巴西橡膠樹膠乳中DUF1262結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)分析

代龍軍 劉明洋，2 陽江華 周 凱，2 郭冰冰 楊 洪 王立豐，2*

（1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州熱帶作物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，海南省高性能天然橡膠材料工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，?？?571101；2. 海南大學(xué)，?？?570228）

巴西橡膠樹（）是主要的產(chǎn)膠植物，天然橡膠合成核心步驟是異戊二烯焦磷酸單體聚合為天然橡膠。天然橡膠在巴西橡膠樹乳管細(xì)胞中經(jīng)類異戊二烯合成途徑合成，是典型的植物次生代謝產(chǎn)物，受乙烯、茉莉酸等多種激素信號以及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。研究表明天然橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體包括橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）、小橡膠粒子蛋白（small rubber particle protein，SRPP）、順式異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyltransferase，CPT）、CPT 結(jié)合蛋白，也被稱為CPT樣蛋白、橡膠轉(zhuǎn)移酶激活蛋白或HRT-REF 橋接蛋白，共4 個(gè)家族成員。異戊二烯焦磷酸單體聚合為天然橡膠的過程由橡膠轉(zhuǎn)移酶催化，而橡膠轉(zhuǎn)移酶是CPT 家族中一員，部分學(xué)者已將該家族的HRT1 和HRT2 作為橡膠轉(zhuǎn)移酶的候選基因進(jìn)行了研究。目前，橡膠轉(zhuǎn)移酶的屬性、異戊二烯焦磷酸單體聚合為天然橡膠的機(jī)制、天然橡膠分子質(zhì)量大小的決定機(jī)制和橡膠粒子蛋白的作用是天然橡膠產(chǎn)業(yè)尚未解決的幾個(gè)重要科學(xué)問題。

天然橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的具體組成目前尚不完全清楚。Yamashita 等借助去垢劑洗滌過的橡膠粒子再添加REF、CPT（HRT1）和CPT 結(jié)合蛋白構(gòu)建了離體天然橡膠合成體系，分析了添加這些蛋白質(zhì)對合成體系的影響。研究者發(fā)現(xiàn)乳清中含有激活或抑制天然橡膠合成的蛋白質(zhì)。例如，從乳清中純化的真核蛋白翻譯起始因子eIF-5A 能促進(jìn)天然橡膠離體合成，橡膠樹中多個(gè)eIF-5A異構(gòu)體與GST 標(biāo)簽形成的融合蛋白能促進(jìn)天然橡膠離體合成。eIF-5A 是真核細(xì)胞蛋白翻譯的起始因子，而天然橡膠離體合成體系中不包括執(zhí)行蛋白質(zhì)翻譯功能的核糖體，eIF-5A 非經(jīng)核糖體起作用。乳清中也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)抑制天然橡膠合成的蛋白，該蛋白與馬鈴薯塊莖儲(chǔ)藏蛋白patatin 同源具有脂?；饷富钚裕瑢ο鹉z粒子有破壞作用，從而間接抑制天然橡膠合成。有研究者發(fā)現(xiàn)一個(gè)分子質(zhì)量較大的241 kDa 蛋白、2 個(gè)分子量較?。?.65、1.60 kDa）蛋白質(zhì)成分可能參與天然橡膠合成，但未對這些蛋白進(jìn)行鑒定。因此，探索構(gòu)成橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的除REF、SRPP、CPT、CPT 結(jié)合蛋白以外的蛋白質(zhì)組分具有重要的科學(xué)意義。

可見，未能確定橡膠轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的全部蛋白組分是目前存在的主要問題。采用蛋白互作分析技術(shù)等篩選和鑒定全部參與天然橡膠生物合成的蛋白，解析這些蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建有功能的離體天然橡膠合成體系，為天然橡膠合成提供理論依據(jù)，并對橡膠樹育種和品種改良提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所儋州基地種植的正常割膠的橡膠樹品種熱研73397，10年樹齡正常割膠樹的根、葉、樹枝、花、樹皮和膠乳為材料，進(jìn)行基因克隆和表達(dá)分析；取膠乳用于制備橡膠粒子樣本。試驗(yàn)所用的多克隆抗體委托南京金斯瑞生物科技有限公司制備。

