野生羊肚菌資源收集與菌株篩選技術(shù)研究*

郝 哲，張彥飛，高升成，梁海燕，李惠霞，李 紅，思瑞琳

（1.榆林市農(nóng)墾服務(wù)中心，陜西 榆林 719000；2.榆林市馬合農(nóng)場(chǎng)，陜西 榆林 719000；3.榆林市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，陜西 榆林 719000；4.榆林學(xué)院，陜西 榆林 719000）

羊肚菌位居世界四大野生名菌之首，是目前價(jià)格最為昂貴的野生食用菌之一，兼具食用和重要的藥用價(jià)值[1]。羊肚菌（Morchellaspp.）屬子囊菌亞門（Ascomycota）盤菌綱（Discomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌屬（Morchella），其因菌蓋呈羊肚狀而得名，俗稱羊肚子、包谷菌、陽雀菌、羊肚菌蛾子、麻子菌或蜂窩蛾子[2-3]。羊肚菌富含蛋白質(zhì)、核酸、多糖、多種微量元素以及維生素等，其蛋白質(zhì)含量與牛奶、蛋類相當(dāng)；內(nèi)含的19種氨基酸包括8種人體必需氨基酸和α-氨基異丁酸、L-3-氨基L-脯氨酸、2，4-二氨異丁酸等幾種稀有氨基酸；具有抗疲勞、增強(qiáng)免疫功能、抗衰老、降血脂、誘變、抗腫瘤、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等功效，引起了眾多國(guó)內(nèi)外科研工作者的研究興趣[4-8]。

鑒于羊肚菌兼具食用價(jià)值和重要的藥用價(jià)值[1]，具有極好的經(jīng)濟(jì)效益，因此對(duì)不同地方的野生羊肚菌資源進(jìn)行收集鑒定、菌種分離純化、培養(yǎng)基篩選、大田試種與推廣試驗(yàn)研究，以期明確羊肚菌栽培資源類型，篩選最佳的純化分離方法及合適的培養(yǎng)基，探索適合當(dāng)?shù)丶捌渌糠质∈型茝V的優(yōu)質(zhì)菌株。通過典型示范與全面推廣栽培，為羊肚菌人工栽培提供經(jīng)驗(yàn)與方法，為地區(qū)鄉(xiāng)村振興引入發(fā)展?jié)摿^大的產(chǎn)業(yè)。

1 材料與方法

1.1 菌株收集與鑒定試驗(yàn)

通過查閱資料及多方咨詢，確定全國(guó)羊肚菌采集地點(diǎn)。多年來累計(jì)從陜北地區(qū)、四川省、云南省、東北地區(qū)等地采集到野生羊肚菌菌株共26株，并進(jìn)行了形態(tài)特征描述和種類的鑒定。

將采集的野生羊肚菌菌株制作為斜面菌種，送至中國(guó)科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行測(cè)序。所得序列在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列比較與BLASTN搜索，用Clustal X 1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，用Mega 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 羊肚菌菌種分離試驗(yàn)

1.2.1 組織分離試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)K0、K1、K2共3個(gè)處理，分離部位分別為菌蓋和菌柄連接處、菌柄及菌蓋，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)。

將野生羊肚菌放入超凈工作臺(tái)，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，再用紫外線消毒30 min。從菌蓋和菌柄連接處、菌柄及菌蓋3個(gè)部位分別切取一小塊組織，接種于PDA試管培養(yǎng)基中并做好標(biāo)記，于20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。定期觀察并記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間、長(zhǎng)勢(shì)、成活率、污染率等情況，并對(duì)分離成功的菌絲體進(jìn)行交配型基因檢測(cè)。

1.2.2 孢子分離試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)L0、L1共2個(gè)處理，分別為單孢分離接種和多孢分離接種，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)。

采集成熟的野生羊肚菌，收集子囊孢子，在超凈工作臺(tái)按照無菌操作規(guī)程，以單孢分離和多孢分離2種方式，分別接種于PDA試管培養(yǎng)基中并做好標(biāo)記，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。定期觀察并記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間、長(zhǎng)勢(shì)、成活率、污染率等情況，并對(duì)分離成功的菌絲體進(jìn)行交配型基因檢測(cè)。

