山羊NR1D1 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

王逸群，高登科,2，趙泓淙,2，李 丹，馬白榮，劉盼盼，孫樂桐，靳亞平,2，陳華濤,2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室，陜西楊凌 712100）

為適應(yīng)因地球自轉(zhuǎn)而形成的光暗循環(huán)，生物體從分子、細(xì)胞到組織、器官水平的生命活動均存在一定的周期性變化，稱為生物節(jié)律。生物鐘是生物體產(chǎn)生和調(diào)節(jié)生物節(jié)律的內(nèi)源性振蕩器，以24 h 為周期節(jié)律性調(diào)控機(jī)體大量生理功能。生物鐘廣泛存在于從原核生物到哺乳動物的生物體內(nèi)。生物鐘與新陳代謝、細(xì)胞生長增殖等眾多生理功能的調(diào)控密切相關(guān)。當(dāng)生物鐘受到環(huán)境、基因突變等因素干擾時，機(jī)體的生理過程會發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致多種疾病發(fā)生。哺乳動物生物鐘系統(tǒng)具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，由存在于下丘腦視交叉上核（Suprachiasmatic Nucleus，SCN）的中樞生物鐘和遍布于機(jī)體各個器官與組織的外周生物鐘構(gòu)成。中樞生物鐘SCN 整合光線明暗變化的周期性信號，并通過神經(jīng)和體液途徑調(diào)節(jié)外周生物鐘的節(jié)律性振蕩，從而維持機(jī)體的生理穩(wěn)態(tài)。哺乳動物主要的生物鐘基因包括：晝夜運動輸出周期蛋白基因（Circadian Locomotor Output Cycles Kaput，）、腦肌類芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白1 基因（Brain and Muscle ARNT-like Protein 1，）、周期生物鐘蛋白基因（Periods，）、隱花色素生物鐘蛋白基因（Cryptochromes，）、D 位白蛋白啟動子結(jié)合蛋白基因（D Site Albumin Promoter Binding Protein，）、核受體亞家族1 D 組成員1 基因（Nuclear Receptor Subfamily 1 Group D Member 1，）、維甲酸相關(guān)孤兒受體A 基因（RAR Related Orphan Receptor A，）等，這些生物鐘基因在機(jī)體各個組織中通過轉(zhuǎn)錄翻譯構(gòu)成了多個相互關(guān)聯(lián)的正負(fù)反饋環(huán)路，并以此為基礎(chǔ)調(diào)控眾多鐘控基因的節(jié)律性表達(dá)，在機(jī)體晝夜節(jié)律性振蕩維持過程中發(fā)揮重要作用。

核受體NR1D1 又被稱為REV-ERB，是哺乳動物生物鐘系統(tǒng)的重要組分，其作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，參與調(diào)控機(jī)體多項生理功能。NR1D1 可與基因啟動子區(qū)的ROR 反應(yīng)元件（ROR Response Elements，RORE）結(jié)合，通過招募輔阻遏子核受體協(xié)同抑制因子1（Nuclear Receptor Corepressor 1，NCoR1）和組蛋白去乙?；?（Histone Deacetylase 3，HDAC3）來抑制核心生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄，NR1D1 還可與等多個生物鐘基因相互作用，維持生物鐘系統(tǒng)的晝夜節(jié)律性振蕩。除了作為生物鐘系統(tǒng)的核心組分外，NR1D1 還參與機(jī)體多個生理過程的調(diào)控。例如，參與線粒體呼吸和細(xì)胞氧化還原平衡的代謝物血紅素被證明是NR1D1 的內(nèi)源性配體。因此，NR1D1 可作為一種細(xì)胞代謝的傳感器，將生物鐘與代謝聯(lián)系起來。同時，NR1D1 還可通過抑制炎性因子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)生理周期等方式，參與調(diào)控機(jī)體免疫、生殖等多個生理過程。

