木假單胞菌屬(Paraprevotella)，Tyzzerella屬相對豐度低于健康對照組。有實驗結果顯示，從共生型脆弱擬桿菌中引入細菌多糖對這些自身免疫性疾病的發(fā)展具有抑制作用[15]。

總之，初發(fā)RA病人腸道菌群豐度較健康者明顯偏低，一些菌群有著明顯區(qū)別，本研究中的部分結果與既往研究不相符，考慮可能是因為腸道菌群易受病情、年齡、飲食、地理位置等多種因素影響[13]。腸道菌群變化和RA的病理機制存在確切聯(lián)系，但尚未探明其確切機制，需要通過更為深入的研究來明確。對腸道菌群紊亂進行靶向治療，可能為探索RA的治療方案帶來新的研究方向。早期改善腸道菌群失調，恢復腸道菌群穩(wěn)態(tài)有望降低RA的發(fā)病并減輕病情活動程度、延緩疾病進展，成為傳統(tǒng)治療方法的補充。