橡膠草TkAPC10基因的鑒定及其表達模式分析

覃 碧 王肖肖，2 楊玉雙 聶秋海 陳秋惠 劉實忠*

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所，?？?571101；2. 海南大學熱帶作物學院，?？?570228；3. 北京玲瓏蒲公英科技發(fā)展有限公司，北京 110000）

泛素—蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system）是一個高效、專一性和選擇性強的蛋白降解系統(tǒng)，由泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）和26S 蛋白酶體組成，其中E3 決定泛素化底物的特異性。泛素化過程中，E1 負責激活泛素蛋白（Ub），并把激活的Ub 連接到E2 上，形成E2-Ub 復(fù)合物。E3 負責識別目標蛋白，促進E2將Ub 轉(zhuǎn)移到靶蛋白上。泛素化修飾的蛋白可被26S 蛋白酶體降解成短肽和氨基酸釋放到細胞中可供再次利用。泛素—蛋白酶體途徑在植物生長發(fā)育、激素合成、感知和下游信號傳導(dǎo)、自交不親和、抗病、抗逆、表觀遺傳、形態(tài)建成等過程都發(fā)揮重要作用。

在擬南芥基因組中有超過1 600 個基因編碼泛素—蛋白酶體系統(tǒng)的核心組分，占到其蛋白質(zhì)組的近6%，其中包含2 個E1，至少37 個E2，而E3 則 超 過1 400 個。APC/C（anaphase-promoting complex/cyclosome）是一個泛素連接酶E3復(fù)合體，研究人員從遺傳學、生物化學以及結(jié)構(gòu)生物學的角度揭示APC/C 的組成與結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果表明，該復(fù)合體由13個不同的亞基組成，包括核心亞基和激活調(diào)節(jié)亞基。核心亞基由APC1、APC2、APC3/CDC27、APC4、APC5、APC6/CDC16、APC8/CDC23、APC9、APC10/DOC1、APC11，其 中APC3/CDC27、APC6/CDC16、APC8/CDC23 分別含有2 個拷貝，這3 個蛋白形成的二聚體組成一個四肽重復(fù)TPR 子復(fù)合體；APC2 與APC11 形成一個催化中心子復(fù)合體；APC1、APC4 和APC5 組成一個結(jié)構(gòu)性骨架，該骨架連接TPR 和催化中心子復(fù)合體，末端的APC3/CDC27 與APC10/DOC1 及激活蛋白CDH1 或 者CDC20 結(jié) 合。APC10/DOC1 和CDC20 或CDH1 決定APC/C 復(fù)合體識別底物的特異性及其活性，并負責將泛素連接到底物蛋白上。APC/C 復(fù)合體主要通過調(diào)控細胞周期過程從而調(diào)控有機體的正常生長和發(fā)育。在酵母中，提高APC10 的表達水平可延長酵母細胞的壽命，在人類細胞中APC10 蛋白活性的提高或者降低均與癌癥有關(guān)。在植物擬南芥中，調(diào)控葉片和導(dǎo)管的發(fā)育，過 表 達導(dǎo)致植株出現(xiàn)類似乙烯和生長素敏感的表型，表明參與乙烯和生長素信號調(diào)控植物生長發(fā)育的過程。在水稻中，OsAPC10 與TAD1 形成復(fù)合體對MOC1 進行泛素化修飾和降解從而調(diào)控水稻的株高和分蘗。由于APC/C 復(fù)合體結(jié)構(gòu)及功能的復(fù)雜性，非模式植物中有關(guān)APC/C復(fù)合體的編碼基因及其功能知之甚少。

橡膠草（Rodin）為菊科（Asteraceae）蒲公英屬（）植物，其根部的乳管細胞可合成優(yōu)質(zhì)的天然橡膠，是極具發(fā)展前景的產(chǎn)膠作物，也是研究天然橡膠生物合成的理想模型。盡管泛素連接酶在其他植物中的重要功能已經(jīng)得到證實，但目前尚未有橡膠草泛素連接酶基因克隆及其功能研究的報道。為揭示泛素連接酶基因在橡膠草生長發(fā)育、天然橡膠合成以及逆境響應(yīng)中的功能，克隆了橡膠草基因，并分析其基因與蛋白結(jié)構(gòu)特征及基因表達模式，為橡膠草遺傳改良提供優(yōu)異基因資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為本實驗室保存的橡膠草種質(zhì)1 151，于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23℃，光照16 h·d，光照強度為2 000～2 500 lx。在盛花期同時取不同組織（包括根、葉、花和花梗），用于分析基因在不同組織的表達特征。采用不同脅迫（包括PEG6000、甘露醇、NaCl）以及不同激素（包括脫落酸、乙烯利、茉莉酸甲酯）對2～3 個月齡的組培苗進行處理，具體處理方法參照本實驗室前期建立的方法進行，在處理后不同時間分別取其葉片，用于分析基因的表達模式。