山羊是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的反芻動物，如何調(diào)控山羊的生長繁殖進(jìn)程來提高該物種的生產(chǎn)性能一直是畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域的研究重點。近年來，小鼠的研究證據(jù)表明基因參與調(diào)控哺乳動物的生長繁殖，但目前仍未見關(guān)于山羊基因克隆及其生物學(xué)功能預(yù)測的報道。基因在山羊全身不同組織中的作用以及對山羊生理功能的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。因此，本研究旨在克隆山羊核受體基因的編碼序列（Coding Sequence，CDS）并構(gòu)建其真核表達(dá)載體，以期為后續(xù)研究山羊NR1D1 的生物學(xué)功能提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 關(guān)中奶山羊卵巢組織購自楊凌楊沛屠宰場。TRIzol、PrimerSTARGXL DNA Polymerase、Quick CutH I 均購自日本TaKaRa 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自AG 生物工程有限公司，SYBRPremix Ex Taq II 購自日本ToYoBo 公司，大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，ClonExpressII One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，HEK293T 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，胎牛血清、Opti-MEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司，DMEM 高糖培養(yǎng)基購自Hyclone 公司，TurboFect Transfection Reagent 購自美國ThermoFisher 公司，HRP 標(biāo)記的鼠抗-actin 抗體購自中國三箭公司，HRP 共軛羊抗兔抗體購自中國中杉金橋公司，ECL HRP 底物試劑盒購自北京迪寧生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中山羊基因（登錄號：XM_018065020.1）的CDS 區(qū)，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計PCR 擴(kuò)增引物。引物上、下游的5' 端分別添加了與pcDNA3.1-Puro-N-3HA載體H I 酶切位點互補配對的同源序列，引物序列為：F：5'-AGAGAATTCGATATCGGATCCATGACGAC CCTGGACTCTAACA-3'；R：5'-GGTCTCGAGGGTAC CGGATCCTCACTGGGCGTCCACCCGGAAG-3'（下劃線部分為H I 酶切位點）。引物由西安擎科生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.3 山羊卵巢組織總RNA 的提取及cDNA 的合成 采用Trizol 法提取山羊卵巢組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系10 μL：5×Prime Script RT Master Mix 2.0 μL、Total RNA 2.5 μL（500 ng）、ddHO 5.5 μL。反應(yīng)程序：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃保存。

1.4 山羊基因CDS 區(qū)PCR 擴(kuò)增 以cDNA 為模板，擴(kuò)增山羊基因帶有同源臂的CDS 區(qū)片段。PCR 反應(yīng)體系50 μL：cDNA 4 μL（50 ng/μL）、10 μmol/L 上下游引物各1 μL、2×Quick Taq HS Dye 25 μL，加ddHO 至50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min，98℃變性10 s、55℃退火15 s、72℃延伸115 s，循環(huán)35 次，72℃總延伸5 min。對PCR 陽性產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳和膠回收。

1.5 山羊基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 使用限制性內(nèi)切酶H I 對空載體pcDNA3.1-Puro-N-3HA進(jìn)行單酶切。將目的片段與線性化的真核表達(dá)載體進(jìn)行重組連接，反應(yīng)體系20 μL：線性化載體0.03 pmol、插入片段0.06 pmol、Exnase II 2 μL、5×CE II Buffer 4 μL、ddHO 加至20 μL，37℃條件下反應(yīng)15 min。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞，涂板培養(yǎng)后挑取單克隆菌落搖床培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進(jìn)行單酶切和PCR 鑒定，結(jié)果符合預(yù)期后，將重組質(zhì)粒送至西安擎科生物有限公司測序，將測序正確的重組載體命名為pcDNA3.1-3HA-g。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇HEK293T 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，將狀態(tài)良好的細(xì)胞分別傳至1 個6 孔板和6 個60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將6 孔板和60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中的細(xì)胞同時各分為2 組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-3HA-g組（實驗組）和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1-Puro-N-3HA 組（對照組）。待細(xì)胞密度達(dá)60% 左右時，轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒和重組質(zhì)粒至HEK293T 細(xì)胞。6 孔板中，實驗組和對照組各轉(zhuǎn)染3 孔，轉(zhuǎn)染24 h 后收樣，用于檢測山羊基因在mRNA 水平的表達(dá)；6 個60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，實驗組和對照組各轉(zhuǎn)染3 皿，轉(zhuǎn)染48 h 后收樣，用于檢測山羊基因在蛋白水平的表達(dá)。

