• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    牦牛附睪DPP4 基因CDS 區(qū)的克隆和表達(dá)研究

    2022-10-12 13:17:54王紅梅楊劉玥玲吳逸韜楊獻(xiàn)康鄭旭昕趙旺生西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院四川綿陽(yáng)621010
    中國(guó)畜牧雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:登錄號(hào)附睪牦牛

    王紅梅,楊劉玥玲,吳逸韜,楊獻(xiàn)康,鄭旭昕,趙旺生(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽(yáng) 621010)

    二肽基肽酶-4(Dipeptidyl Peptidase-4,DPP4)又稱腺苷脫氨酶復(fù)合蛋白26,是一種細(xì)胞表面蛋白酶,屬于脯氨酰寡肽酶家族,DPP4 蛋白可選擇性切割脯氨酸位于倒數(shù)第二位的肽中的氮末端二肽從而降解信號(hào)肽,發(fā)揮自身生物活性。同時(shí),DPP4 與腺苷脫氨酶ADA 相互作用作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控因子從而控制細(xì)胞遷移和增殖。在體內(nèi)主要在組織內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)。隨著年齡的增長(zhǎng),男性生殖功能出現(xiàn)總體下降,主要表現(xiàn)為精子數(shù)量的減少和體內(nèi)雄激素的降低,作為精子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體,睪丸管周細(xì)胞(HTPCS)在雄性生殖過(guò)程中發(fā)揮突出作用,在探究睪丸功能衰退的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)睪丸管周細(xì)胞發(fā)生特異性改變,在出現(xiàn)線粒體網(wǎng)絡(luò)減少、溶酶體數(shù)量增加等蛋白質(zhì)紊亂現(xiàn)象的同時(shí)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子()和水平升高。因此推測(cè)可能在雄性生殖過(guò)程中發(fā)揮作用。

    三維結(jié)構(gòu)顯示,DPP4 是二聚體蛋白,每個(gè)單體的亞基由一個(gè)/水解酶結(jié)構(gòu)域和八葉螺旋槳結(jié)構(gòu)域組成,在自然條件下,-螺旋槳結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域共同參與DPP4 單體締合過(guò)程形成同型二聚體,絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸形成催化三聯(lián)體的殘基,而水解酶結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸對(duì)催化活性至關(guān)重要。DPP4 獨(dú)特的螺旋結(jié)構(gòu)可作為蛋白質(zhì)互相作用的支架,-螺旋槳有4~8 個(gè)葉片,每個(gè)葉片由包含30~50 個(gè)氨基酸的重復(fù)亞基組成,相鄰的螺旋槳葉片環(huán)可形成配體與抗體的接觸位點(diǎn)。DPP4 作為廣泛表達(dá)的酶,通過(guò)錨定的跨膜分子和可溶性循環(huán)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,膜相關(guān)和可溶性DPP4(sDPP4)都具有催化活性,精液和腎臟是可溶性DPP4(sDPP4)的天然來(lái)源。目前,有關(guān)基因在牦牛附睪組織中的表達(dá)未見(jiàn)詳細(xì)研究,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆獲得牦?;虻腃DS 區(qū),利用熒光定量檢測(cè)其在牦牛附睪組織不同部位的表達(dá)并對(duì)其蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,旨在為研究DPP4 在牦牛附睪上皮細(xì)胞中的功能提供基本數(shù)據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 睪丸分離 實(shí)驗(yàn)所用睪丸來(lái)源于四川阿壩紅原,所用睪丸經(jīng)過(guò)Hanks 溶液漂洗3 次后分離附睪和睪丸,附睪組織分為附睪頭、附睪體、附睪尾3 部分,分離后立即放置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2 試劑及器材 TRIzolplus總RNA 提取試劑由Gen enode 提供;Moloney Murine Leukemia Virus 逆轉(zhuǎn)錄酶及2X SG Fast qPCR Master Mix 由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。QUAWELL 超微量紫外分光光度計(jì)(UV-5500PC)購(gòu)自艾本德(上海)國(guó)際貿(mào)易有限公司,熒光定量PCR 儀(T100 Thermal Cycler)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

