基于網(wǎng)絡藥理學—分子對接探討四逆散治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制

★ 鄭秋霞 陳艷紅 林遠茂 林曉濤 孫誠攻 張榮欣 姜楓（.廣西中醫(yī)藥大學 南寧 530000；.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 南寧 5300）

潰瘍性結(jié)腸炎( ulcerative colitis，UC)是一種影響結(jié)腸的慢性非特異性腸道炎性疾病，其患病率隨著社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展呈快速上升趨勢[1］。本病的病因目前尚未完全明確，一般認為與遺傳、免疫、感染和精神心理因素等有關[2］，病程長期反復，治療難度大[3］。近年來，中醫(yī)藥在潰瘍性結(jié)腸炎的治療方面做出了卓越的貢獻，可緩解西藥帶來的不良反應，降低UC復發(fā)率，提升治療安全性等作用。在中醫(yī)學中可將本病歸于“痢疾”“泄瀉”“腹痛”等范疇[2］?！秱摗吩疲骸吧訇幉　蚋怪型?，或泄利下重者，四逆散主之?！盵4］方中柴胡與白芍合用，疏肝解郁、養(yǎng)血條肝；枳實與白芍合用，理氣和血，甘草調(diào)和諸藥，多用于治療腹痛即瀉，食欲不振，脘腹?jié)M悶，善太息等肝脾氣機不調(diào)的一類潰瘍性結(jié)腸炎[5］。本文主要通過近年來較為熱門的網(wǎng)絡藥理學及分子對接技術，預測四逆散治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效靶點及作用機制，將有效靶點與君藥有效化合物進行分子對接，模擬靶點蛋白受體與化合物小分子結(jié)合情況，為進一步的實驗研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 四逆散有效化合物-靶點篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫TCMSP檢索四逆散全方四味中藥：柴胡、枳實、白芍、甘草，搜索框選擇“Herb name”，輸入中藥名，以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為標準進行篩選，得出每味中藥對應的活性成分名稱；搜索框選擇“Chemical name”，逐個輸入上一步所得活性成分名稱，得到活性成分對應靶點蛋白。

1.2 四逆散靶點-基因篩選

利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt標準化靶點蛋白名稱，條件選擇“Reviewed”和“Human”后導出數(shù)據(jù)，運用表格函數(shù)VLOOKUP匹配出靶點蛋白的基因靶點，對于函數(shù)匹配失敗且無法從UniProt數(shù)據(jù)庫檢索出結(jié)果的靶點蛋白，予舍去。

1.3 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡構建

對四逆散中四味中藥的活性化合物、基因靶點進行整理，去除重復的化合物、基因靶點，找出四味中藥之間的重復成分，建立包含中藥、化合物、靶點的網(wǎng)絡文件及其屬性文件，導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡關系圖。

1.4 UC相關基因的篩選及PPI網(wǎng)絡構建

利用人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards檢索疾病潰瘍性結(jié)腸炎相關基因，以“ulcerative colitis”為檢索詞，收集潰瘍性結(jié)腸炎相關基因，結(jié)合四逆散的基因靶點，利用生物信息學與進化基因組學繪制維恩圖，得出四逆散治療UC的相關作用靶點，并將作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫，研究物種設置為“Homo sapiens”,構建PPI蛋白網(wǎng)絡互作圖，以TSV格式導出網(wǎng)絡圖，輸入Cytoscape 3.6.0軟件，根據(jù)其Degree值對各個節(jié)點進行調(diào)節(jié)、著色。

1.5 GO分析及KEGG通路分析

將上一步驟維恩圖得出的交集靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，標識符設置為OFFICIAL GENE SYMBOL,物種設置為Homo sapiens,分別導出基因本體功能分析的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）以及KEGG通路富集分析，對BP、CC、MF分析結(jié)果中前十者進行柱狀圖繪制，對KEGG分析結(jié)果進行兩次MEDIAN函數(shù)運算后，再進行氣泡圖繪制，柱狀圖及氣泡圖繪制主要利用微生信數(shù)據(jù)庫；運用Cytoscape 3.6.0軟件，構建交集靶點-信號通路-生物功能網(wǎng)絡關系圖。

1.6 分子對接情況

選取PPI網(wǎng)絡圖中排名前6的靶點蛋白，利用STRING數(shù)據(jù)庫獲取靶點蛋白PBD編號，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫中檢索出蛋白結(jié)構，若該蛋白沒有編號則直接在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫檢索靶點名稱，選取分辨率較低蛋白結(jié)構，以PDB格式導出；利用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索君藥-柴胡化學成分的小分子結(jié)構，以MOL2格式導出；利用Autodock Tools 1.5.6軟件對小分子-蛋白進行分子對接，通過Pymol軟件對分子對接結(jié)果進行可視化分析，根據(jù)結(jié)合能（binding energy）對有效成分-靶點蛋白的對接效果進行評價，結(jié)合能小于0表示兩者可自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能小于-5 kcal/moL者，說明小分子與蛋白結(jié)合性良好[6］。