1.7 實時熒光定量PCR 檢測基因在mRNA 水平的表達(dá) 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中山羊和人基因的CDS 區(qū)，使用Primer Premier 5.0 設(shè)計能同時擴(kuò)增山羊和人基因CDS 區(qū)的實時熒光定量PCR（qPCR）引物，同時將人基因作為內(nèi)參基因，qPCR 引物信息見表1。提取實驗組及對照組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 進(jìn)行qPCR，檢測基因在mRNA 水平的表達(dá)。qPCR 反應(yīng)體系20 μL：cDNA 5 μL（5 ng/μL），Premix Ex Taq II 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddHO 補足體系。qPCR 反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 15 s，95.5℃ 5 s。使用CFX96 熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測，采用2相對定量法將Ct 值轉(zhuǎn)化為基因相對表達(dá)量。

表1 qPCR 引物序列

1.8 Western Blotting 檢測NR1D1 在蛋白水平的表達(dá)利用RIPA 裂解液提取實驗組和對照組細(xì)胞的蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度后加入適量上樣緩沖液，100℃沸水煮10 min。進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，利用10% 脫脂奶粉，室溫封閉2 h。加入兔抗HA 一抗工作液（1:5 000 稀釋），搖床上緩慢搖動室溫孵育2 h。使用預(yù)先配置好的TBST 洗滌液洗膜4 次，每次5 min。將PVDF 膜置于HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液（1:10 000 稀釋）中，搖床上室溫孵育2 h，洗膜4 次。將膜置于ECL 發(fā)光液中，作用2 min，于暗室中進(jìn)行曝光顯影。將曝光后的膜取出，洗膜4 次。加入適量的抗體洗脫液，室溫孵育15 min 左右后棄去洗脫液，洗膜3 次。之后移至含有10%脫脂奶粉的平皿中，室溫封閉2 h，洗膜4 次。將PVDF 膜置于HRP 標(biāo)記的-actin 抗體工作液（1:5 000稀釋）中，于搖床上室溫孵育2 h，之后洗膜4 次。最后將膜置于ECL 發(fā)光液中，作用2 min 后，于暗室中進(jìn)行曝光顯影。

1.9 生物信息學(xué)分析 利用MegAlign、MEGA6、PyMOL與SingalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalp）、TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、ProtParam（https：//web.expay.org/protp aram/）、ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）、SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）等生物信息學(xué)軟件，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊及其他多個物種的基因序列信息，進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；同時對山羊NR1D1 蛋白的理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、二級和三級結(jié)構(gòu)等生物學(xué)信息進(jìn)行預(yù)測分析。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 通過GraphPad Prism 6.0 軟件使用檢驗對實驗組及對照組基因的mRNA 相對表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，＜0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 山羊基因CDS 區(qū)的成功克隆 對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得與預(yù)期大小（1 893 bp，基因CDS區(qū)長度1 851 bp，同源臂42 bp）一致的特異性條帶（圖1），擴(kuò)增片段單一、明亮，且無非特異性擴(kuò)增，表明成功獲得山羊基因的CDS 區(qū)片段。

圖1 山羊NR1D1 基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定

2.2 重組載體pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 的成功構(gòu)建 對重組載體和空載體進(jìn)行單酶切，凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示，重組載體pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 單酶切后獲得大小約為5 211 bp 和1 851 bp 的2 個條帶，與空載體單酶切產(chǎn)物條帶和NR1D1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物條帶大小一致。對重組載體pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 進(jìn)行測序分析，其中基因CDS 區(qū)的測序結(jié)果與NCBI 庫中預(yù)測序列（XM_018065020.1）完全一致。上述結(jié)果表明，pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 pcDNA3.1-3HA-gNR1D1 真核表達(dá)載體酶切鑒定

2.3 qPCR 檢測基因在mRNA 水平的表達(dá) 提取實驗組和對照組HEK293T 細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。qPCR 結(jié)果如圖3A 顯示，與對照組相比，pcDNA3.1-3HA-g轉(zhuǎn)染組的mRNA 表達(dá)量升高約680 倍（＜0.001）。上述結(jié)果表明，pcDNA3.1-3HA-g轉(zhuǎn)染組在mRNA 水平成功實現(xiàn)山羊基因的過表達(dá)。

2.4 Western Blotting 檢測基因在蛋白水平的表達(dá) 提取實驗組和對照組HEK293T 細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)Western Blotting 檢測，結(jié)果如圖3B 所示，用HA 抗體孵育后，pcDNA3.1-3HA-g轉(zhuǎn)染組在72 kDa 處出現(xiàn)1 條明顯的條帶，與預(yù)期大小相符，而對照組在目的蛋白位置無條帶。上述結(jié)果表明，pcDNA3.1-3HAg轉(zhuǎn)染組NR1D1 蛋白在HEK293T 細(xì)胞中成功過表達(dá)。