    1.3 牦牛附睪總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 Trizol 試劑提取附睪頭、附睪體、附睪尾總RNA,QUAWELL 超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度。RNA 反轉(zhuǎn)錄,步驟一:基因組DNA 去除,反應(yīng)體系(10 μL):5×gDNA Buffer 2.0 μL,總RNA 2.0 μL,RNase-Free ddHO 6.0 μL。反應(yīng)過(guò)程42℃,3 min。步驟二:反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)體系(10 μL):10 × King RT Buffer 2.0 μL,F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1.0 μL,F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2.0 μL,RNase-Free ddHO 5.0 μL。將混合液加入到步驟一的反應(yīng)液中,混勻后,42℃孵育15 min,95℃孵育3 min,產(chǎn)物于-20℃冰箱保存。

    1.4 目的基因克隆 以牦牛附睪組織反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增體系(20.0 μL):DNA 聚合酶10.0 μL,雙蒸水7.0 μL,上下游特異性引物各1.0 μL(10 μmol/L)混勻,附睪頭、體、尾的cDNA 各添加1.0 μL。反應(yīng)過(guò)程:預(yù)變性94℃4 min;94℃30 s,60℃30 s,72℃60 s;以上過(guò)程循環(huán)40 次,后經(jīng)72℃2 min 的延伸。將產(chǎn)物電泳檢測(cè)后進(jìn)行DNA純化并將目的片段和載體連接、進(jìn)行轉(zhuǎn)化及鑒定后,經(jīng)成都擎科梓熙生物公司測(cè)序。

    1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)體系(10.0 μL):2x SG Fast qPCR Master Mix 5.0 μL,取上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL 混勻,PCR-grade water 3.7 μL,模板DNA 0.5 μL,以每樣3 個(gè)重復(fù)為對(duì)照,反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃3 min,95℃2 s,60℃25 s;以上過(guò)程循環(huán)40 次。定量結(jié)果利用SPSS19.0 軟件分析。

    1.6 DPP4 蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析 BioXM 2.6 軟件分析牦牛的核苷酸和氨基酸序列;在線軟件EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)DPP4進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析,NCBI 的BLAST 比對(duì)其氨基酸同源性,并使用MEGA6.0 軟件對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行構(gòu)建,NeTPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/ser vices/NetPhos/)預(yù)測(cè)牦牛DPP4 蛋白磷酸化位點(diǎn),TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)DPP4 蛋白跨膜區(qū),其他相關(guān)生物學(xué)預(yù)測(cè)方法同之前的研究。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 目的基因和內(nèi)參基因的引物 參考NCBI 中公布的牦?;騧RNA 序列(登錄號(hào):XM_005897282.2)以及內(nèi)參基因(登錄號(hào):NM_001037471.2),利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。引物由北京擎科生物科技有限公司合成,具體信息見(jiàn)表1。

    表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物

    2.2 牦?;蚩寺‘a(chǎn)物 克隆結(jié)果顯示,獲得牦牛附睪序列2 519 bp。CDS 區(qū)分析發(fā)現(xiàn),基因CDS 長(zhǎng)度為2 298 bp,共編碼765 個(gè)氨基酸,起始密碼子為ATG,終止密碼子為T(mén)AG(圖1)。

    圖1 牦牛DPP4 基因的堿基和氨基酸序列

    2.3 牦牛DPP4 蛋白質(zhì)的理化信息 DPP4 氨基酸分子式為CHNOS,分子量為88.37 ku,包含765 個(gè)氨基酸,其中含量最高是絲氨酸,占總氨基酸數(shù)的8.8%;其次是亮氨酸,占總氨基酸數(shù)的7.7%;酪氨酸,占氨基酸總數(shù)的7.1%;半胱氨酸含量最低,占氨基酸總數(shù)的1.4%。負(fù)電荷殘基(Asp+glu)和正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)分別為84 和71;等電點(diǎn)5.92,總親水系數(shù)-0.39,脂肪系數(shù)為78.99,不穩(wěn)定系數(shù)為45.38,由此可將DPP4 蛋白歸為帶負(fù)電的不穩(wěn)定蛋白。

