高效液相色譜法同時測定和營合劑中阿魏酸和丹酚酸B含量*

唐靜月，張文明，費倩倩，卞振華，袁曉航，胡敏敏

（江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214000）

和營合劑為無錫市中醫(yī)醫(yī)院研制的中藥復(fù)方制劑，由當(dāng)歸、丹參、白芍、女貞子、生地、桑葉、茯苓、合歡皮、柴胡9味中藥材組方。方中，當(dāng)歸、丹參通行血脈，活血化瘀；女貞子、白芍、桑葉、生地補益肝腎之陰，平抑肝陽；茯苓、合歡皮健脾寧心，安神解郁；柴胡升清達陽，并可引諸藥直達病所。諸藥合用，具有活血化瘀、和營退斑功效［1］，臨床主要用于治療面部色斑、夜寐不安等證?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)》JSZBZ20090058Z，僅有性狀和制劑通則檢查項目，未收載含量測定，且有關(guān)該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及主要成分的基礎(chǔ)研究少有報道。為進一步控制和營合劑的質(zhì)量，保證臨床用藥的有效性和安全性，本研究中建立了同時測定和營合劑中阿魏酸和丹酚酸B含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國Sartorius公司，精度為萬分之一）；KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號為B20007），丹酚酸B對照品（批號為B20261），均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%；和營合劑（醫(yī)院制劑，批號分別為20211025，20211026，20211027）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min時5%A～10%A，5～15 min時10%A～14%A，15～25 min時14%A～15%A，25～30 min時15%A～17%A，30～45 min時17%A～21%A，45～55 min時21%A～22%A，55～63 min時22%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：321 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取阿魏酸、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含阿魏酸22.74 μg、丹酚酸B 270.48 μg的混合對照品溶液。精密量取樣品3 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）10 min，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取不含當(dāng)歸和地黃、不含丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法分別制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：精密吸取2.2項下4種溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1。供試品溶液色譜中，阿魏酸和丹酚酸B色譜峰有效分離，峰形良好，對照品溶液色譜存在相應(yīng)色譜峰，且陰性對照品溶液對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖1.Ferulic acid 2.Salvianolic acid BA.Mixed reference solution B.Test solution C，D.Negative reference solution（lacking Angelicae Sinensis Radix and Rehmanniae Radix，lacking Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項下混合對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0 mL，分別置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容，按2.1項下色譜條件進樣測定，分別以阿魏酸和丹酚酸B溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，得阿魏酸和丹酚酸B的回歸方程分別為Y阿=36.552X阿+2.620（r=0.9999，n=6），Y丹=5.935X丹-119.655（r=0.9997，n=6）。結(jié)果表明，阿魏酸和丹酚酸B質(zhì)量濃度分別在2.27～22.74 μg/mL和27.05～270.48 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果阿魏酸和丹酚酸B峰面積的RSD分別為0.18%和0.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一批（批號為20211025）樣品，依法制備供試品溶液，分別于0，2，8，12，16，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果阿魏酸和丹酚酸B峰面積的RSD分別為1.76%和1.95%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為20211025）樣品6份，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果阿魏酸和丹酚酸B平均含量分別為7.87 μg/mL和193.38 μg/mL，RSD分別為2.27%和0.80%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為20211025）1.5 mL，共6份，分別置5 mL容量瓶中，加入阿魏酸和丹酚酸B對照品溶液適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算阿魏酸和丹酚酸B的加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為20211025，20211026，20211027）樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果每1 mL樣品中分別含阿魏酸7.84，7.72，7.75 μg，平均7.77 μg；丹酚酸B 196.41，192.95，190.16 μg，平均193.17 μg。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇

方中當(dāng)歸具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效［2］139，有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁、抗氧化、促進造血功能、調(diào)血脂、保肝強腎健體等藥理作用［3-5］，其主要化學(xué)成分有揮發(fā)油、有機酸、多糖類、黃酮類、氨基酸等［6］，阿魏酸是當(dāng)歸酚酸類代表性成分和指標(biāo)性成分；丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效［2］79，有改善微循環(huán)、抗心肌缺血、防治動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化、調(diào)血脂等多種藥理作用［7-9］，其主要化學(xué)成分有菲醌衍生物、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油、無機元素等［10-11］，其中菲醌衍生物與酚酸類化合物是丹參的主要活性成分，以脂溶性成分丹參酮類和水溶性成分丹酚酸類為代表。根據(jù)和營合劑中主要藥味的活性成分及藥理作用，并結(jié)合制劑工藝特點及實際情況，選擇阿魏酸和丹酚酸B作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。經(jīng)前期預(yù)試驗，進行單味藥制備與進樣，發(fā)現(xiàn)全方9味藥材中當(dāng)歸和地黃均含有阿魏酸，且地黃中阿魏酸含量不低，單獨制備的缺當(dāng)歸陰性對照品溶液色譜圖明顯可見阿魏酸色譜峰，為避免陰性出現(xiàn)干擾，故本研究中制備缺當(dāng)歸和地黃的陰性對照品溶液。

3.2 色譜條件選擇

考察等度洗脫和梯度洗脫2種模式發(fā)現(xiàn)，前者不能較好地分離極性差異大的物質(zhì)，而后者可使復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異較大的組分達到良好分離。分別考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液為流動相時色譜峰的分離效果，結(jié)果乙腈洗脫效果優(yōu)于甲醇；其中，加0.2%磷酸水溶液和0.2%甲酸水溶液均優(yōu)于純水體系，乙腈-0.2%磷酸水溶液體系獲取的色譜峰更全面，基線平穩(wěn)，阿魏酸和丹酚酸B與相鄰色譜峰分離效果較好，色譜峰峰形良好。故選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液（梯度洗脫）作為流動相系統(tǒng)。

采用二極管陣列檢測器做全波長掃描，阿魏酸和丹酚酸B最大吸收波長分別為321 nm和286 nm。2020年版《中國藥典（一部）》當(dāng)歸藥材含量測定項下，阿魏酸的檢測波長為316 nm。為了保證2種成分均有適宜的靈敏度和峰面積響應(yīng)值，同時記錄286，316，321，322，323 nm波長下的色譜峰。結(jié)果檢測波長為321 nm時，阿魏酸和丹酚酸B峰面積響應(yīng)值較大，靈敏度較高，與相鄰色譜峰分離效果較好。故選擇321 nm作為檢測波長。

考察不同柱溫（25，30，35℃）和不同流速（0.8，1.0 mL/min），以色譜峰峰形、分離度、色譜峰數(shù)目、信號響應(yīng)強弱為指標(biāo)。結(jié)果柱溫為30℃時，色譜峰峰形好、數(shù)目多，分離度良好，2種成分響應(yīng)值較大；流速為1.0 mL/min時2種成分與相鄰色譜峰分離效果好。綜合考慮，選擇柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min。

3.3 提取方法和溶劑選擇

曾考察超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為40 kHz）10，20，30 min的影響，結(jié)果超聲提取10 min時2種待測成分提取率較高。曾考察不同提取溶劑50%甲醇、70%甲醇、甲醇和70%乙醇，結(jié)果顯示，70%乙醇提取下的色譜峰較少、峰面積較?。徊煌w積分數(shù)甲醇提取的色譜峰信息均較全面，2種有效成分在以甲醇為提取溶劑時的提取率最高。故選擇甲醇作為提取溶劑。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法高效簡便、穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好，可為制劑的整體質(zhì)量控制及后期研究提供參考。