圖3 山羊NR1D1 基因在pcDNA3.1-3HA-gNR1D1轉(zhuǎn)染組的表達(dá)效率

2.5 生物信息學(xué)分析

2.5.1 基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 利用MegAlign及MEGA6 將山羊基因CDS 區(qū)與其他物種的基因CDS 區(qū)進(jìn)行同源性比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。同源性比對結(jié)果如圖4 所示，山羊基因CDS 區(qū)與綿羊相似性最高（99.6%），其次為牛（98.2%）和豬（95.1%），與斑馬魚相似性最低（65.1%）。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，山羊基因與綿羊處于同一小分支，親緣關(guān)系最近，而與斑馬魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖5）。

圖4 NR1D1 基因CDS 區(qū)同源性比對

圖5 NR1D1 基因CDS 區(qū)遺傳進(jìn)化樹分析

2.5.2 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測 應(yīng)用ProtParam 在線軟件對山羊NR1D1 蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，NR1D1 蛋白的氨基酸組成如表2 所示，山羊NR1D1 蛋白分子式為CHNOS，共包含氨基酸616 個，原子總數(shù)為9 268，分子量約為67.012 ku，理論等電點為8.75，總平均親水性（GRAVY）為-0.496。不穩(wěn)定系數(shù)64.82，為不穩(wěn)定蛋白。應(yīng)用ProtScale 在線軟件對山羊NR1D1 蛋白氨基酸序列的親水性進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，最低分值（-2.822）位于第214 位氨基酸，表明親水性最強(qiáng)；最高分值（2.633）位于第544 位氨基酸，表明疏水性最強(qiáng)；且該蛋白大部分位于親水區(qū)域，故山羊NR1D1 蛋白為親水性蛋白（圖6）。

表2 山羊NR1D1 蛋白氨基酸組成

圖6 山羊NR1D1 蛋白親水性預(yù)測

2.5.3 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預(yù)測 應(yīng)用TMHMM Server v.2.0 對山羊NR1D1 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，山羊NR1D1 蛋白不含跨膜區(qū)。應(yīng)用SingalP 5.0對山羊NR1D1 蛋白進(jìn)行信號肽預(yù)測，結(jié)果顯示，山羊NR1D1 蛋白不含信號肽。

2.5.4 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 應(yīng)用SOPMA 在線軟件對山羊NR1D1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，山羊NR1D1 蛋白中-螺旋、延伸鏈、-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲所占比例分別為26.62%、12.50%、6.17% 和54.71%，說明山羊NR1D1蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主（圖7）。

圖7 山羊NR1D1 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5.5 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及比對 應(yīng)用在線軟件SWISSMODEL 預(yù)測山羊、小鼠和人NR1D1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖8 所示。使用PyMOL 對預(yù)測模型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，山羊與小鼠NR1D1 蛋白模型間原子位置均方根偏差（Root-Mean-Square Deviation，RMSD）為0.538，與人NR1D1 蛋白模型的RMSD 為0.727，說明山羊NR1D1 蛋白與小鼠和人之間的差異較小。

圖8 山羊、小鼠、人NR1D1 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及比較

3 討 論

生物鐘存在于哺乳動物幾乎所有的細(xì)胞、組織和器官中，協(xié)同調(diào)控哺乳動物的大量行為、生理過程與晝夜明暗循環(huán)相適應(yīng)。隨著人們對生物鐘系統(tǒng)研究和理解的不斷深入，生物鐘在哺乳動物各項生理過程中發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。生物鐘紊亂可能引發(fā)嚴(yán)重的睡眠障礙、肥胖、心血管疾病、代謝疾病、免疫功能障礙及癌癥等多種疾病，且有證據(jù)表明，、等生物鐘基因的缺失會嚴(yán)重影響小鼠的生殖能力。