    2.4 牦?;虻奈锓N同源性分析 通過(guò)BLAST對(duì)基因同其他物種進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)牦?;蚝塑账嵝蛄信c綿羊(登錄號(hào):XM_004004660.5)、山羊(登錄號(hào):XM_005676046.3)、野豬(登錄號(hào):NM_214257.1)、獼猴(登錄號(hào):XM_011744180.2)、黑猩猩(登錄號(hào):XM_009443585.3)的同源性分別是98.78%、98.61%、92.12%、90.17%、90.13%。MEGA 11.0 構(gòu)建以上物種的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),可看出牦牛與綿羊、山羊親緣關(guān)系較近(圖2),符合物種進(jìn)化規(guī)律。

    圖2 DPP4 的進(jìn)化樹(shù)

    2.5 牦牛DPP4 蛋白結(jié)構(gòu) 牦牛DPP4 蛋白存在102 個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中包括50 個(gè)絲氨酸位點(diǎn),27 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn),25 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,共765 個(gè)氨基酸組成DPP4 蛋白,其中18.17%(139 個(gè))處于-螺旋區(qū);6.14%(47 個(gè))處于-轉(zhuǎn)角;30.46%(233個(gè))位于延伸鏈;45.23%(346 個(gè))氨基酸處于無(wú)規(guī)則狀態(tài)。親疏水性分析顯示(圖3),DPP4 蛋白在第24個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在最大值2.956,此位點(diǎn)疏水性最強(qiáng);第179 個(gè)氨基酸位點(diǎn)上存在最小值-2.589,此位點(diǎn)氨基酸親水性最強(qiáng)。從蛋白整體結(jié)構(gòu)看,親水性氨基酸均勻分布在整個(gè)肽鏈中未見(jiàn)明顯疏水區(qū),可將DPP4 整體視為親水性蛋白,這與其理化性質(zhì)預(yù)測(cè)相符。在線網(wǎng)站TMHMM 2.0 分析DPP4 蛋白的跨膜區(qū),結(jié)果顯示牦牛DPP4 蛋白的1~6 位氨基酸位于細(xì)胞膜內(nèi),在7~29 位氨基酸之間形成跨膜螺旋區(qū)(圖4);信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果顯示DPP4 蛋白不存在信號(hào)肽(圖5),SoftBerry 預(yù)測(cè)牦牛DPP4 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜上。

    圖3 牦牛DPP4 蛋白親疏水性預(yù)測(cè)圖

    圖4 牦牛DPP4 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

    圖5 牦牛DPP4 蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖

    2.6 牦?;蛟诟讲G不同區(qū)域的表達(dá) 對(duì)牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾的cDNA 進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè),基因在附睪頭部表達(dá)量低于其在附睪體部和附睪尾部的表達(dá)(<0.01)(圖6)。

