非洲豬瘟病毒在飼料中的傳播風(fēng)險及緩解措施

李 鵬，穆玉云，孫得發(fā)，周 陽

（諾偉司國際貿(mào)易（上海）有限公司，上海 200080）

非洲豬瘟（Africa Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（Africa Swine Fever Virus，ASFV）引起的豬的高度接觸性傳染性、出血性疾病，也是唯一已知的蟲媒病毒病，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%。雖然ASF 不是人畜共患傳染病，不會對公共衛(wèi)生造成直接危害，但是其對全球生豬和豬肉產(chǎn)品貿(mào)易會產(chǎn)生重大影響，并對全球糧食安全構(gòu)成威脅。由于缺乏有效的疫苗及治療方法，早期診斷及撲殺感染豬是防控的主要策略。預(yù)防ASF 傳入主要是通過執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全措施，包括對進(jìn)出農(nóng)場的人員、車輛、動物、物品、飼料和其他用品進(jìn)行規(guī)范的消殺處理。

目前，全球范圍內(nèi)ASFV 已鑒定出至少24 種基因型。歐洲主要流行的是基因I 和II 型，而亞洲主要流行是基因II 型。2018 年8 月3 日，我國報道了首例ASF 感染的病例，隨后科學(xué)家分離了國內(nèi)第一株ASFV，命名為HLJ/18 毒株，該毒株屬于高毒力的基因II 型，與ASFV-Georgia 2007 毒株和國內(nèi)SY/18 毒株高度同源。ASFV 在環(huán)境中比較穩(wěn)定，在污染的豬欄中保持感染性超過3 d，在豬的糞污中保持?jǐn)?shù)周的感染性，在室溫保存的血清或血液中存活18 個月，在腐爛的動物尸體中存活15 周。發(fā)病豬在潛伏期和轉(zhuǎn)歸期都能夠通過分泌物和排泄物向外界排毒。有證據(jù)表明，直接接觸有傳染性的家豬和野豬以及采食受污染的飼料是ASFV 向家豬傳播的主要途徑。

受污染的飼料和飼料成分是ASFV 向新的豬群和地區(qū)傳入和傳播的可能途徑之一，且ASFV 已證明在飼料成分中可以穩(wěn)定存活?，F(xiàn)代集約化養(yǎng)豬更需要警惕飼料污染造成的ASFV 傳播。因飼料生產(chǎn)的集中性和飼料輸送的日常性，一旦飼料或原料受到污染，很容易分散到大量養(yǎng)豬場。飼料本身是能量和營養(yǎng)充足的“培養(yǎng)基”，含有利于ASFV 存活的有機(jī)質(zhì)和活性成分。因此，本文總結(jié)了ASFV 在飼料及原料中存活及傳播的相關(guān)證據(jù)，以及緩解ASFV 在飼料中傳播的應(yīng)對策略，旨在為ASF 防控和豬飼料的生物安全升級提供借鑒和參考。

1 ASFV 在飼料及原料中存活的證據(jù)

近來的一些研究發(fā)現(xiàn)，ASFV 在模擬跨洋運(yùn)輸條件下可在全價料及原料豆粕、膽堿等中存活30 d 以上，且ASFV 陽性率在豆粕中為64%、賴氨酸為43%，膽堿和維生素D 為36%，全價料為38%，以上證據(jù)表明飼料及其特定組分或載體可能對ASFV 的穩(wěn)定性具有支持作用。ASFV 在飼料成分中的半衰期為病毒在不同基質(zhì)中的相對穩(wěn)定性提供了額外的證據(jù)。Stoian 等評估了跨洋運(yùn)輸條件（溫度12.3℃，濕度74.1%）下ASFV-Georgia 2007 毒株在飼料及原料中的半衰期（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASFV 的平均半衰期為12.2 d，其在有機(jī)豆粕中的半衰期比常規(guī)豆粕多3.3 d。ASFV 在全價料和原料中半衰期比在病毒培養(yǎng)液中更長。這些都提示，ASFV 在飼料基質(zhì)中半衰期估計的變異性可能與蛋白質(zhì)、脂肪或水分含量有關(guān)，也可能和化學(xué)暴露以及加工處理方式有關(guān)。