1.2 實驗方法

橡膠草葉片基因組DNA采用高效植物基因組DNA 提取試劑盒（TIANGEN）提取，不同組織的總RNA 采用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（TIANGEN）提取，提取步驟參照試劑盒說明書進行。采用微量分光光度計（P-330-31-10，Implen）檢測DNA 與總RNA 的濃度與純度。以1 μg 的總RNA 為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme）合成得到cDNA，具體步驟參照說明書進行。

用擬南芥AtAPC10（登錄號：NP_565433.1）的氨基酸序列對橡膠草基因組序列進行tBlastn 搜索，獲得橡膠草基因的DNA 序列，并設(shè)計基因克隆引物TkAPC10-F和TkAPC10-R（見表1），用KOD 高保真性聚合酶（TOYOBO）進行PCR 擴增，反應(yīng)體系：cDNA 模板2 μL（～60 ng），2×PCR buffer for KOD FX 25 μL，dNTPs 10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各1 μL，KOD FX 1 μL，ddHO 補足50 μL，擴增程序為94℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，68 ℃延伸1 min，共33個循環(huán)；最后4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段采用凝膠回收試劑盒（OMEGA）進行回收，并連接到平末端克隆載體Blunt-Zero（Vazyme）上轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 進行克隆，菌落PCR 檢測后挑取陽性單克隆送測序公司進行測序驗證。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences used in this study

根據(jù)基因cDNA 序列設(shè)計熒光定量qRT-PCR 引物TkAPC10-QF 和TkAPC10-QR（見表1），以橡膠草基因作為內(nèi)參基因，采用SYBR Green 法進行qRT-PCR 擴增，反應(yīng)體系為2×SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）10 μL，上、下游引物（10 μmol·L）各0.4 μL，cDNA 1 μL（30 ng），ddHO 8.2 μL，在熒光定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad）上進行擴增，擴增程序為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。根據(jù)CT 值用2計算目的基因的相對表達量。采用SAS 軟件進行單因素ANOVA 完全隨機（均衡）分析差異顯著性，采用Origin Pro 2019軟件進行作圖。

采用NCBI 的ORF Fider 分析工具確定基因的ORF 及其編碼氨基酸序列，采用Cell-PLoc 2.0 軟件預(yù)測蛋白的亞細胞定位情況。采用SMART 分析工具對TkAPC10 的蛋白結(jié)構(gòu)特征進行分析。通過搜索橡膠草基因組，提取基因起始密碼子前的2 000 bp 作為啟動子序列，采用PlantCARE 分析工具對其啟動子元件進行分析和預(yù)測。在NCBI 非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中采用BLASTp 搜索TkAPC10 蛋白序列的同源性序列。采用Clustalx 軟件和DNAMAN 軟件進行同源蛋白序列比對分析，然后用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 TkAPC10基因的克隆及其剪切方式、蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

以橡膠草1151 的cDNA 和基因組DNA 為模板，采用TkAPC10-F和TkAPC10-R引物進行擴增，目標片段經(jīng)測序驗證后獲得基因序列，其ORF 為579 bp，編碼192 個氨基酸，其基因組DNA 序列為1 092 bp（見圖1）。通過對的cDNA 與基因組DNA 序列進行比較，分析其外顯子剪切方式，結(jié)果如圖1 所示，基因包含6 個外顯子和5 個內(nèi)含子，6 個外顯子的長度依次為179、61、93、71、105、70 bp（圖1，下劃線標出），5 個內(nèi)含子的長度依次為94、132、84、87、116 bp，內(nèi)含子的邊界為5′-GT…AG-3′（圖1，用灰色背景標出）。以的cDNA序列在橡膠草基因組中搜索發(fā)現(xiàn)，該基因以單拷貝的形式存在。進一步從基因組中提取起始密碼子前的2 000 bp 作為啟動子序列，采用PlantCARE 軟件進行順式作用元件分析和預(yù)測，發(fā)現(xiàn)基因的啟動子序列上含有ABA 響應(yīng)的ABRE、茉莉酸響應(yīng)的CGTCA-motif 和TGACG-motif 元件，以及一些逆境響應(yīng)相關(guān)元件，比如干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MBS、防御與逆境響應(yīng)相關(guān)的TC-rich repeats、厭氧誘導(dǎo)的ARE元件。