1.3 母種培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)

1.3.1 供試菌株與培養(yǎng)基配方

使用編號(hào)為NK-02的野生羊肚菌菌株，采集于四川綿陽。

母種培養(yǎng)基設(shè)計(jì)M1~M5共5個(gè)不同配方。

M1：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、馬鈴薯200 g（去皮煮汁），水1 000 mL

M2：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、馬鈴薯200 g（去皮煮汁）、麥麩50 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀1.0 g，水1 000 mL。

M3：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、馬鈴薯200 g（去皮煮汁）、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀1 g，水1 000 mL。

M4：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、黃豆芽500 g（煮汁）、硫酸鎂1 g、磷酸二氫鉀1 g，水1 000 mL。

M5：葡萄糖20 g、瓊脂20 g、豆餅200 g（煮汁）、玉米粉10 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀1 g，水1 000 mL。

1.3.2 試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，共設(shè)5個(gè)處理（N0、N1、N2、N3、N4，其中N0為對(duì)照），配方分別為M1、M2、M3、M4、M5；每個(gè)處理設(shè)10個(gè)重復(fù)。將分離純化的羊肚菌，在無菌條件下接種于母種試管培養(yǎng)基中，做好標(biāo)記后放入20℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。定期觀察菌絲生長(zhǎng)狀況，記錄菌絲密度、顏色、長(zhǎng)勢(shì)、整齊度及長(zhǎng)滿試管的時(shí)間。菌絲長(zhǎng)滿試管后在顯微鏡下觀察其形態(tài)和顏色并記錄。

1.4 羊肚菌優(yōu)良菌株選育試驗(yàn)

分別對(duì)羊肚菌母種進(jìn)行初選和復(fù)選，觀察測(cè)定菌絲萌發(fā)和菌霜形成時(shí)間、子實(shí)體形態(tài)特征、出菇時(shí)間和產(chǎn)量，并進(jìn)行詳細(xì)記錄，篩選出其中產(chǎn)量高、品質(zhì)好的優(yōu)良菌株。

1.4.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及條件

初選、復(fù)選及生產(chǎn)示范試驗(yàn)地均位于榆林市馬合鎮(zhèn)（109°25′E，38°30′N），陜北地區(qū)毛烏素沙漠南緣。該地地勢(shì)平坦；氣候?qū)贉貛Т箨懶园敫珊导撅L(fēng)氣候，四季分明；近5年年平均氣溫為8.8℃，極端低溫平均為-19℃，極端高溫平均為35℃；年平均無霜期為152 d；多年平均降雨量為453 mm，降雨少而不均，大部分降雨集中在6月~9月；土壤為沙質(zhì)土，通氣性好，保肥保水性相對(duì)較差[9]。

初選、復(fù)選及生產(chǎn)示范試驗(yàn)在鋼架棉被拱棚內(nèi)進(jìn)行。10月上旬進(jìn)行羊肚菌栽培，次年5月上旬采集。1.4.2 初選試驗(yàn)

2016年~2017年，將經(jīng)分離得到的26個(gè)羊肚菌母種制備成原種和栽培種，在榆林市馬合農(nóng)場(chǎng)南沙分場(chǎng)食用菌菌種篩選基地進(jìn)行栽培出菇試驗(yàn)。每個(gè)菌株為1個(gè)處理，每個(gè)處理小區(qū)面積為222 m2，各3次重復(fù)。

1.4.3 復(fù)選試驗(yàn)

2017年~2018年，將初選得到的菌株于同一個(gè)試驗(yàn)基地進(jìn)行復(fù)選。每個(gè)菌株為1個(gè)處理，每處理小區(qū)面積為667 m2，各3次重復(fù)。

1.5 生產(chǎn)示范

2018年~2019年，將復(fù)選得到的菌株在榆林市馬合農(nóng)場(chǎng)新墩分場(chǎng)食用菌園區(qū)進(jìn)行大面積生產(chǎn)示范。每個(gè)菌株的栽培面積為20.001 hm2。