表1 模擬跨洋運(yùn)輸條件下ASFV（Georgia 2007 毒株）在飼料及原料中的半衰期①

閆之春等在2018 年11 月至2019 年2 月對我國3 家獨(dú)立商業(yè)飼料廠的5 646 份全價料混合樣品（28 230 份獨(dú)立樣本）和5 364 份原料混合樣本（26 820份獨(dú)立樣本）進(jìn)行了ASFV DNA 熒光定量PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2 家商業(yè)飼料廠的全價料和原料中檢測到ASFV 陽性，全價料陽性率為0.5%～1.2%，原料（玉米、小麥、大米、大豆粉、麩皮和稻殼等）陽性率為0.2～1.8%，原料中陽性檢出率玉米蛋白粉為1/14（7%），麩皮為6/14（43%），米糠為4/14（29%），大豆粉為3/14（18%）。Gebhardt 等對越南一家商業(yè)飼料廠進(jìn)行了ASFV 污染監(jiān)測，盡管飼料經(jīng)高溫制粒生產(chǎn)，并在檢測前1 個月已添加甲醛制劑以預(yù)防ASFV 污染，但102 份全價料樣品中仍檢測到1 個陽性（0.98%）。

亦有報道稱，將ASFV 污染的飼料置于受控環(huán)境下的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中，在隨后的多批飼料、環(huán)境粉塵和物體表面（工作服和工作鞋底）上發(fā)現(xiàn)有ASFV 病毒。一旦ASFV 污染飼料及生產(chǎn)加工線，將會在飼料廠內(nèi)廣泛分布，造成巨大的輸出風(fēng)險。

2 飼料引起ASFV 傳播的潛在風(fēng)險

飼料作為病毒傳播途徑造成疾病流行的實證來源于美國爆發(fā)的仔豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）。研究證實，受PEDV 污染的飼料、飼料加工廠、飼料運(yùn)輸車輛等都加劇了美國PEDV 疫情的快速蔓延和大爆發(fā)。ASF 在歐洲一些國家或地區(qū)的流行病學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ASFV 傳入可能與污染的飼料有關(guān)。例如，愛沙尼亞、拉脫維亞的農(nóng)場爆發(fā)ASF 的一個可能原因是商業(yè)豬飼養(yǎng)所需的谷物和草類受到ASFV 污染。羅馬尼亞2019 年5 月發(fā)生的ASF傳入案例最后歸因于采食了ASFV 陽性區(qū)域的谷物。

雖然通過采食（口鼻途徑）ASFV 污染的飼料造成傳播的風(fēng)險很早已被科學(xué)家證實，但是這種感染具有不確定性。早期的研究發(fā)現(xiàn)，家豬在采食了被ASFVKenya 毒株糞便和尿液污染的飼料時被感染，但在采食受污染的紅薯或香蕉時卻沒有被感染。同樣的，采食含ASFV-East African 毒株10～1050% 紅細(xì)胞凝集量（Hemadsorbing Dose，HAD）的液體或濕飼料后沒有感染，而采食含ASFV-Hinde WHII 毒株的干飼料（10～10HAD）后卻發(fā)生感染。近年來，Pietschmann 等研究也表明，ASFV-Armenia 2008 毒株在較低的感染量10～10HAD就能通過口鼻接種引起豬只感染。Howey 等研究發(fā)現(xiàn)，ASFVMalawi 1983 毒株經(jīng)鼻咽接種10HAD即可引起豬只感染，而經(jīng)口咽（類似自然采食）接種則需要更高的感染量10HAD。Blazquez 等研究發(fā)現(xiàn)，豬只反復(fù)采食混有ASFV-Georgia 2007 毒株50% 組織細(xì)胞感染量（Tissue Culture Infective Dose，TCID）（10或10TCID）液體豬血漿的全價飼料未造成感染。但是，Wen 等報道ASFV 污染的干燥血粉豬飼料（Dried Blood Pig Feed）是導(dǎo)致中國ASF 傳播的主要因素，并警告豬血粉等動物源性原料成分存在傳播ASFV 的巨大風(fēng)險。以上結(jié)果提示，ASF 通過采食飼料感染的不確定性與ASFV 的毒株類型、感染劑量、接觸感染靶點(diǎn)概率（扁桃體和頜下淋巴結(jié)）以及飼料基質(zhì)成分有關(guān)。