圖1 TKAPC10基因序列及其外顯子剪切方式外顯子用下劃線標出；內(nèi)含子的邊界（5′-GT…AG-3′）用灰色背景標出；TkAPC10 基因全長的擴增引物結(jié)合位點用雙下劃線標出，qRTPCR引物的結(jié)合位點用藍色背景標出Fig.1 TKAPC10 gene sequence and its exon splicing patternExons were underlined，the boundaries of introns（5′-GT…AG-3′）were marked with a gray background；the binding sites of primers used in amplification of the full length of TkAPC10 were marked with double underlines，and the binding sites of primers used in qRT-PCR amplification were marked with a blue background

采用不同的生物信息學軟件對TkAPC10蛋白的理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)特征進行分析發(fā)現(xiàn)，TkAPC10 蛋白為21.50 kDa，等電點6.51。采用SMART 在線分析軟件以及NCBI 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，TkAPC10 屬于APC10 蛋白家族，第27-191 位氨基酸的區(qū)域為APC10 保守結(jié)構(gòu)域（見圖2），采用TOPCONS 在線分析軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。采用Cell-PLoc 2.0在 線 軟 件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TkAPC10蛋白定位在細胞核中。

圖2 TkAPC10蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Analysis of the conserved domain of TkAPC10 protein

2.2 TKAPC10 的同源蛋白搜索及其進化關(guān)系分析

以TkAPC10 的氨基酸序列在NCBI 非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLASTp搜索其同源蛋白，結(jié)果表明，不同物種的APC10 蛋白具有很高的同源性，TKAPC10 與萵苣LsAPC10 的相似性最高達到99%，僅有2 個氨基酸差異；與其他菊科植物如刺苞菜薊CcAPC10、黃花蒿AaAPC10 的相似性也達到95%以上；與木本植物的毛果楊PtAPC10、橡膠樹HbAPC10 的相似性達到85%以上；與擬南芥AtAPC10 的相似性為84%；與禾本科植物粳稻OsAPC10 的相似性為74.13%；與人類HsAPC10 的相似性為48.19%，與釀酒酵母ScAPC10（DOC1）的相似性最低，為36%（見圖3～4）。進一步的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，TKAPC10 與雙子葉植物的APC10 蛋白聚為一類，而單子葉植物粳稻OsAPC10 單獨聚為一類，表明APC10 蛋白在單子葉與雙子葉形成之前發(fā)生了分化，而人類的HsAPC10、釀酒酵母ScAPC10 也各自聚為一類（見圖4）。以上結(jié)果表明，不同物種的APC10 蛋白具有較高的保守性，同時在物種進化過程中形成了不同物種間的獨特特征。

圖3 TKAPC10及其同源蛋白的多重序列比對分析Fig.3 Multiple protein sequence alignment of TKAPC10 and its homologous proteins

圖4 TKAPC10與其他物種的APC10蛋白的系統(tǒng)進化關(guān)系分析Fig.4 Phylogenetic analysis of TKAPC10 and APC10 proteins from other species

2.3 TKAPC10基因的表達模式分析

采用qRT-PCR 技術(shù)對不同組織中基因的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在花梗中的表達量最低，花和葉中的表達量最高，是花梗中的2.8 倍，其次是根，表明基因在細胞分裂旺盛的組織（花、葉和根）中表達量顯著高于細胞分裂活動相對緩慢的組織（花梗）（＜0.05），而在花、葉、根三個組織間的表達量差異不顯著（見圖5），說明該基因參與橡膠草細胞分裂過程的調(diào)控。

圖5 TKAPC10基因在橡膠草不同組織中的表達分析各柱形圖上用不同字母表示差異顯著（P＜0.05），下同F(xiàn)ig.5 Expressions of TKAPC10 in different issues of T.kok-saghyzDifferent letters above each column means significant at P＜0.05 level，the same as below