1.6 示范推廣

2019年~2020年，經(jīng)生產(chǎn)示范驗(yàn)證的優(yōu)良菌株在榆林市馬合農(nóng)場(chǎng)食用菌園區(qū)、山西省呂梁市、云南省香格里拉市、內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市進(jìn)行大面積栽培示范與推廣。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定分析

真菌核糖體基因及間隔區(qū)進(jìn)化程度不同，有的序列比較保守，有的序列進(jìn)化較快，因此可以根據(jù)保守序列對(duì)真菌進(jìn)行鑒定。將收集到的26個(gè)野生羊肚菌菌株送至中國(guó)科學(xué)院微生物研究所進(jìn)行菌種鑒定，以編號(hào)為NK-23的野生羊肚菌菌株為例進(jìn)行分析。對(duì)菌株NK-23的測(cè)序序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)區(qū)域序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on sequence analysis of internal transcribed spacer regions

由圖1可知，菌株NK-23與Morchella importunastrain SCYDJ1-A1（GenBank登錄號(hào)：OL898492.1）的序列同源性為99%。分析表明，菌株NK-23與Morchella importuna以99%支持率聚為一群，即菌株NK-23為梯棱羊肚菌（Morchella importunaM.Kuo,O’Donnell&T.J.Volk）。

其他25個(gè)菌株與菌株NK-23的分析鑒定方法相同，匯總所有菌株鑒定結(jié)果及相關(guān)信息，詳見表1。

由表1可知，各地采集到的野生羊肚菌種類和數(shù)量不盡相同。

表1 羊肚菌菌株信息匯總Tab.1 Information summary of Morchella spp.strairs

采集自四川綿陽的菌株包括Mel-21、七妹羊肚菌（Morchella septimelata）、Mel-13、六妹羊肚菌(Morchella sextelata）、梯棱羊肚菌，其中以七妹羊肚菌為主，共2株。

采集自云南老君山的菌株包括六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、Mel-13，以七妹羊肚菌和Mel-13居多，各2株；采集自云南維西的菌株包括六妹羊肚菌、梯棱羊肚菌、Mel-21；采集自云南劍川的菌株包括梯棱羊肚菌3株、Mel-21羊肚菌1株。綜合分析自云南省采集到的12株羊肚菌，梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、Mel-13和Mel-21的菌株數(shù)分別占菌株總數(shù)的1/3、1/4、1/6和1/6，七妹羊肚菌僅有1株。采集自吉林長(zhǎng)白山的菌株包括梯棱羊肚菌2株、六妹羊肚菌1株、七妹羊肚菌1株。

甘肅諾爾蓋有梯棱羊肚菌1株。榆林岔河則、小紀(jì)汗、黨岔采集到的菌株均為海綿羊肚菌（Morchella spongiola）。不同地方的26個(gè)羊肚菌菌株共有梯棱羊肚菌8株、六妹羊肚菌5株、七妹羊肚菌4株、Mel-21羊肚菌3株、Mel-13羊肚菌3株、海綿羊肚菌3株。除了NK-24、NK-25、NK-26菌株呈現(xiàn)菌蓋黃色、邊緣不規(guī)則、頂部近半球形的形態(tài)特征外，其他菌株均呈現(xiàn)菌蓋黑褐色、邊緣不規(guī)則、頂部近圓錐形的形態(tài)特征。

2.2 羊肚菌菌種分離結(jié)果分析

以羊肚菌不同部位進(jìn)行組織分離，其菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染率、菌核、基因類型情況見表2。

表2 以羊肚菌不同部位進(jìn)行組織分離的試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.2 Data of different tissue isolation sites of Morchella spp.