2 結(jié)果

2.1 四逆散有效化合物篩選情況

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，可檢索出柴胡涉及349種化學成分，枳實涉及65種化學成分，白芍涉及85種化學成分，甘草涉及280種化學成分，以口服生物利用度（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）為標準，柴胡可篩選出17種活性成分，枳實可篩選出22種活性成分，白芍可篩選出13種活性成分，甘草篩選出92種活性成分，刪除4味中藥之間重復活性成分、刪除無對應靶點蛋白的活性成分，結(jié)果共得出133種活性成分，156個靶點蛋白，表1隨機展示4味中藥部分活性成分基本信息。

表1 四逆散部分活性成分

2.2 中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡分析

利用UniProt數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白注釋成基因名，共得到153個基因靶點，導入Cytoscape 軟件構建中藥-化合物-靶點網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡中共有279個節(jié)點及2 356條邊，利用不同顏色及形狀區(qū)分中藥、活性成分等，網(wǎng)絡中每個節(jié)點發(fā)出的連線為其度值，度值越大表示該節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要性越大，圖中度值越高者顏色越深面積越大，反之顏色淺且小，其中Degree值較大的有PTGS2、CALM、ESR1、HSP90AB1、AR等。

2.3 四逆散治療UC的作用靶點分析

根據(jù)人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards可檢索出潰瘍性結(jié)腸炎相關基因靶點共1 111個，利用生物信息學與進化基因組學平臺，對1 111個UC靶點及153個四逆散靶點進行交集，繪制Venn圖，可得出四逆散治療UC的作用靶點65個。將作用靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫構建PPI蛋白網(wǎng)絡互作圖，圖中有65個節(jié)點、779條邊。其中，面積越大顏色越深表示Degree值越高，線條越粗表示節(jié)點與節(jié)點間作用強度大，排名靠前的關鍵靶點有TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、MAPK3等。

2.4 基因本體功能分析及KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對65個作用靶點進行GO功能富集分析，結(jié)果BP分析314條、CC分析43條、MF分析63條，其中生物過程分析靶點集中在RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控-DNA的模板、對藥物的反應、信號轉(zhuǎn)導等；細胞成分分析中靶點集中在細胞核、胞漿、細胞外空間、細胞質(zhì)、質(zhì)膜等；分子功能分析中靶點主要集中在蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合等，分別取BP、CC、MF分析中前十者繪制柱狀圖。見圖1。KEGG信號通路分析中靶點主要富集在癌癥的路徑、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路等，根據(jù)MEDIAN函數(shù)結(jié)果，取前28個通路繪制氣泡圖。見圖2。

圖1 GO分析柱狀圖

圖2 KEGG通路分析氣泡圖

2.5 靶點-通路-生物功能圖分析

將排名前28的信號通路、前10的生物過程及其富集的靶點導入Cytoscape軟件，構建靶點-生物過程-信號通路網(wǎng)絡。見圖3。該網(wǎng)絡共有101個節(jié)點，424條邊，墨綠色正八邊形代表28條信號通路，淺藍色正六邊形代表10個生物過程，淺粉色代表富集在信號通路、生物過程中的靶點，面積的大小、顏色的明暗變化代表其Degree值得高低。

圖3 靶點-生物功能-信號通路

2.6 分子對接情況

利用STRING數(shù)據(jù)庫及RCSB PDB數(shù)據(jù)庫檢索出6個關鍵靶點（TP53、IL6、VEGFA、TNF、JUN、MAPK3）的蛋白結(jié)構，分別為2k8f、4cni、1mkk、5uui、5t01、6ges，利用AutoDock軟件對6個關鍵靶點及柴胡的17種活性成分進行分子對接，見表2，表格中所有數(shù)值均小于0，說明君藥活性成分與關鍵靶點可以自發(fā)結(jié)合，而VEGFA、TNF與君藥活性成分對接后結(jié)合能普遍小于-5kcal/mol,可見VEGFA、TNF與君藥活性成分結(jié)合性好，能形成穩(wěn)定的結(jié)合；利用Pymol軟件對活性成分和關鍵靶點的對接結(jié)果進行可視化處理，主要選取每列結(jié)合性最佳者進行分析（在Pymol可視化處理過程中，如未能顯示氫鍵，考慮小分子與蛋白質(zhì)之間是以其他相互作用力相結(jié)合，予展示以氫鍵結(jié)合的對接模式組）。見圖4。