ASFV 向家豬傳播的主要途徑包括直接接觸有傳染性的家豬和野豬以及采食受污染的飼料。Niederwerder 等系統(tǒng)研究了ASFV-Georgia 2007 毒株通過自然采食受污染的植物性飼料和飲用水引起豬只感染的模型，通過在全價料中接種不同感染量（10～10TCID）的ASFV，明確了飼料中ASFV 最低感染劑量為10TCID，飲用水中的最低感染劑量為1 TCID。ASFV-Georgia 2007 毒株感染的豬只血液中ASFV 可高達(dá)10～10HAD/mL，唾液、尿液、糞便可高達(dá)10～10HAD/mL。顯然，發(fā)病豬的血液、分泌液和糞便中的ASFV 滴度遠(yuǎn)高于飼料和飲用水中的最低感染劑量。在實際生產(chǎn)中，豬只和飼料接觸頻率更高，多次采食ASFV 污染的飼料，將呈倍數(shù)放大豬群感染的風(fēng)險。

3 飼料中ASFV 的物理緩解方法

對飼料成分及全價料進(jìn)行延長儲存和熱處理，在降低PEDV 等豬冠狀病毒的傳染性上具有實證效果。延長儲存主要是對從高風(fēng)險國家和地區(qū)進(jìn)口或采購原料后的儲存干預(yù)，是一種旨在使ASFV 在原料加入全價飼料之前完全衰變的策略。依據(jù)ASFV 在飼料及原料中的半衰期，計算出ASFV 在跨洋運(yùn)輸條件下感染力降低99.99%所需要的時間，常規(guī)豆粕為127 d，有機(jī)豆粕和豆油餅為165 d，膽堿為158 d，全價料為185 d?；谠系娘L(fēng)險，加拿大食品監(jiān)督局對潛在ASFV 污染的植物性原料建議的存儲時間為10℃條件下不低于100 d或者20℃條件下放置20 d。由于野豬中存在ASFV造成農(nóng)田作物受到污染的潛在風(fēng)險，因此歐盟建議鮮草和谷物在喂食前要儲存30 d，使用墊料稻草前需儲存90 d。

另外，熱處理可明顯降低ASFV 在原料中的存活時間。Sindryakova 等報道，ASFV 在以大麥、小麥為主的配合飼料中自然消亡的時間，4～6℃的條件下需要40 d，但在22～25℃條件下只需要5 d。目前，對飼料中ASFV 滅活的高溫干預(yù)措施沒有明確的研究報告，更多地是參考飼料中高溫滅活PEDV 的方法。比如，我國養(yǎng)豬業(yè)實行制粒溫度85℃ 3 min 以上的措施；加拿大食品監(jiān)督局推薦的對飼料原料70℃加熱30 min 或85℃加熱5 min。

4 飼料中ASFV 的化學(xué)緩解方法

研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸、中鏈脂肪酸等對飼料中的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）以及其他病毒有很好的滅活功效。Trudeau 等評估了不同有機(jī)酸常溫下對飼料中PEDV 的滅活效果，結(jié)果表明0.4%艾維酸DA降解病毒的效率最高，只需0.81 d 就可以降低病毒一個滴度（log TCID）。0.4% 艾維酸DA 添加3 d 和7 d后，PEDV 的感染力分別下降了97.8%和99%。Lerner等研究發(fā)現(xiàn)，添加0.125%～1.0%的中鏈脂肪酸可降低PEDV 的活性。Dee 等使用冰塊污染模型，評估了15 種添加劑分別對PEDV、塞內(nèi)卡病毒A（SVA）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）污染飼料的緩解及仔豬生產(chǎn)性能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14 種添加劑均可有效滅活病毒，緩解臨床癥狀和提高生產(chǎn)成績，其中，0.5%艾維酸DA 顯著降低了病毒的臨床癥狀并提高日增重（＜0.05）。