由表2可知，以羊肚菌不同部位進(jìn)行組織分離，菌絲萌發(fā)的時(shí)間相同。以菌柄分離的菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染率與以菌蓋和菌柄連接處分離的相同，該分離方式污染率低，但菌核分散、菌絲長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較弱，交配型基因?yàn)镸AT1-1-1或MAT1-2-1。以菌蓋分離的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最佳，菌核密集，同時(shí)存在MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因，但污染率高達(dá)65%。綜合而言，以菌蓋分離效果最佳，雖然其分離污染率較高，但形成的菌核密集，且同時(shí)存在MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因，以菌蓋進(jìn)行組織分離是羊肚菌菌種分離的有效方法。

羊肚菌不同孢子分離方式下菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染率、純化成功菌株數(shù)、菌核、基因類型情況見表3。

表3 羊肚菌不同孢子分離方法的試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.3 Data of different spore isolation methods of Morchella spp.

由表3可知，孢子分離方式對(duì)菌絲萌發(fā)、菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌核無影響；但在污染率及純化成功菌株數(shù)方面，多孢分離方式污染率低，更易成功，且同時(shí)存在MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。

2.3 母種培養(yǎng)基篩選結(jié)果分析

5種母種培養(yǎng)基篩選結(jié)果見表4。

表4 不同母種培養(yǎng)栽培羊肚菌基的試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.4 Data of different stock culture media for Morchella spp.cultivation

由表4可知，5種處理的培養(yǎng)基對(duì)菌絲長(zhǎng)滿時(shí)間、菌絲顏色和菌絲整齊度無影響。N2~N4處理的培養(yǎng)基對(duì)菌絲密度和菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響與N0相同，N1處理培養(yǎng)基菌絲健壯濃密、長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、整齊，是生產(chǎn)羊肚菌母種的最佳培養(yǎng)基。

2.4 羊肚菌優(yōu)良菌株選育結(jié)果分析

2.4.1 羊肚菌菌株初選試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)26個(gè)羊肚菌菌株進(jìn)行初選，結(jié)果見表5。

由表5可知，不同菌株的菌絲萌發(fā)時(shí)間不同，其中菌株NK-18的菌絲萌發(fā)時(shí)間最短，為1.5 d；另有7株菌絲萌發(fā)時(shí)間為2 d；菌株NK-08的菌絲萌發(fā)時(shí)間最長(zhǎng)，為6 d；其余菌株的菌絲萌發(fā)時(shí)間以4 d、3 d居多，分別有9株和5株。菌霜出現(xiàn)時(shí)間最短為6 d，最長(zhǎng)為16 d，分別有2株和1株；其余菌株的菌霜出現(xiàn)時(shí)間以8 d和7 d為主，分別為9株和6株。26個(gè)不同菌株的頂部主要有廣圓錐形和圓錐形，偶爾出現(xiàn)卵圓形，其中以“圓錐形，偶爾卵圓形”和“廣圓錐形或圓錐形”2類為主。對(duì)產(chǎn)量進(jìn)行分析，菌株NK-02最優(yōu)，為210 kg·667-1m-2；除了未出菇的菌株NK-24、NK-25和NK-26以外，菌株NK-16產(chǎn)量最低，僅為16 kg·667-1m-2。產(chǎn)量低于150 kg·667-1m-2的菌株多數(shù)出現(xiàn)了病原菌污染、病蟲害嚴(yán)重或子實(shí)體稀疏等問題；產(chǎn)量高于150 kg·667-1m-2的菌株子實(shí)體相對(duì)密集，無嚴(yán)重病原菌污染或嚴(yán)重病蟲害問題發(fā)生。以產(chǎn)量作為主要因素，綜合菌絲萌發(fā)、菌霜出現(xiàn)時(shí)間、菇形特征，初選出菌株NK-02、NK-03、NK-05、NK-08、NK-09、NK-10、NK-15、NK-17、NK-18、NK-20、NK-21和NK-23進(jìn)行復(fù)選。

表5 羊肚菌菌株初選試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.5 Preliminary selection data of Morchella spp.strains

2.4.2 羊肚菌菌株復(fù)選試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)初選得到的12個(gè)羊肚菌菌株進(jìn)行復(fù)選，結(jié)果見表6。