參考樊松樂等和謝黎黎等的方法進(jìn)行激素等葉面噴施處理、使用橡膠樹品系熱研73397株高為70～80 cm的組培苗；使用體積分?jǐn)?shù)0.05%的乙醇溶液配制1 mmol·L水楊酸（SA）、200 μmol·L脫落酸（ABA）和體積分?jǐn)?shù)2%過氧化氫（HO），對照組用體積分?jǐn)?shù)0.05%的乙醇溶液，取樣時(shí)間分別為0、2、6、10、24、48、72 h。干旱處理參照本課題組已發(fā)表的方法進(jìn)行，取葉片提取總RNA。

1.2 橡膠粒子制備與橡膠粒子蛋白質(zhì)提取

橡膠粒子制備參照本課題組已發(fā)表的方法進(jìn)行，26 400×和4 ℃下離心1 h獲得橡膠粒子，其中洗滌步驟在26 400×和4 ℃下離心10 min 收集橡膠粒子。橡膠粒子蛋白質(zhì)提取過程是將洗滌過的橡膠粒子分散在5 倍體積的NP40 的裂解液（購自索來寶公司，主要成分為Tris（pH7.4），NaCl，1%NP-40，EDTA以及磷酸酶抑制劑）中，置于冰浴，使用搖床100 r·min震蕩提取30 min。將提取混合物在26 400×和4 ℃下離心1 h，然后取出水相部分，在35 000 r·min（105 000×）和4 ℃下離心40 min，使液體澄清，小心移除液面的少量漂浮物，再取出水相部分即為蛋白質(zhì)提取物。使用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量，將蛋白質(zhì)提取物分裝后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及捕獲蛋白鑒定

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)使用的抗體為兔源多克隆抗體，系使用一個(gè)CPT序列（NCBI登錄號AAM92881.1）的氨基酸序列片段（CSPPRELELKEAPGL）和CPT 結(jié)合蛋白（NCBI 登錄號BAV89210.1）的2 個(gè)氨基酸序列片段（CDSKGVLKTNKKTIM 及MDLKPGAGGQRVNRC）作為免疫原分別制備，抗體經(jīng)Protein A/G親和純化。

使用Pierce Co-Immunoprecipitation（Co-IP）Kit（貨號26149），依照試劑盒說明書進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)規(guī)模為每個(gè)反應(yīng)10 μg抗體和1 000 μg總橡膠粒子蛋白（體積為600 μL，使用試劑盒中的偶聯(lián)緩沖液稀釋）。正式進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)前，總橡膠粒子蛋白樣品先用10 μg 兔IgG（即無關(guān)抗體）偶聯(lián)的瓊脂糖樹脂孵育，以減少非特異反應(yīng)。

免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)束，洗脫的蛋白采用氯仿-甲醇法沉淀，然后對捕獲的蛋白進(jìn)行溶液內(nèi)胰蛋白酶水解。捕獲的蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解獲得的肽段在U3000 RSLC nano-Qe plus 液質(zhì)聯(lián)用儀（Thermo Fisher）上分析，使用NCBI 的巴西橡膠樹（taxid：3981）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)——蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)匹配以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)鑒定。獲得鑒定但無明確功能描述的蛋白質(zhì)，以其蛋白質(zhì)序列為查詢序列，blastP 檢索SWISS-PROT 的經(jīng)過人工審核的（reviewed）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，若仍無法從匹配的蛋白質(zhì)獲得明確功能信息，則進(jìn)一步檢索blastP NCB未經(jīng)過人工審核Ⅰ蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，以從匹配的蛋白質(zhì)獲取功能相關(guān)信息。經(jīng)檢索兩個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫均無法獲得明確功能信息的蛋白質(zhì)則進(jìn)一步分析。