    圖6 DPP4 基因在牦牛附睪不同部位的相對(duì)表達(dá)情況

    3 討 論

    DPP4 蛋白是一種多功能II 型細(xì)胞表面糖蛋白,其功能可以根據(jù)它們的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外定位、細(xì)胞類型、寡聚或聚合狀態(tài)以及配體、輔因子或產(chǎn)物的濃度發(fā)生變化。抑制劑通過(guò)降低內(nèi)源性腸促胰島素失活,進(jìn)而刺激胰島素的釋放,調(diào)節(jié)空腹血糖、餐后血糖和糖化血紅蛋白HbA1c 水平,被廣泛用于治療糖尿病。然而,在糖尿病男性病例研究中發(fā)現(xiàn)西格列汀對(duì)精子參數(shù)和睪酮水平存在不良影響。患者使用西格列汀后,在有效控制血糖的同時(shí)出現(xiàn)精子質(zhì)量和精子數(shù)量明顯下降,甚至出現(xiàn)無(wú)精子狀況,而停用西格列汀三個(gè)月后后精子質(zhì)量恢復(fù)至可受孕狀態(tài)。此外,二甲雙胍聯(lián)合抑制劑治療二型糖尿病時(shí)發(fā)現(xiàn),與單一二甲雙胍治療相比,抑制劑協(xié)同治療時(shí),患者M(jìn)DA、LHP水平顯著降低,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)水平顯著升高,證實(shí)抑制劑可以明顯改善患者氧化應(yīng)激情況。GSH-Px 作為機(jī)體抗氧化應(yīng)激的重要指標(biāo),可保護(hù)精子在附睪運(yùn)輸和尾腔儲(chǔ)存過(guò)程中免受過(guò)氧化物的不利影響,研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶家族成員在牦牛附睪不同部位表達(dá)以附睪頭表達(dá)量顯著高于附睪體和附睪尾,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反,推測(cè)可能與一同參與精子氧化應(yīng)激過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)克隆獲得牦牛系列長(zhǎng)2 519 bp,其中CDS區(qū)長(zhǎng)2 298 bp,編碼765 個(gè)氨基酸。DPP4 蛋白是不穩(wěn)定帶負(fù)電的親水蛋白。研究發(fā)現(xiàn),其蛋白磷酸化位點(diǎn)有102 個(gè),蛋白結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲和-螺旋為主,在此基礎(chǔ)上延伸。熒光定量結(jié)果顯示,在附睪頭中低表達(dá),在附睪體和附睪尾高表達(dá),與雄牛生殖組織的研究相符。目前有關(guān)對(duì)精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮何種作用仍待深入研究,根據(jù)現(xiàn)有研究,使用抑制劑后對(duì)雄性精子帶來(lái)的不利影響得到驗(yàn)證,可推測(cè)在精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮一定作用,可為后續(xù)研究提供一定思路。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)成功克隆牦?;?,基因在附睪頭部的表達(dá)顯著高于其在附睪體和附睪尾的表達(dá)。對(duì)牦牛DPP4 蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),DPP4 蛋白為不穩(wěn)定的帶負(fù)電的親水蛋白,在牦牛生殖過(guò)程中具體發(fā)揮何種作用有待進(jìn)一步研究,本研究可為進(jìn)一步研究基因在牦牛附睪上皮細(xì)胞中的功能提供一定基礎(chǔ)資料。