表6 羊肚菌菌株復(fù)選試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.6 Re-selection data of Morchella spp.strains

由表6可知，在擴(kuò)大規(guī)模的復(fù)選試驗(yàn)中，部分初選結(jié)果表現(xiàn)優(yōu)良的菌株出現(xiàn)了產(chǎn)量降低、菇體畸形或病蟲害嚴(yán)重等問題；其中菌株NK-10產(chǎn)量降低最為嚴(yán)重，每667平方米產(chǎn)量?jī)H有67 kg。對(duì)比復(fù)選結(jié)果，選擇菌株NK-02、NK-03、NK-09、NK-17、NK-20和NK-23開展進(jìn)一步生產(chǎn)示范試驗(yàn)。復(fù)選得到的6個(gè)菌株每667平方米的產(chǎn)量均大于150 kg，且栽培期間無病蟲害，菇形、菌柄長(zhǎng)短及出菇周期正常。

2.4.3 羊肚菌生產(chǎn)示范試驗(yàn)結(jié)果

將復(fù)選得到的6個(gè)羊肚菌菌株進(jìn)行大面積生產(chǎn)示范試驗(yàn)，結(jié)果見表7。

表7 羊肚菌生產(chǎn)示范試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.7 Data of production demonstration of Morchella spp.

由表7可知，6個(gè)復(fù)選試驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)良的菌株在大面積示范過程中沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的病蟲害或菇體畸形的問題；各菌株菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌霜出現(xiàn)時(shí)間、菇形相對(duì)穩(wěn)定；產(chǎn)量與復(fù)選產(chǎn)量相近或明顯增產(chǎn)，其中菌株NK-02、NK-09分別增產(chǎn)28.8%、24.2%。

2.4.4 羊肚菌生產(chǎn)示范推廣試驗(yàn)結(jié)果

6個(gè)在生產(chǎn)示范中性狀穩(wěn)定的羊肚菌菌株在不同地方進(jìn)行大面積推廣栽培試驗(yàn)，結(jié)果見表8。

表8 羊肚菌生產(chǎn)示范推廣試驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.8 Data of demonstration extension ofMorchella spp.production in places

由表8可知，將6個(gè)優(yōu)選羊肚菌菌株在陜西省榆林市、山西省呂梁市、云南省香格里拉市、內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市多個(gè)地區(qū)進(jìn)行栽培，采收的子實(shí)體菇形好，菌蓋均呈圓錐形，菌柄均較短。平均產(chǎn)量最高的菌株為NK-02，在榆林市栽培時(shí)其平均產(chǎn)量最高達(dá)292 kg·667-1m-2。呂梁市栽培的菌株NK-20和香格里拉市栽培的菌株NK-09的平均產(chǎn)量最低，均為189 kg·667-1m-2，但高于6個(gè)菌株在生產(chǎn)示范試驗(yàn)（186 kg·667-1m-2）和復(fù)選試驗(yàn)（165 kg·667-1m-2）中的最低產(chǎn)量。同一羊肚菌菌株在不同地區(qū)進(jìn)行栽培，其產(chǎn)量也有所不同。以在榆林市栽培可達(dá)最高產(chǎn)量的菌株NK-02為例，在呂梁市栽培其產(chǎn)量為231 kg·667-1m-2，而在香格里拉市、呼和浩特市的產(chǎn)量則居于兩者之間。在同一地區(qū)栽培不同的羊肚菌菌株，其產(chǎn)量也有所不同。以榆林市為例，產(chǎn)量最高的菌株為NK-02，產(chǎn)量最低的菌株為NK-03，其余4個(gè)菌株平均產(chǎn)量為224 kg·667-1m-2。綜合分析可知，菌株NK-02在榆林市栽培的產(chǎn)量高出該菌株在全國(guó)栽培的最低產(chǎn)量（231 kg·667-1m-2）約26%，高出該菌株在全國(guó)不同地方產(chǎn)量的平均值（259 kg·667-1m-2）約13%，高出6個(gè)菌株在全國(guó)的產(chǎn)量平均值（230 kg·667-1m-2）約27%，高出6個(gè)菌株中產(chǎn)量最低的菌株NK-20、NK-09產(chǎn)量（189 kg·667-1m-2）約54%。2.4.5 優(yōu)選羊肚菌菌株產(chǎn)量綜合分析