核受體基因于1989 年被發(fā)現(xiàn)定位于編碼甲狀腺激素受體基因的反向鏈。的轉(zhuǎn)錄受CLOCK/BMAL1 所形成異源二聚體的驅(qū)動而激活，隨后NR1D1 蛋白又反過來與啟動子中順式作用元件RORE 結(jié)合來抑制基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而實現(xiàn)對下游生物鐘基因（）、（）和大量鐘控基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在機(jī)體的生物鐘系統(tǒng)以及內(nèi)分泌、生殖、免疫等多個系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，人們更多地關(guān)注到基因與包括心血管疾病、炎癥、代謝紊亂和癌癥在內(nèi)的多種疾病存在密切的聯(lián)系。許多研究證據(jù)表明，在多種疾病的發(fā)展過程中，的節(jié)律性表達(dá)發(fā)生紊亂?；蛉笔∈髸円构?jié)律紊亂，代謝平衡破壞，且表現(xiàn)出行為異常，包括多動癥及學(xué)習(xí)記憶能力受損等。還有研究發(fā)現(xiàn)，NR1D1 激動劑SR9009 和SR9011 給藥會改變小鼠黑暗條件下的晝夜節(jié)律行為和核心生物鐘基因（等）的節(jié)律性表達(dá)，且能夠增加能量消耗并降低脂肪含量、血漿甘油三酯和膽固醇水平，提示通過激動劑調(diào)控NR1D1 的活性可能有助于治療睡眠障礙和代謝疾病。同時，SR9009 和SR9011 對自噬和脂肪從頭合成的調(diào)控在引發(fā)惡性細(xì)胞凋亡的反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，說明對生物鐘系統(tǒng)的藥理學(xué)調(diào)節(jié)可能是對抗癌癥的有效治療策略。上述證據(jù)表明，NR1D1 作為一種重要的生物鐘系統(tǒng)組分，在機(jī)體的生理穩(wěn)態(tài)調(diào)控中起著重要作用，探究它的生理功能和作用機(jī)制，或可為多種疾病的治療提供新思路和靶點。

作為一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的反芻動物，山羊在我國養(yǎng)殖歷史久、分布范圍廣。已有模式動物的研究證據(jù)表明，哺乳動物生物鐘系統(tǒng)在調(diào)控生殖與代謝等生理過程中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于生物鐘的研究大多集中于大鼠、小鼠等嚙齒類動物，關(guān)于山羊生物鐘的研究則相對較少。如能進(jìn)一步深入探究生物鐘系統(tǒng)在山羊繁殖與代謝過程中所發(fā)揮的具體作用及其調(diào)控機(jī)制，可以更好地服務(wù)于生產(chǎn)實踐。Xiao 等研究發(fā)現(xiàn)生物鐘基因通過調(diào)節(jié)類固醇激素合成關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控山羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成，提供了生物鐘影響山羊生殖過程的證據(jù)。Zhang 等證實了山羊皮膚中存在生物鐘，且生物鐘系統(tǒng)可調(diào)節(jié)內(nèi)蒙古白絨山羊毛囊的生長周期。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，山羊生物鐘基因可能在調(diào)控山羊瘤胃上皮細(xì)胞增殖、短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運及脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮作用。上述證據(jù)表明，生物鐘基因在山羊生長繁殖的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，但目前仍未見有關(guān)生物鐘基因調(diào)控山羊各項生理過程的研究報道。山羊基因位于19 號染色體，包含8 個外顯子，CDS區(qū)全長1 851 bp，共編碼616 個氨基酸?；谇捌谘芯炕A(chǔ)，本研究成功克隆了山羊基因的CDS 區(qū)并構(gòu)建了真核表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T 細(xì)胞后，驗證了在mRNA 和蛋白水平的過表達(dá)。上述研究證據(jù)提示，山羊NR1D1 可能在反芻動物細(xì)胞晝夜節(jié)律性振蕩的維持和各項生理過程中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的試驗研究。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1-3HA-g真核表達(dá)載體，并在mRNA 和蛋白水平驗證了山羊基因在HEK293T 細(xì)胞的表達(dá)效率。同時，本研究對山羊基因及其蛋白進(jìn)行了深入的生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，山羊基因CDS 區(qū)與綿羊、牛等反芻動物有較高的相似性，山羊NR1D1 蛋白為不穩(wěn)定蛋白，不含跨膜區(qū)和信號肽，三級結(jié)構(gòu)與人和小鼠NR1D1 蛋白較為相似。本研究為后續(xù)進(jìn)一步探究山羊基因的生物學(xué)功能提供了前期基礎(chǔ)。