由于基因啟動子含有ABA、JA、干旱等逆境響應(yīng)元件，因此，利用外源激素ABA、Me-JA、ET 以及PEG6000、甘露醇、NaCl 分別模擬干旱、滲透壓、高鹽等非生物脅迫對橡膠草進行處理，分析基因?qū)Σ煌に睾兔{迫處理的響應(yīng)情況。結(jié)果如圖6 所示，外源ABA 處理后，基因轉(zhuǎn)錄本顯著下降，6 h 的表達水平最低，是對照0 h 的0.5 倍；而外源MeJA 處理后，基因顯著上調(diào)表達，24 h 達到最高表達量，是0 h 的3.4 倍；外源ET 處理后，基因表達量也顯著上升，12 h 達到最高水平，是0 h 的2.6 倍。PEG6000 模擬的干旱脅迫處理后，顯著下調(diào)表達，48 h 的表達量最低，與對照0 h 相比下調(diào)了32%；甘露醇介導(dǎo)的滲透壓脅迫處理后，該基因轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降，12 h 的轉(zhuǎn)錄水平最低，與對照0 h 相比下降了35%；而NaCl 高鹽脅迫處理后，的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，24 h 達到最大值，是0 h 的3.3 倍（見圖6）。以上結(jié)果表明，基因參與橡膠草ABA、JA、ET 激素信號傳導(dǎo)以及干旱、滲透壓、高鹽脅迫響應(yīng)過程的調(diào)控。

圖6 TKAPC10基因在不同外源激素以及不同非生物脅迫處理下的表達模式分析Fig.6 Expression patterns of TKAPC10 under exogenous hormones and abiotic stress treatments

3 討論

細胞周期在調(diào)控有機體的生長與發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是有機體最重要的生物過程之一。真核生物的細胞周期一般分為G1 期、S 期、G2 期和M 期，其中特定調(diào)節(jié)因子蛋白及時、準確地被降解是確保細胞周期能夠單向地、不可逆地向前運轉(zhuǎn)的關(guān)鍵。APC/C 和SCF（Skp1/Cullin/F-box）復(fù)合體是 調(diào) 控 細 胞周期的兩個E3 泛素連接酶。APC/C 復(fù)合體介導(dǎo)底物的降解需要激活因子CDH1或者CDC20的激活作用，大部分被識別并降解的底物中均含有D-box 和或KEN-box 結(jié)構(gòu)域。CDH1通過結(jié)合APC/C 復(fù)合體、識別并招募特定的底物（包括有絲分裂細胞周期蛋白、有絲分裂激酶、參與染色體分離的蛋白質(zhì)、DNA 復(fù)制蛋白質(zhì)以及轉(zhuǎn)錄因子）進而調(diào)控細胞周期進程以及基因組的穩(wěn)定性。

盡管APC/C 復(fù)合體的亞基組成和結(jié)構(gòu)模型已經(jīng)清楚，但各個亞基的功能目前還不是很清楚。在植物中，有關(guān)APC/C 復(fù)合體的功能研究主要集中在模式植物擬南芥中。對擬南芥不同APC/C 亞基的功能研究結(jié)果表明，擬南芥基因編碼APC3/CDC27同源蛋白，該基因是調(diào)控分生組織的細胞分裂與細胞分化的關(guān)鍵基因，而且基因能夠部分互補酵母/突變體的功能，該基因的轉(zhuǎn)錄受細胞周期調(diào)控，同時將植物細胞周期與細胞分化進程聯(lián)系起來。擬南芥、的突變均導(dǎo)致植株的育性顯著下降，雌配子發(fā)生與胚胎發(fā)生異常，細胞周期蛋白cyclin B 積累并破壞胚胎形成過程中生長素的分布，而且雙基因突變的育性顯著低于單基因突變，表明協(xié)同在雌配子發(fā)生和胚胎發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，除此之外，擬南芥能夠互補酵母突變體的功能。擬南芥為單拷貝基因，該基因在不同組織中均有表達，而且能夠部分互補酵母突變體的功能，AtAPC2 與AtAPC11 及AtAPC8 蛋白互作，突變體導(dǎo)致雌配子發(fā)生受損，細胞周期蛋白β-葡萄糖醛酸酶報告蛋白積累，但其四分體時期并沒有終止。擬南芥基因編碼APC6 同源蛋白，基因突變導(dǎo)致胚囊發(fā)育停滯在雙核階段，細胞周期蛋白Cyclin B 無法降解，表明基因在配子體發(fā)育過程中具有重要功能。目前研究發(fā)現(xiàn)APC/C 的功能主要集中在細胞分裂與細胞分化中的調(diào)控作用，而對APC/C 的其他功能知之甚少。研究人員采用細胞周期蛋白作為報告蛋白追蹤植株發(fā)育過程中APC/C 的活性，發(fā)現(xiàn)其E3 泛素連接酶的活性在細胞有絲分裂的后期依然存在，而降低APC/C 活性之后，擬南芥植株出現(xiàn)一些發(fā)育異常的現(xiàn)象，包括維管組織，尤其是木質(zhì)部和木質(zhì)化的厚壁組織增加，表明APC/C 在植物微管組織發(fā)育過程中具有重要功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，AtAPC10 蛋白定位在細胞核中，該基因的缺失突變體嚴重影響雌配子體的發(fā)育，AtAPC10 通過調(diào)控細胞分裂進而調(diào)控葉片和維管束發(fā)育；而且基因的過表達導(dǎo)致植株出現(xiàn)類似乙烯和生長素敏感的表型，表明該基因參與乙烯和生長素信號調(diào)控植物生長發(fā)育的過程。在單子葉植物水稻中，OsAPC10與TAD1形成復(fù)合體通過調(diào)控MOC1 蛋白進而調(diào)控水稻的株高和分蘗；水稻中影響雌配子發(fā)育和赤霉素應(yīng)答，并且參與調(diào)控植株的株高，該基因位點的T-DNA 插入突變體中雌配子有絲分裂異常，極核數(shù)目減少或者缺失，導(dǎo)致胚乳不能發(fā)育，進而造成胚和種子的敗育，植株矮化。