對(duì)6個(gè)優(yōu)選羊肚菌菌株在復(fù)選試驗(yàn)、生產(chǎn)示范、生產(chǎn)示范推廣中的產(chǎn)量進(jìn)行綜合分析，結(jié)果見表9。

表9 羊肚菌菌株在復(fù)選、生產(chǎn)示范與示范推廣試驗(yàn)中的產(chǎn)量比較Tab.9 Comparision of Morchella spp.yield in the test of reselection,production demonstration and demonstration extension

由表9可知，6個(gè)菌株在示范推廣試驗(yàn)中的產(chǎn)量較復(fù)選試驗(yàn)時(shí)的產(chǎn)量均有增加，平均增加21.6%；增加最多為菌株NK-03（32.6%），最少為菌株NK-20（9.1%）。6個(gè)菌株在示范推廣中的平均產(chǎn)量較生產(chǎn)示范試驗(yàn)中的平均產(chǎn)量平均增加11.7%；最多為菌株NK-03，增加33.3%，而菌株NK-02較生產(chǎn)示范產(chǎn)量呈現(xiàn)持平狀態(tài)。

3 討論

3.1 菌株收集與鑒定

采集的26個(gè)羊肚菌菌株中，除菌株NK-24、NK-25、NK-26呈現(xiàn)菌蓋黃色、邊緣不規(guī)則、頂部近半球形的形態(tài)特征外，其他菌株均呈現(xiàn)菌蓋黑褐色、邊緣不規(guī)則、頂部近圓錐形的形態(tài)特征，表明不同地方羊肚菌菌蓋顏色及形態(tài)較為相似。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)，各地野生羊肚菌主要以梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌為主，表明這3個(gè)羊肚菌品種具有較好的適應(yīng)性，可為其人工馴化栽培提供依據(jù)。董彩虹[10]和Liu[11]的研究也發(fā)現(xiàn)，全國(guó)大部分省份主要栽培品種為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌及少量七妹羊肚菌，與此次調(diào)查的野生羊肚菌主要品種的結(jié)果一致。羊肚菌的人工馴化必須依據(jù)野生菌株的適應(yīng)性，通過此次種質(zhì)資源的收集和鑒定，為全國(guó)各地羊肚菌的進(jìn)一步研究與栽培提供了相對(duì)可靠的理論依據(jù)。

3.2 羊肚菌菌種分離與純化

羊肚菌菌絲可通過組織分離或孢子分離的方式獲得。比較從菌蓋和菌柄連接處、菌柄、菌蓋3個(gè)部位進(jìn)行組織分離的結(jié)果，以菌蓋分離獲得的菌絲最佳，表現(xiàn)為菌核密集，菌絲長(zhǎng)勢(shì)較好。這與石建森[12]的研究中，菌絲長(zhǎng)勢(shì)、密度、均勻度均表現(xiàn)為菌蓋和菌柄結(jié)合部位最好，菌柄次之，菌蓋部位最差的結(jié)論有所不同，可能的原因是其所研究的對(duì)象為野生尖頂羊肚菌（Morchella conica），菌絲生長(zhǎng)情況與品種有關(guān)。

大型真菌子實(shí)體的形成與發(fā)育，除了受溫度、濕度、光照和空氣等環(huán)境條件以及相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)條件影響外，還受其特有的遺傳因子控制；交配型基因（MAT）是調(diào)控真菌有性發(fā)育的關(guān)鍵因素[13]；缺失交配型基因易對(duì)菌絲及子實(shí)體生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌蓋和菌柄連接處以及菌蓋部分同時(shí)含有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因，而菌柄中僅含有其中一種基因。不同的交配型基因及分離部位交互作用，可能導(dǎo)致菌絲及子實(shí)體生長(zhǎng)羊肚菌表現(xiàn)出不同的菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染率、菌核密集程度等特征。