在飼料中通過添加化學(xué)制劑來緩解ASFV 傳播風(fēng)險的嘗試源于添加劑對PEDV 的滅活效果。目前添加劑緩解飼料中ASFV 的研究報道較少。Niederwerder 等測定了中鏈脂肪酸（C6:C8:C10）和液體甲醛對模擬跨洋運(yùn)輸模型中的9 種支持ASFV-Georgia 2007 存活的植物性原料進(jìn)行了干預(yù)分析，結(jié)果表明，在30 d 的時間內(nèi)，0.33% 液體甲醛處理后所有的原料及全價料中的ASFV DNA 明顯下降，而1.0%中鏈脂肪酸處理后只有膽堿和全價料中的ASFV DNA 減少，而對豆粕類原料中的ASFV 無緩解作用。另外，Jackman 等評估了單月桂酸甘油酯（GML）和中鏈脂肪酸對飼料中ASFV參考毒株BA71V 的滅活效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2.0% GML 添加1 d 后可有效降低98% 的病毒感染力，但是低劑量（0.25%和0.5%）無作用，而中鏈脂肪酸（C8:C10:C12）處理不能降低ASFV 感染力。GML 和中鏈脂肪酸在測試時間內(nèi)均未降低ASFV DNA。然而，我國飼料法規(guī)禁止添加甲醛及甲醛制劑。

諾偉司國際對有機(jī)酸緩解飼料中ASFV 開展了一系列工作。2019 年，諾偉司中國與國內(nèi)研究所開展的聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加0.6% 艾維酸DA 可降低ASFV HLJ/18 株（國內(nèi)流行毒株）的病毒DNA 量和滴度（未發(fā)表數(shù)據(jù)），具有緩解飼料ASFV 傳播的作用。2020 年，Magtagnob等對艾維酸DA 抑制飼料中ASFV 開展了進(jìn)一步研究，在飼料中接種10HADASFV-Vietnam 2019 毒株（與我國HLJ/18 毒株高度同源），同時添加不同濃度的艾維酸DA 進(jìn)行干預(yù)，分別在添加后1、3、7 d 進(jìn)行病毒核酸DNA 和滴度的檢測。圖1 和圖2 表明，與對照組相比，0.2% 和0.5% 艾維酸DA 在干預(yù)后的1、3、7 d 均可顯著降低ASFV 核酸DNA 和病毒滴度（＜0.05），尤其是0.5% 艾維酸DA 干預(yù)3 d，可顯著降低3.9 logs 病毒滴度（＜0.01），降低飼料中ASFV 99.99% 的感染力（圖2）。以上結(jié)果表明，飼料中添加艾維酸DA，可有效降低ASFV的核酸DNA 和滴度，降低飼料傳播ASFV 風(fēng)險。

圖1 艾維酸?DA 對飼料中ASFV 的核酸（DNA）的緩解效果[35]

圖2 艾維酸?DA 對飼料中ASFV 滴度的緩解效果[35]

有機(jī)酸、中鏈脂肪酸和甲醛等在抑制飼料中ASFV的實驗評估中得到了證實。這有可能與這些制劑能穿透或損壞ASFV 的脂質(zhì)囊膜有關(guān)。為有效地控制ASFV，增加飼料生物安全性，有必要進(jìn)一步開展這些添加劑滅活A(yù)SFV 的機(jī)理性研究。

5 總結(jié)

ASFV 可在飼料及多種原料中穩(wěn)定存活，可通過采食ASFV 污染的植物/動物性飼料傳播，對飼料進(jìn)行物理和化學(xué)處理可降低ASFV 傳播風(fēng)險。然而，大多數(shù)緩解方法不能從飼料中完全消除ASFV DNA，需要關(guān)注緩解后ASFV 的感染力是否降低。對飼料中ASFV 的相關(guān)研究有助于提升飼料生物安全防控體系。飼料生物安全是生物安全領(lǐng)域的一個較新的專業(yè)化領(lǐng)域，針對ASF疫情下的飼料生物安全，需要加強(qiáng)以下工作：首先，定期對所使用的飼料原料進(jìn)行風(fēng)險評估，不使用或減少動物源的成分；其次，依據(jù)原料來源國或地區(qū)的ASF 流行情況采取針對性應(yīng)對措施；再次，依據(jù)ASFV 在飼料成分中存在的風(fēng)險，適時采取物理和化學(xué)結(jié)合的措施來降低傳播風(fēng)險；最后，對飼料生產(chǎn)、加工及運(yùn)輸環(huán)節(jié)實施有效的消毒和監(jiān)測。