    猜你喜歡
    登錄號(hào)附睪牦牛
    美仁大草原的牦牛(外一章)
    基于DNA條形碼進(jìn)行金花茶組種間鑒別
    種子(2021年2期)2021-03-31 09:23:32
    跟著牦牛去巡山
    含氟新農(nóng)藥的研究進(jìn)展
    浙江化工(2019年5期)2019-06-04 08:33:34
    小反芻獸疫病毒F基因的序列分析
    電子版館藏?cái)?shù)據(jù)回溯中的交叉、重疊、阻滯問(wèn)題處理
    目前牦??谔阋叩脑\斷與防治
    高頻超聲探查用于診斷附睪病變男性不育的價(jià)值探討
    人附睪蛋白4(HE4)在乳腺癌診斷中的價(jià)值
    高頻超聲對(duì)附睪結(jié)核的臨床診斷價(jià)值探討
    日韩欧美精品免费久久| 高清不卡的av网站| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人91sexporn| 久热久热在线精品观看| 午夜av观看不卡| 成人二区视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 在线 av 中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品国产av成人精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 999久久久国产精品视频| 亚洲天堂av无毛| 亚洲成人一二三区av| 老鸭窝网址在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 黄片播放在线免费| 在线精品无人区一区二区三| 综合色丁香网| 岛国毛片在线播放| 热re99久久国产66热| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久热在线av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜免费鲁丝| 另类亚洲欧美激情| 国产一区二区 视频在线| 国产探花极品一区二区| 天美传媒精品一区二区| 在线天堂中文资源库| 热re99久久国产66热| 欧美xxⅹ黑人| 日韩 亚洲 欧美在线| a级毛片在线看网站| 亚洲成人一二三区av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产精品熟女久久久久浪| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 街头女战士在线观看网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 少妇人妻 视频| 少妇精品久久久久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品国产av蜜桃| 国产深夜福利视频在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 免费观看性生交大片5| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久99精品国语久久久| 一级爰片在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 看免费成人av毛片| 老司机影院成人| 一区在线观看完整版| 丁香六月天网| 国产人伦9x9x在线观看 | 一级毛片 在线播放| 两个人免费观看高清视频| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲综合色网址| av福利片在线| a级毛片在线看网站| 大话2 男鬼变身卡| 中文字幕制服av| 国产激情久久老熟女| 女性生殖器流出的白浆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 久久韩国三级中文字幕| 精品午夜福利在线看| 高清视频免费观看一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 美女视频免费永久观看网站| 精品久久蜜臀av无| 高清视频免费观看一区二区| 不卡av一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 在线天堂中文资源库| 九色亚洲精品在线播放| 精品福利永久在线观看| 男人舔女人的私密视频| av天堂久久9| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久人人人人人| 多毛熟女@视频| 亚洲久久久国产精品| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久ye,这里只有精品| 波野结衣二区三区在线| 亚洲五月色婷婷综合| 女人精品久久久久毛片| 深夜精品福利| 丝袜脚勾引网站| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产精品999| 国产片特级美女逼逼视频| 99热国产这里只有精品6| 人妻 亚洲 视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 中文字幕人妻熟女乱码| 另类亚洲欧美激情| 在线 av 中文字幕| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 免费黄色在线免费观看| 国产97色在线日韩免费| 久久久久精品人妻al黑| 一级黄片播放器| 亚洲综合色网址| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 精品久久久精品久久久| 人人妻人人澡人人看| 午夜福利,免费看| 9热在线视频观看99| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧美成人精品一区二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 2022亚洲国产成人精品| 国产免费又黄又爽又色| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av福利片在线| 国产探花极品一区二区| 青春草国产在线视频| 伦理电影免费视频| 欧美精品一区二区大全| 欧美av亚洲av综合av国产av | 中国三级夫妇交换| av有码第一页| 999精品在线视频| 国产人伦9x9x在线观看 | 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产免费又黄又爽又色| av不卡在线播放| 少妇的丰满在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久久精品免费免费高清| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品二区激情视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 亚洲国产成人一精品久久久| 性色av一级| 国精品久久久久久国模美| 少妇被粗大猛烈的视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 999精品在线视频| 国产1区2区3区精品| 亚洲欧洲国产日韩| 色网站视频免费| 国产日韩欧美在线精品| 曰老女人黄片| 夫妻午夜视频| 69精品国产乱码久久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 9色porny在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲国产看品久久| 国产成人免费观看mmmm| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久狼人影院| 国产精品二区激情视频| 熟女电影av网| av福利片在线| 91精品国产国语对白视频| 18禁动态无遮挡网站| 欧美人与善性xxx| 中文字幕人妻丝袜制服| 免费人妻精品一区二区三区视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 麻豆av在线久日| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 9色porny在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产在线视频一区二区| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 