1.4 基因克隆、熒光定量PCR和統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)使用的巴西橡膠樹不同組織的mRNA 采用天根生物公司的植物總RNA提取試劑盒按說明書提供的方法提取。使用NanoDrop 2000 超微量核酸蛋白分析儀（Thermo Fisher）檢測RNA 的濃度與純度。通過LC-MS 鑒定的未知蛋白登錄號為XP_021644636.1，對應(yīng)的基因登錄號為LOC110638365，據(jù)此設(shè)計(jì)克隆引物和熒光定量PCR 引物（見表1）。使用TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒從各組織mRNA 樣本中獲得cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和基因克隆，對克隆的基因測序。用為內(nèi)參基因（GenBank：HQ260674.1）進(jìn)行PCR 熒光定量分析，使用2法計(jì)算相對表達(dá)量，使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素ANOVA 檢驗(yàn)分析處理與對照之間的差異顯著性。

表1 LOC110638365基因ORF擴(kuò)增和熒光定量引物序列Table 1 Primer sequences for cloning open reading frame and qRT-PCR analysis of LOC110638365

1.5 氨基酸序列同源性分析及互作蛋白分析

使用TMHMM-2.0 工具（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）分 析XP_021644636.1 的氨基酸序列形成跨膜結(jié)構(gòu)域的可能性。對以下3 個(gè)來源的蛋白或核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索：使用XP_021644636.1 的氨基酸序列對NCBI taxid 3981 蛋白質(zhì)庫進(jìn)行blastP 檢索，下載所有匹配的蛋白質(zhì)序列；使用XP_021644636.1 的氨基酸序 列 對NCBI taxid 3981 TSA 庫（Transcriptome Shotgun Assembly Sequence Database）進(jìn)行tblastN檢索，下載所有的核酸序列；使用Emboss getorf 工具（http：//emboss. bioinformatics. nl/cgi-bin/emboss/getorf）將核酸序列翻譯為氨基酸序列（保留長度大于250個(gè)氨基酸殘基的序列，ORF區(qū)需具有完整的起始密碼子和終止密碼子）；使用XP_021644636.1的氨基酸序列對中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基因組測序結(jié)果推導(dǎo)獲得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blastP 檢索后下載所有匹配的蛋白質(zhì)序列；使用CDHIT 工 具（http：//weizhong-lab. ucsd. edu/cdhitweb-server/cgi-bin/index.cgi？cmd=cd-hit）對這些序列進(jìn)行聚類（cutoff=0.95，將一致性大于95%的序列歸為一類）。使用MEGA 11 軟件對這3 個(gè)來源的代表性蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析序列間的冗余情況及基因家族構(gòu)成。

使用蛋白質(zhì)相互作用分析網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org）提供的檢索功能，搜索范圍設(shè)定為大戟科（Euphorbiaceae）和楊屬（），分別搜索XP_021644636.1 氨基酸序列的相似序列，并查看與相似序列互作的蛋白，從而了解目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫共沉淀技術(shù)鑒定DUF1262結(jié)構(gòu)域蛋白

為了尋找參與或調(diào)節(jié)天然橡膠合成的未知蛋白質(zhì)組分，使用抗CPT 抗體及抗CPT 結(jié)合蛋白抗體（CPT 和CPT 結(jié)合蛋白為天然橡膠合成的核心蛋白組分）對從橡膠粒子提取的蛋白進(jìn)行了免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）分析捕獲的蛋白質(zhì)。捕獲的蛋白質(zhì)使用NCBI橡膠樹蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果如下：使用CPT 抗體的實(shí)驗(yàn)捕獲了111個(gè)蛋白，使用CPT結(jié)合蛋白抗體的實(shí)驗(yàn)捕獲了54 個(gè)蛋白質(zhì)。2 個(gè)試驗(yàn)中均捕獲的與天然橡膠合成相關(guān)的蛋白質(zhì)包括：3個(gè)CPT 家族成員（登錄號：BAF98305.1、XP_021662710.1、XP_021657207.1）；1 個(gè)CPT 結(jié) 合 蛋 白（XP_021659160.1）；6 個(gè) REF/SRPP 家 族 成 員CAA39880.1、 XP_021662186.1、 AMO43675.1、AMO43676.1、XP_021653593.1 和AHF95713.1，其中CAA39880.1 為橡膠粒子中豐度最高的REF 蛋白，即REF1；AHF95713.1 為橡膠粒子中豐度最高的SRPP 蛋白，即SRPP1。逐一分析了有功能描述的蛋白質(zhì)與天然橡膠合成的相關(guān)性，排除與天然橡膠合成無關(guān)的有功能描述的蛋白。最后分析了無功能描述的蛋白質(zhì)，以期從中發(fā)現(xiàn)與天然橡膠合成或天然橡膠合成調(diào)控相關(guān)的蛋白。使用NCBI 蛋白質(zhì)庫檢索的情況下，使用CPT 抗體捕獲的蛋白中有13 個(gè)為功能未知蛋白質(zhì)；使用CPT 結(jié)合蛋白抗體捕獲的蛋白中有6個(gè)為功能未知蛋白質(zhì)；二者疊加共有15個(gè)功能未知蛋白質(zhì)。這些未能通過質(zhì)譜譜圖—蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配直接獲得功能描述的蛋白質(zhì)，需進(jìn)一步將其蛋白質(zhì)序列先后blastP檢索SWISS-PROT 經(jīng)人工審核的蛋白數(shù)據(jù)庫和NCBI nr 未經(jīng)人工審核的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，依據(jù)序列同源性獲得功能描述。XP_021644636.1 是CPT 抗體捕獲的蛋白質(zhì)，圖1 顯示了該蛋白質(zhì)一條肽段ELELKEAPGLDK 的二級質(zhì)譜。