黎智文[15]開展了羊肚菌子實(shí)體干品組織分離與多孢分離的對(duì)比研究，得出孢子萌發(fā)率較組織萌發(fā)率高的結(jié)論，但未開展單孢分離和多孢分離的對(duì)比研究。此次研究中，單孢分離和多孢分離的試驗(yàn)結(jié)果表明，多孢分離方式所獲得的菌株污染率低，且同時(shí)存在MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因，利于后續(xù)研究的開展。

綜合而言，羊肚菌組織分離的部位及孢子分離方式的不同均會(huì)對(duì)菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染率、菌核密集程度及基因類型產(chǎn)生一定影響。經(jīng)對(duì)比，孢子分離方式較組織分離方式在菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染率、純化成功菌株數(shù)、菌核狀態(tài)方面有明顯的優(yōu)勢(shì)，特別是多孢分離。因此，多孢分離方式是羊肚菌菌種分離的最佳方法。

3.3 母種培養(yǎng)基篩選

劉奇正[16]研究發(fā)現(xiàn)外源營(yíng)養(yǎng)模塊ENM(exogenous nutrition module）的碳氮比對(duì)主培養(yǎng)基中羊肚菌利用外源營(yíng)養(yǎng)有較為顯著的影響。趙航軻[17]研究了碳源和氮源類型對(duì)羊肚菌母種培養(yǎng)基的影響，發(fā)現(xiàn)存在最佳的碳源和氮源，分別為可溶性淀粉和蛋白胨。結(jié)果表明，不同母種培養(yǎng)基對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)及形態(tài)特征有一定的影響，但不明顯，原因可能為各種培養(yǎng)基均能為菌絲生長(zhǎng)提供合適的、足量的營(yíng)養(yǎng)，碳氮比相對(duì)合適，碳源、氮源類型相差較小。王靜之[18]研究了不同碳源對(duì)羊肚菌母種菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示含有淀粉的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)速度最快。此次試驗(yàn)中，M2培養(yǎng)基為唯一含有麥麩的培養(yǎng)基，而麥麩富含淀粉，因此M2培養(yǎng)基中菌絲長(zhǎng)勢(shì)佳可能與麥麩中含碳量高從而調(diào)配了培養(yǎng)基的碳氮比有關(guān)。

3.4 羊肚菌優(yōu)良菌株選育

對(duì)來自全國(guó)不同地方的26株羊肚菌進(jìn)行了初選、復(fù)選、生產(chǎn)示范、示范推廣研究。在初選試驗(yàn)中，不同菌株表現(xiàn)出不同的菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌霜出現(xiàn)時(shí)間、菇形特征、產(chǎn)量，其中有12個(gè)菌株（NK-02、NK-03、NK-05、NK-08、NK-09、NK-10、NK-15、NK-17、NK-18、NK-20、NK-21、NK-23）綜合表現(xiàn)優(yōu)良，產(chǎn)量均高于150 kg·667-1m-2。不同菌株的產(chǎn)量等性狀的差異可能除了與其內(nèi)在基因型有關(guān)外，也可能與陜北特定的風(fēng)沙環(huán)境條件有關(guān)。

對(duì)初選所得的12個(gè)羊肚菌菌株開展復(fù)選試驗(yàn)的結(jié)果表明，部分初選結(jié)果表現(xiàn)優(yōu)良的菌株出現(xiàn)了產(chǎn)量降低、菇體畸形或病蟲害嚴(yán)重等問題，可能在于復(fù)選擴(kuò)大栽培面積容易引發(fā)病蟲害或相關(guān)條件限制導(dǎo)致部分菌株性狀下降。復(fù)選得到了6個(gè)優(yōu)良菌株（NK-02、NK-03、NK-09、NK-17、NK-20和NK-23），其出菇穩(wěn)定，子實(shí)體形態(tài)特征穩(wěn)定，畸形菇少，病害輕，產(chǎn)量高；原因可能是其抗病蟲害能力較強(qiáng)、適應(yīng)能力好。