在线观看免费高清a一片| 一区二区三区激情视频| 美女午夜性视频免费| 国产成人精品一,二区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产片内射在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99久久人妻综合| 亚洲第一青青草原| 2022亚洲国产成人精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 美女福利国产在线| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av国产av综合av卡| √禁漫天堂资源中文www| av电影中文网址| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲久久久国产精品| 伊人亚洲综合成人网| 中国三级夫妇交换| 好男人视频免费观看在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 美女高潮到喷水免费观看| 国产黄色免费在线视频| 制服人妻中文乱码| 青春草国产在线视频| 深夜精品福利| 26uuu在线亚洲综合色| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av在线老鸭窝| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av福利片在线| 亚洲av综合色区一区| 叶爱在线成人免费视频播放| av在线播放精品| 久久婷婷青草| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 国产爽快片一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 2021少妇久久久久久久久久久| 人妻 亚洲 视频| 精品一区二区免费观看| 一级a爱视频在线免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 婷婷色麻豆天堂久久| 午夜91福利影院| av视频免费观看在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 街头女战士在线观看网站| 国产片特级美女逼逼视频| 90打野战视频偷拍视频| 久久青草综合色| 成年动漫av网址| 最新中文字幕久久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 美女大奶头黄色视频| 午夜日韩欧美国产| 国产一区二区三区综合在线观看| 一级片'在线观看视频| 如何舔出高潮| 视频在线观看一区二区三区| 老司机影院成人| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 一级片'在线观看视频| 国产在线一区二区三区精| 大香蕉久久成人网| 秋霞在线观看毛片| 边亲边吃奶的免费视频| 老司机影院成人| 老司机影院毛片| av国产精品久久久久影院| 精品人妻在线不人妻| 一区二区av电影网| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产黄频视频在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 精品午夜福利在线看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 91国产中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区国产| 久久99一区二区三区| 精品少妇内射三级| 国产免费现黄频在线看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲,欧美,日韩| 男女国产视频网站| 国产午夜精品一二区理论片| av网站在线播放免费| 国产乱人偷精品视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 男人爽女人下面视频在线观看| av有码第一页| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲中文av在线| 午夜免费鲁丝| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久久久久精品精品| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av | av国产精品久久久久影院| 久久久久网色| 亚洲成色77777| 久久97久久精品| 欧美+日韩+精品| 丰满乱子伦码专区| 18+在线观看网站| 亚洲av福利一区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久久国产电影| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲三区欧美一区| 2022亚洲国产成人精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲成色77777| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 蜜桃在线观看..| 欧美国产精品一级二级三级| 在线观看一区二区三区激情| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 激情视频va一区二区三区| 麻豆av在线久日| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产成人精品无人区| 2021少妇久久久久久久久久久| 看免费成人av毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 伦精品一区二区三区| www.精华液| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 日本av免费视频播放| 老司机亚洲免费影院| 免费观看av网站的网址| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 在线精品无人区一区二区三| 最近中文字幕高清免费大全6| 免费看不卡的av| 亚洲av福利一区| 一级爰片在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 中国国产av一级| 亚洲视频免费观看视频| 国产人伦9x9x在线观看 | 久久热在线av| 91精品三级在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 在线观看一区二区三区激情| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲 欧美一区二区三区| 99久久人妻综合| 日韩av不卡免费在线播放| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久热这里只有精品99| 国产国语露脸激情在线看| 丝袜脚勾引网站| 亚洲成色77777| 中国国产av一级| 精品亚洲成a人片在线观看| 大香蕉久久成人网| 高清欧美精品videossex| 十八禁网站网址无遮挡| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日韩一区二区三区影片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 免费av中文字幕在线| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品,欧美精品| 久久久久网色| 欧美最新免费一区二区三区| 国产综合精华液| 丝袜喷水一区| 只有这里有精品99| 春色校园在线视频观看| 欧美日本中文国产一区发布| 丰满迷人的少妇在线观看| 午夜福利,免费看| 我的亚洲天堂| 九草在线视频观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 色94色欧美一区二区| videossex国产| 亚洲人成77777在线视频| 咕卡用的链子| 久久人妻熟女aⅴ| 在线 av 中文字幕| freevideosex欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文欧美无线码| 欧美 日韩 精品 国产| 五月伊人婷婷丁香| 国产深夜福利视频在线观看| 久久久久视频综合| 久久婷婷青草| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲男人天堂网一区| 日本爱情动作片www.