圖1 LC-MS分析獲得的XP_021644636.1一個(gè)多肽片段ELELKEAPGLDK 的二級質(zhì)譜b1～b11和y1～y11分別代表肽鍵斷裂后的N端碎片離子（B系列）和C端碎片離子（Y系列）Fig.1 MS spectrum of a polypeptide fragment ELELKEAPGLDK in XP_021644636.1obtained by LC-MS analysisb1-b11 and y1-y11 represented the N-terminal fragment ion（sB series）and C-terminal fragment ion（sY series）generated by peptide bond cleavage，respectively

首先用15 個(gè)功能未知蛋白序列對SWISSPROT蛋白質(zhì)庫進(jìn)行blastP檢索，其中有9個(gè)獲得功能描述，6 個(gè)（XP_021644636.1、XP_021692246.1、XP_021689565.1、XP_021676080.1、XP_021647342.1、XP_021667550.1）未獲得功能描述。然后以6個(gè)未獲功能描述的蛋白質(zhì)作為查詢序列對NCBI nr 全庫進(jìn)行blastP 檢索，其中5 個(gè)獲得明確的功能描述，僅XP_021644636.1 沒有明確功能描述。以XP_021644636.1 對NCBI nr 蛋白庫進(jìn)行blastP 檢索，結(jié)果顯示其AA 23～124 處為DUF1262 結(jié)構(gòu)域（DUF：Domain of unknown function），其較疏水部分在DUF1262 結(jié)構(gòu)域內(nèi)（見圖2A）。圖2B 顯示了XP_021644636.1 與NCBI pfam（蛋白質(zhì)家族）數(shù)據(jù)庫中其它物種同源蛋白的保守氨基酸殘基。TMHMM 跨膜結(jié)構(gòu)域分析顯示，XP_021644636.1形成跨膜結(jié)構(gòu)域的可能性低于13%（形成跨膜結(jié)構(gòu)域可能性最高區(qū)段為AA 79-98）。XP_021644636.1的N 端存在小段弱疏水區(qū)的情況與橡膠延伸因子REF1 類似（見圖2C）。但ProtParam 分析表明該蛋白為親水蛋白質(zhì)，總平均親水性（Grand average of hydropathicity，GRAVY）值 為-0.487，而REF1 的GRAVY值為0.044，為疏水蛋白。