表2 君藥活性成分--關鍵靶點對接結(jié)果

圖4 部分靶點蛋白與活性成分對接模式圖

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎作為炎癥性腸病（IBD）的一種，其病因目前尚未完全明確，目前研究認為是一種慢性自身免疫病[7］,主要由免疫反應介導并與遺傳和環(huán)境因素密切相關[8］，越來越多的研究認為機體免疫功能紊亂是引發(fā)UC的主要因素，細胞免疫因子的作用也越來越受重視[9］。在篩選出來的有效化合物中，根據(jù)其Degree值大小，可以得出槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）兩種有效化合物，槲皮素作為類黃酮化合物具有抗氧化和抗炎作用，對炎癥和免疫起調(diào)節(jié)作用，有研究表明槲皮素及其衍生物可以有效抑制結(jié)腸的炎癥損傷，機制可能是槲皮素具有抑制促炎性細胞因子和/或改變腸道菌群的能力[10-11］；山奈酚具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，它可以保護腸黏膜免受DSS誘導的UC侵害[12］。

在PPI蛋白互作網(wǎng)絡圖中，根據(jù)Degree值可發(fā)現(xiàn)：細胞腫瘤抗原（TP53）、白介素-6（IL6）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）、腫瘤壞死因子（TNF）、轉(zhuǎn)錄因子（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）等多個靶點可能在四逆散治療UC中起著重要作用。IL-6是一種促炎因子，主要參與炎癥免疫過程，研究發(fā)現(xiàn)UC患者機體炎癥黏膜中IL6水平與病情呈正相關，病情越重IL6水平越高[13］，阻斷IL6受體的信號傳導是非常有效治療的治療手段[14］。VEGFA是VEGF中的一種，可促進血管生成和內(nèi)皮細胞增殖。而研究了證明VEGF在潰瘍性結(jié)腸炎患者的黏膜表達顯著升高[15］。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，中和抗VEGF抗體可通過減少過度的血管通透性和減少炎癥細胞浸潤，部分改善大鼠實驗性UC[16］。TNF是由T淋巴細胞和單核巨噬細胞產(chǎn)生的具有多種生物活性的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)劑，與IL6被認為是能介導UC發(fā)病的細胞因子[17］。有研究發(fā)現(xiàn)，UC活動期患者體內(nèi)TNF水平明顯高于緩解期組及健康組，可通過TNF水平評估患者病情[18］。MAPK3是MAPK家族成員之一，也可稱為ERK1，具有細胞的存活、增殖、分化和程序性死亡的多種功能。有實驗發(fā)現(xiàn)，UC模型組大鼠結(jié)腸黏膜中ERK1基因相對正常組表達量升高，研究者認為UC大鼠模型可能是通過激活ERK信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)腸道損傷修復，ERK1可能為該途徑關鍵基因[19］。

從功能富集分析中可發(fā)現(xiàn)，四逆散關鍵靶點可能通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路發(fā)揮治療UC的作用。PI3K-Akt信號通路主要與細胞增殖和凋亡有關，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路參與TNF-α等促炎細胞因子的調(diào)控和釋放，在UC的發(fā)展和進展中起著重要作用[20］。MAPK途徑在三級激酶級聯(lián)反應中發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導功能,靶向MAPK信號傳導途徑被認為是用于管理腸道炎癥有吸引力的治療策略[21-22］。HIF-1是一種與缺氧應激相關的轉(zhuǎn)錄活性因子，參與調(diào)節(jié)細胞凋亡、細胞周期，它與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等通路存在密切關系，能在免疫性疾病中發(fā)揮作用[23］。

在分子對接方面，關鍵靶點與柴胡活性成分均能自發(fā)結(jié)合，而靶點以VEGFA、TNF結(jié)合性最好，活性成分以八環(huán)素（Octalupine）、柴胡皂苷c（saikosaponin c_qt）、豆甾醇（Stigmasterol）、α-菠菜甾醇（α-spinasterol）結(jié)合性最好。研究發(fā)現(xiàn)柴胡提取物（例如柴胡皂苷c）具有明顯的抗炎、抗過敏、抗病毒、抗腫瘤、神經(jīng)調(diào)節(jié)活性和免疫調(diào)節(jié)，主要通過MAPK、NF-κB或其他途徑[24］。豆甾醇是一種具有確定的免疫調(diào)節(jié)特性的天然甾體醇，能減弱先天和適應性免疫應答[25］，具有潛在的抗炎作用，可以抑制促炎和基質(zhì)降解介質(zhì)[26］。α-菠菜甾醇是一種在多種植物中發(fā)現(xiàn)的類固醇化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗氧化、抗抑郁的藥理作用[27］。

綜上，四逆散可能通過相關活性成分（如quercetin、kaempferol等）及相關靶點（如TP53、IL6、VEGFA等），參與調(diào)控RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導等生物過程及PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、MAPK信號通路等信號通路，從而調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎性反應的發(fā)生，最終達到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的，體現(xiàn)了四逆散治療潰瘍性結(jié)腸炎具有多成分、多靶點、多通路的作用特點。目前四逆散治療UC的研究并不多，且以IL6、IL4/STAT信號通路、NF-κB信號通路等為主要研究對象，本研究通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接的方法，為之后研究四逆散治療UC提供新的研究思路。