在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 午夜免费鲁丝| 亚洲人成77777在线视频| 春色校园在线视频观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 免费大片黄手机在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 久久久国产精品麻豆| 丝袜美足系列| 久久精品国产亚洲av高清一级| 中文字幕精品免费在线观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 在线 av 中文字幕| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲成人一二三区av| 99热国产这里只有精品6| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜久久久在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 亚洲欧美清纯卡通| 电影成人av| 久久久精品区二区三区| 精品国产一区二区久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线观看免费日韩欧美大片| 熟妇人妻不卡中文字幕| xxx大片免费视频| 少妇的逼水好多| 国产一区二区 视频在线| 十八禁高潮呻吟视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲伊人色综图| 欧美精品国产亚洲| 亚洲男人天堂网一区| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品av久久久久免费| 在现免费观看毛片| 成人手机av| 亚洲图色成人| 国产男人的电影天堂91| 蜜桃在线观看..| 高清不卡的av网站| 日本免费在线观看一区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲欧洲国产日韩| 美女中出高潮动态图| 国产高清国产精品国产三级| 黄色一级大片看看| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品国产三级专区第一集| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久狼人影院| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲精品美女久久av网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 97精品久久久久久久久久精品| 国产黄色免费在线视频| 自线自在国产av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 看免费av毛片| 天堂中文最新版在线下载| 99热全是精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 一个人免费看片子| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美国产精品一级二级三级| 大香蕉久久网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产日韩欧美视频二区| 精品久久久久久电影网| 少妇精品久久久久久久| 亚洲情色 制服丝袜| 90打野战视频偷拍视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 在线观看国产h片| 美女高潮到喷水免费观看| www日本在线高清视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 中文字幕制服av| 精品久久蜜臀av无| 亚洲第一青青草原| 黄色毛片三级朝国网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 久热久热在线精品观看| 在线观看三级黄色| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲人成电影观看| av线在线观看网站| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品国产国语对白av| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 18禁观看日本| 国产男女内射视频| 国产一区二区激情短视频 | 日韩人妻精品一区2区三区| 另类精品久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲综合精品二区| 成人手机av| tube8黄色片| 久久影院123| 精品国产露脸久久av麻豆| 麻豆乱淫一区二区| 国产97色在线日韩免费| 人妻一区二区av| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 中文欧美无线码| 欧美精品高潮呻吟av久久| 天堂8中文在线网| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 秋霞在线观看毛片| 日本vs欧美在线观看视频| 1024香蕉在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 中文天堂在线官网| 九九爱精品视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲精品自拍成人| 狂野欧美激情性bbbbbb| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品在线美女| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费观看a级毛片全部| 男人添女人高潮全过程视频| 国产1区2区3区精品| 制服丝袜香蕉在线| 欧美日韩精品网址| 麻豆av在线久日| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品一国产av| 午夜影院在线不卡| 国精品久久久久久国模美| 久久久久久久久久久久大奶| 成年av动漫网址| 国产男女内射视频| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中国三级夫妇交换| 成年人免费黄色播放视频| 97人妻天天添夜夜摸| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 日韩一区二区视频免费看| 丝袜美足系列| 国产精品偷伦视频观看了| 日本欧美视频一区| 亚洲色图综合在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 青春草亚洲视频在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一本色道久久久久久精品综合| 尾随美女入室| 五月天丁香电影| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产一区二区激情短视频 | 最黄视频免费看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲综合精品二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久欧美国产精品| 午夜老司机福利剧场| 一区在线观看完整版| 赤兔流量卡办理| 99久久精品国产国产毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 黄频高清免费视频| 18禁观看日本| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品av久久久久免费| 飞空精品影院首页| 男女国产视频网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美中文综合在线视频| 国产有黄有色有爽视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产激情久久老熟女| 香蕉丝袜av|