圖2 XP_021644636.1的DUF1262結(jié)構(gòu)域及形成跨膜結(jié)構(gòu)的可能性A.NCBI blastP 結(jié)果中顯示的DUF1262 結(jié)構(gòu)域；B.DUF1262 結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列，XP_021644636.1 與其他5 個(gè)蛋白（NCBI pfam06880的前5 個(gè)代表性序列）的DUF1262 結(jié)構(gòu)域序列比對，其中XP_009391265 來自wild Malaysian banana，XP_002892755 和XP_002892757 來自Arabidopsis lyrata subsp.Lyrata，XP_013677813 來自rape，OAP18071 來自thale cress。使用ClustalW2 軟件進(jìn)行序列比對，然后使用Genedoc軟件繪制；C.TMHMM-2.0分析結(jié)果，箭頭所示為2個(gè)蛋白（XP_021644636.1和橡膠延伸因子REF1）各自具有疏水傾向的區(qū)段Fig.2 DUF1262 domain of XP_021644636.1 and its propensity to form a transmembrane structureA.The DUF1262 domain shown in the blastP results；B.Conserved sequence of DUF1262 domain.XP_021644636.1 was aligned with the DUF1262 domain sequences of 5 other proteins（top five representative sequences of NCBI pfam06880），wherein XP_009391265 is from wild Malaysian banana，XP_002892755 and XP_002892757 are from Arabidopsis lyrata subsp.Lyrata，XP_013677813 was from rape，and OAP18071 was from thale cress（Arabidopsis thaliana）.Sequence alignments were performed using ClustalW2 software and then plotted using Genedoc software；C.TMHMM-2.0 analysis results.Arrows indicated the hydrophobic regions of two proteins（XP_021644636.1 and rubber extension factor REF1）

2.2 DUF1262 結(jié)構(gòu)域蛋白氨基酸序列同源性分析

以XP_021644636.1為查詢序列對橡膠樹相關(guān)蛋白質(zhì)和核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)存在50 個(gè)類似序列，典型的氨基酸殘基數(shù)量為392、410、381，這些蛋白的N端均含有DUF1262結(jié)構(gòu)域（見圖3）。以XP_021644636.1的氨基酸序列作為查詢序列對NCBI taxid 3981 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，匹配了15 個(gè)蛋白質(zhì)序列，對NCBI taxid 3981 的TSA 庫進(jìn)行tblastN 檢索，匹配了27 個(gè)核酸序列。以XP_021644636.1 的氨基酸序列作為查詢序列對中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所基因組測序推導(dǎo)得到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，匹配了12 個(gè)蛋白質(zhì)序列，去除含有不明確氨基酸殘基的4 個(gè)序列，僅保留8 個(gè)確定的序列。將TSA 序列使用EMBOSS getorf 工具轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)序列。3 個(gè)來源疊加后共有50個(gè)有效蛋白質(zhì)序列，為簡潔起見，使用CDHIT工具對這些序列進(jìn)行聚類（cutoff=0.95，將序列一致性大于95%的序列歸為一類），使用MEGA 11軟件對CDHIT選定的代表性蛋白序列進(jìn)行比對和進(jìn)化樹構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)橡膠樹DUF1262 家族蛋白主要集中于4 類（見圖3）。其中，XP_021644636.1 即DUF1262蛋白單獨(dú)聚為一類。

圖3 橡膠樹DUF1262家族蛋白序列聚類后代表序列的進(jìn)化樹蛋白質(zhì)序列收集自NCBI taxid 3981的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和TSA 庫以及橡膠所基因組推導(dǎo)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；這些序列先經(jīng)CDHIT聚類，然后在MEGA 11軟件上用代表性蛋白質(zhì)序列構(gòu)建進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of the representative sequences after clustering of the rubber tree DUF1262 family protein sequencesProtein sequences were collected from the NCBI tax id 3981 protein database and TSA library and the Rubber Institute of China’s genome-derived protein database；These sequences were first clustered by CDHIT，and then a phylogenetic tree was constructed with representative protein sequences on MEGA 11 software