生產(chǎn)示范試驗(yàn)中，6個(gè)復(fù)選得到的菌株均未出現(xiàn)菇體畸形或嚴(yán)重病蟲害的問題，各菌株菌絲萌發(fā)時(shí)間、菌霜出現(xiàn)時(shí)間、菇形特征相對(duì)穩(wěn)定，產(chǎn)量與復(fù)選產(chǎn)量持平，甚至出現(xiàn)明顯的增產(chǎn)現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證了復(fù)選結(jié)果的分析。部分菌株較復(fù)選結(jié)果增產(chǎn)的原因可能為新的試驗(yàn)地具有更合適的營(yíng)養(yǎng)條件與環(huán)境條件。

在榆林市馬合農(nóng)場(chǎng)食用菌園區(qū)及山西省、云南省、內(nèi)蒙古自治區(qū)等地對(duì)6個(gè)生產(chǎn)示范中表現(xiàn)優(yōu)良的菌株進(jìn)行大面積推廣的研究表明，菌株NK-02、NK-03、NK-09、NK-17、NK-20和NK-23性狀穩(wěn)定、抗病性強(qiáng)、有較強(qiáng)的適生性、平均產(chǎn)量高，均超過200 kg·667-1m-2；其中在榆林地區(qū)栽培的菌株NK-2平均產(chǎn)量最高，達(dá)到了292.5 kg·667-1m-2，是適合該地區(qū)栽培的最優(yōu)品種。

4 結(jié)論

綜合菌種收集與鑒定、羊肚菌菌種分離與純化、母種培養(yǎng)基篩選及羊肚菌優(yōu)良菌株選育的結(jié)果可知，全國(guó)野生羊肚菌品種主要以梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌為主，其具有較好的適應(yīng)性和馴化價(jià)值。不同部位的組織分離和不同的孢子分離對(duì)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量影響不同，最優(yōu)的分離方式為多孢子分離。

5種母種培養(yǎng)基對(duì)菌絲密度、長(zhǎng)勢(shì)、整齊度及顏色有影響，但不明顯，其中以M2培養(yǎng)基所得菌絲最為濃密，為合適的母種培養(yǎng)基。不同類型的26個(gè)菌株具有不同的生物性狀，其中初選產(chǎn)量大于150 kg·667-1m-2且表現(xiàn)優(yōu)良的菌株為NK-02、NK-03、NK-05、NK-08、NK-09、NK-10、NK-15、NK-17、NK-18、NK-20、NK-21和NK-23。在復(fù)選研究中，部分菌株出現(xiàn)了產(chǎn)量降低、菇體畸形或病蟲害嚴(yán)重的問題，最終菌株NK-02、NK-03、NK-09、NK-17、NK-20和NK-23因具有出菇穩(wěn)定、形態(tài)特征穩(wěn)定、畸形菇少、病害輕、產(chǎn)量高的特征，成為了生產(chǎn)示范的研究對(duì)象。

生產(chǎn)示范研究中，上述6個(gè)菌株均表現(xiàn)出性能穩(wěn)定，抗性較強(qiáng)、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，甚至部分菌株出現(xiàn)了增產(chǎn)。在全國(guó)不同地方大面積推廣栽培表明，6個(gè)菌株性能穩(wěn)定、產(chǎn)量高、抗性強(qiáng)、適應(yīng)能力好，在示范的區(qū)域內(nèi)均適合進(jìn)一步的推廣栽培。同一菌株在不同的栽培區(qū)域表現(xiàn)出不同的產(chǎn)量特點(diǎn)，不同菌株在同一栽培區(qū)域表現(xiàn)出不同的產(chǎn)量特點(diǎn)，應(yīng)結(jié)合栽培區(qū)域選擇最優(yōu)的菌株。適合在榆林地區(qū)栽培的最優(yōu)菌株為NK-02，即來自四川綿陽的七妹羊肚菌，最高產(chǎn)量達(dá)292.5 kg·667-1m-2，居于26個(gè)菌株在不同地方的產(chǎn)量之首。