為了解析橡膠草APC/C 復(fù)合體的功能，本研究克隆了基因，其編碼蛋白含有一個保守的APC10 結(jié)構(gòu)域，屬于APC10 家族成員。對不同物種的APC10同源蛋白進行系統(tǒng)進化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物種的APC10蛋白具有很高的同源性，TKAPC10 與萵苣LsAPC10 的相似性最高達到99%，與擬南芥AtAPC10 的相似性達到84%，蛋白序列的保守性表明不同物種的APC10蛋白具有功能的保守性。以往利用酵母缺失突變體的功能驗證結(jié)果表明，擬南芥AtAPC10 蛋白能夠互補酵母突變體的功能也證明這一結(jié)論。系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，雙子葉植物與單子葉植物的APC10 聚在不同的亞族，而人類的HsAPC10、釀酒酵母ScAPC10 也各自聚為不同的類群，表明APC10 蛋白在物種進化過程中形成了不同物種間的獨特特征，這些特征可能使得不同物種APC10的功能出現(xiàn)分化。采用qRT-PCR技術(shù)對的表達模式進行分析，結(jié)果表明，在不同組織中均有表達，但在細胞分裂旺盛的組織（花、葉和根）中的表達量顯著高于細胞分裂活動相對緩慢的組織（花梗），表明該基因調(diào)控橡膠草細胞分裂過程，這與上述APC/C 亞基的功能類似，說明不同物種APC/C 復(fù)合體調(diào)控細胞周期的保守功能。此外，基因表達受外源激素ABA、MeJA 和ET 以及NaCl 高鹽脅迫、PEG6000 模擬的干旱脅迫以及甘露醇介導(dǎo)的滲透壓脅迫誘導(dǎo)，表明該基因參與橡膠草激素信號傳導(dǎo)以及逆境脅迫響應(yīng)過程的調(diào)控。在干旱條件下，植物的細胞增殖與延展均受到影響，導(dǎo)致葉片變小，同時葉片細胞數(shù)量以及細胞大小均下降。細胞增殖階段受到脅迫時，細胞分裂首先會通過乙烯信號途徑降低CDKA 活性從而使細胞周期可逆性地停滯在轉(zhuǎn)錄后方式。CDKA是細胞周期的主要驅(qū)動力，并且參與細胞周期的G1 到S 以及G2 到M 時期的轉(zhuǎn)變。當脅迫持續(xù)存在時，細胞通過退出有絲分裂周期而開始核內(nèi)復(fù)制，從而開始向細胞延展的過渡。而這個過渡過程依賴于GA 信號途徑。研究表明，滲透壓脅迫影響擬南芥葉片細胞的分裂，改變植株體內(nèi)GA 代謝，通過抑制子DEL1/E2FE 和UVI4 下調(diào)APC/C 的活性從而導(dǎo)致DELLAs蛋白穩(wěn)定，進而導(dǎo)致有絲分裂提前結(jié)束以及細胞提前進入核內(nèi)復(fù)制，而且這個過程與已知細胞周期抑制蛋白的上調(diào)無關(guān)?；虻墓δ苓€有待進一步通過基因過表達、基因敲除的功能互補進行驗證，本研究結(jié)果為進一步解析基因調(diào)控橡膠草細胞分裂、激素信號傳導(dǎo)以及逆境脅迫響應(yīng)過程的功能奠定了良好的基礎(chǔ)，為橡膠草遺傳改良提供了優(yōu)異的基因資源。