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

以XP_021644636.1 作為查詢序列，在https：//cn.string-db.org 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫的大戟科范圍內(nèi)檢索，相似度最高的蛋白質(zhì)為N 端含DUF1262 結(jié)構(gòu)域的木薯蛋白cassava4.1_031144m（），序列相似性為84.7%（e-value=3.6e）。與cassava4.1_031144m 相互作用的蛋白質(zhì)包括含有雙特異性磷酸酶（DSP，Dual specificity phosphatase）催化結(jié)構(gòu)域的Protein-tyrosine-phosphatase mkp1-like蛋白和含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子org2 類似蛋白異構(gòu)體x1 蛋白（Transcription factor org2-like isoform x1）。在https：//cn.string-db.org 網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫楊屬范圍內(nèi)檢索，相似度最高的蛋白質(zhì)為N 端含DUF1262 結(jié)構(gòu)域的POPTR_0008s10880.1（），序列相似性（identity）為69.9%（e-value=1.1e）。與POPTR_0008s10880.1 相互作用的蛋白質(zhì)包括含有VQ 基序的家族蛋白VQ（motifcontaining family protein），MAP 激酶磷酸酶1 家族蛋白（MAP kinase phosphatase 1 family protein），Kelch 重復(fù)f-box 家族蛋白（Kelch repeat-containing f-box family protein），有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸酶1 樣蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein-tyrosine-phosphatase mkp1-like），胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白（Late embryogenesis abundant protein）。以其他7 個(gè)代表性基因的氨基酸序列在https：//cn.string-db.org 網(wǎng)站檢索，結(jié)果與以XP_021644636.1 為查詢序列類似，其相互作用蛋白均涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程或轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程等。

2.4 基因克隆及熒光定量PCR分析

測序結(jié)果表明，使用克隆引物擴(kuò)增的核酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中登錄號為LOC110638365 的基因吻合，該基因編碼區(qū)1 179 bp，編碼392 個(gè)氨基酸。編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為45.36 kDa，等電點(diǎn)為8.67。不同組織的熒光定量PCR 分析結(jié)果（見圖4）表明，該基因的表達(dá)有明顯的組織偏向性，在花中表達(dá)高于其他組織，樹皮中次之，膠乳中最低。

圖4 XP_021644636.1 蛋白基因（LOC110638365）在橡膠樹不同組織中的表達(dá)水平Fig.4 Expression of XP_021644636.1 protein gene LOC110638365 in different tissues of rubber tree

組培苗葉片經(jīng)水楊酸、脫落酸、過氧化氫外施處理6 h 后，葉片中XP_021644636.1 蛋白基因（LOC110638365）的轉(zhuǎn)錄本明顯增加30～60 倍（見圖5：A～C）。干旱處理誘導(dǎo)葉片中該基因上調(diào)表達(dá)最高到11 倍（見圖5D）。這些結(jié)果顯示該基因響應(yīng)逆境脅迫上調(diào)表達(dá)。

圖5 XP_021644636.1 蛋白基因（LOC110638365）在水楊酸（A）、過氧化氫（B）、脫落酸（C）和干旱（D）處理的橡膠樹葉片中表達(dá)水平變化Fig.5 Changes of expression levels of XP_021644636.1 protein gene LOC110638365 in salicylic acid，abscisic acid，hydrogen peroxide and drought treated rubber leaves

3 討論

天然橡膠在巴西橡膠樹乳管細(xì)胞中經(jīng)類異戊二烯合成途徑合成，是典型的植物次生代謝產(chǎn)物，但橡膠樹如何精細(xì)調(diào)控天然橡膠合成與植株抗逆的機(jī)制需持續(xù)研究。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)是一種有效篩選天然橡膠生物合成酶互作蛋白的有效方法。本項(xiàng)研究采用免疫共沉淀技術(shù)，從橡膠樹膠乳蛋白中獲得了與CPT 抗體互作的N 端含DUF1262 結(jié)構(gòu)域蛋白。這一含DUF1262 結(jié)構(gòu)域蛋白未被CPT結(jié)合蛋白抗體及無關(guān)抗體（兔IgG）捕獲，表明XP_021644636.1蛋白與CPT存在相互作用。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析表明DUF1262結(jié)構(gòu)域蛋白（XP_021644636.1）可能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程有關(guān)，因?yàn)榕c之相似的木薯4.1_031144m蛋白與蛋白酪氨酸磷酸酶mkp1 類似蛋白及含螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子org2 類似蛋白異構(gòu)體x1蛋白等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白或轉(zhuǎn)錄因子有相互作用。其中有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸酶1 樣蛋白酪氨酸磷酸酶通過去磷酸化和抑制MPK6 和MPK3，并作為MPK6 和MPK3 信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)防御反應(yīng)等?？紤]到XP_021644636.1蛋白基因在樹皮有較高的表達(dá)量，推測該蛋白可能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄過程影響樹皮的生理活動(dòng)。橡膠樹樹皮的重要生理活動(dòng)之一是在韌皮部生產(chǎn)天然橡膠，天然橡膠由乳管細(xì)胞生產(chǎn)，但也需要乳管細(xì)胞周圍的薄壁細(xì)胞等提供碳源物質(zhì)與能量的支持，含DUF1262 結(jié)構(gòu)域蛋白與膠乳再生的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。從TMHMM 跨膜結(jié)構(gòu)域分析的結(jié)果看，XP_021644636.1 沒有形成明顯的跨膜區(qū)，但N 端（在DUF1262 結(jié)構(gòu)域內(nèi)）表現(xiàn)出一定的疏水傾向，這與REF/SRPP 家族成員存在小段疏水區(qū)類似。結(jié)合免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)從橡膠粒子總蛋白中捕獲XP_021644636.1 蛋白的事實(shí)，推測其可能是一個(gè)豐度極低的橡膠粒子膜結(jié)合蛋白并與橡膠粒子表面的蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的結(jié)合傾向，盡管從ProtParam的分析結(jié)果來看它比REF1更親水。

DUF1262 屬于未知功能結(jié)構(gòu)域，目前僅有關(guān)于編碼擬南芥（）含DUF1262結(jié)構(gòu)域蛋白基因的一些來自轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的報(bào)道。在不同的脅迫處理下，該基因的反應(yīng)不盡相同?；蛲ǔ１患谆种?，外施水楊酸可誘導(dǎo)該基因發(fā)生去甲基化，其表達(dá)量增加。在本研究中，向葉片噴施水楊酸也使編碼XP_021644636.1蛋白的基因上調(diào)表達(dá)。一個(gè)鈣結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子（CAMTA3）的突變引發(fā)了擬南芥葉片病變、數(shù)個(gè)防御相關(guān)基因及包含在內(nèi)的數(shù)個(gè)功能未知基因上調(diào)表達(dá)。對擬南芥進(jìn)行24 h 冷刺激激活了持續(xù)數(shù)天的應(yīng)激記憶，導(dǎo)致許多原本受光脅迫/低溫脅迫影響的基因表達(dá)解耦合，只有不受冷啟動(dòng)影響，冷啟動(dòng)處理后仍然在強(qiáng)光/低溫分別作用下表現(xiàn)為耦合的下調(diào)表達(dá)。另外，查閱https：//cn.string-db.org網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)除了與VQ motif 蛋白及Fbox 蛋白可能有相互作用，也可能與脫落酸和滲透脅迫誘導(dǎo)的受體類蛋白（Aba-and osmotic-stress-inducible receptor-like）及茉莉酸相關(guān)vq 基序基因1（Jasmonate-associated vq motif gene 1）蛋白等存在相互作用。這些關(guān)于擬南芥含DUF1262結(jié)構(gòu)域蛋白基因的信息給橡膠樹DUF1262 結(jié)構(gòu)域蛋白的功能提供了參考，提示該蛋白在橡膠樹中可能參與響應(yīng)逆境刺激或激素信號傳導(dǎo)引發(fā)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)活動(dòng)。

熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該基因在橡膠樹各組織中廣泛表達(dá)，在膠乳中表達(dá)量較低，而花和樹皮的表達(dá)量較高，而樹皮是乳管分布豐富和產(chǎn)膠較多的組織。這表明XP_021644636.1蛋白非橡膠粒子或膠乳特有，在樹皮的乳管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較少，而在樹皮中非乳管細(xì)胞中表達(dá)較多。熒光定量PCR結(jié)果也顯示葉片中該基因響應(yīng)多種逆境脅迫上調(diào)表達(dá)，表明該基因與橡膠樹抗逆功能顯著相關(guān)。

4 結(jié)論

通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和熒光定量技術(shù)，在巴西橡膠樹橡膠粒子總蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)功能未知的N 端含DUF1262 結(jié)構(gòu)域的蛋白，該蛋白可能與CPT 蛋白相互作用，受水楊酸、脫落酸、過氧化氫及干旱處理誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，表明其在橡膠樹膠乳生物合成和抗逆中具有重要作用，為深入解析天然橡膠生物合成的理化機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。