紅極參肽的酶法制備工藝優(yōu)化及其抗氧化評(píng)價(jià)

劉金麗，樊 芳，何曉霞，鄒圣燦，曹廷鋒,

（1.青島琛藍(lán)生物科技有限公司，山東青島 266200；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東青島 266000）

紅極參（）又稱冰島紅參或北極紅參，是一種棘皮海洋動(dòng)物，屬海參綱瓜參科，主要產(chǎn)自靠近北極圈的冰島，是生長于北大西洋海域水下30 英尺左右的野生海參，表層水溫不超過4 ℃，參齡一般10 年以上，由于生長環(huán)境的特殊性和較長的生長周期，紅極參體內(nèi)幾乎不含任何污染物且積累了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其參體體大肉厚，肉質(zhì)金黃，富含蛋白質(zhì)、海參多糖、海參皂苷、維生素和微量元素，品質(zhì)高于一般品種的海參，且當(dāng)?shù)氐募t極參主要用于出口，價(jià)格低廉，因此紅極參具有極大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

不同品種的海參的粗蛋白含量有所差異，趙玲等對(duì)比了黑海參、綠刺參、糙刺參等10 種海參營養(yǎng)成分，結(jié)果顯示黑北極參蛋白含量最高，為87.20%，綠刺參蛋白含量最低，為73.58%。海參肽是源于海參蛋白的肽類產(chǎn)品，具有高蛋白、低脂肪、易吸收的特點(diǎn)。近年來研究表明海參肽還通常具備特定的生物活性，王迪等通過復(fù)合酶酶解北極參，工藝優(yōu)化后的多肽得率為15.38%；楊東達(dá)等利用刺參內(nèi)臟酶解制備海參肽，優(yōu)化的工藝條件下水解度可達(dá)48.9%。曹學(xué)彬等利用5 種蛋白酶酶解北極海參蛋白得到的5 種多肽對(duì)超氧陰離子和羥自由基均有不同程度的清除作用；另有報(bào)道由富含蛋白的仿刺參（）制備的海參肽具有通過清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）和DPPH 自由基來延緩衰老的作用；高云龍等制備的冰島刺參內(nèi)臟團(tuán)抗氧化肽，對(duì)DPPH 自由基清除率和羥基自由基清除率分別為89.18%和71.86%；除抗氧化作用外，海參還有其他功效，例如Zhang 等發(fā)現(xiàn)海參來源的富含二十碳五烯酸的磷脂可通過抑制小鼠體內(nèi)的脂滴相關(guān)蛋白FSP27 來抑制脂質(zhì)積累。Wargasetia 等研究表明海參肽可通過抑制蛋白（EGFR，PI3K，AKT1，CDK4）的過量表達(dá)來抑制乳腺癌。海參種類繁多，目前較多的研究集中在刺參、糙刺參、茄參等大眾熟知的種類，針對(duì)紅極參的研究仍相對(duì)較少。

本文以去內(nèi)臟的紅極參體壁肉為原料，選用水產(chǎn)復(fù)合蛋白酶酶解，以水解度為指標(biāo)，通過單因素與響應(yīng)面試驗(yàn)確定酶解制備紅極參肽的最優(yōu)工藝。并對(duì)紅極參肽粉的營養(yǎng)構(gòu)成、氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量和體外抗氧化作用進(jìn)行分析，為紅極參產(chǎn)品的開發(fā)利用和精深加工提供理論依據(jù)和科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮紅極參（）、冰鮮土耳其刺參（） 青島藍(lán)潤生物工程有限公司；冰鮮仿刺參（）、冰鮮海地瓜（） 煙臺(tái)浩霞水產(chǎn)服務(wù)部；復(fù)合蛋白酶（中性蛋白酶:堿性蛋白酶:木瓜蛋白酶為2:1:1）40 萬U/g 南寧龐博生物工程有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma 公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州隆和儀器制造有限公司；L550 臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀離心儀器有限公司；UV-5200 紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；SHW120J 實(shí)驗(yàn)室攪拌器 上海盛海威電氣儀表有限公司；K9860 全自動(dòng)凱氏定氮儀 海能未來技術(shù)集團(tuán)有限公司；氨基酸分析儀 安捷倫科技（中國）有限公司；島津LC-20A 液相色譜儀 島津公司；TSKgel G2000 SWXL 色譜柱 東曹（上海）生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅極參的酶解工藝 前處理：取冰鮮的紅極參及土耳其刺參、仿刺參和海地瓜，經(jīng)過化凍、去腸得到海參體壁肉，取出部分紅極參肉均質(zhì)打漿，粒度不大于2 mm，200 g 每袋分裝凍存，用于酶解實(shí)驗(yàn)。其余3 種海參肉及剩余的紅極參肉置于105 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，磨粉，用于營養(yǎng)成分分析。

酶解過程：取200 g 紅極參肉漿，加入定量的蒸餾水，攪拌混勻。調(diào)節(jié)料液pH，在恒溫水浴鍋中攪拌預(yù)熱10 min，加入適量的復(fù)合蛋白酶，攪拌酶解。酶解結(jié)束后沸水浴10 min 滅酶，冷卻后離心（5000 r/min，15 min），上清液即為紅極參酶解液，用于水解度測定，酶解液依次通過1.2 和0.45 μm 濾膜除雜質(zhì)，收集過濾清液并噴干即得紅極參肽粉，用于肽粉的營養(yǎng)組分、氨基酸含量、抗氧化能力及分子量的測定。

1.2.2 營養(yǎng)組分的測定 水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、海參皂苷分別按照國標(biāo)GB 5009.3-2016、GB 5009.4-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016、GB/T 33108-2016中方法測定；多糖的測定采用苯酚-硫酸法。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 酶解實(shí)驗(yàn)中固定參數(shù)為：酶解溫度55 ℃、酶解pH7.0、料液比1:2（w:v）、加酶量1200 U/g、酶解時(shí)間4 h；然后分別對(duì)酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）、酶解pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、料液比（1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3）、加酶量（600、800、1000、1200、1500 U/g）和酶解時(shí)間（2、4、6、8、10 h）5 個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以水解度為指標(biāo)，測定各因素對(duì)水解度的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度（A）、加酶量（B）、酶解時(shí)間（C）為因素，根據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)3 因素3 水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以水解度為響應(yīng)值，對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。其中因素水平表如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.2.5 水解度的測定 水解度是指蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與底物中蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)之比，紅極參酶解液水解度按照下面公式進(jìn)行計(jì)算，其中氨態(tài)氮含量的測定依據(jù)鄰苯二甲醛法，具體操作步驟參考徐永霞等的方法，底物中總氮含量依GB 5009.5-2016 中的凱氏定氮法進(jìn)行測定。水解度的計(jì)算公式為：

1.2.6 紅極參肽相對(duì)分子質(zhì)量分布的測定 采用高效液相色譜法，有關(guān)色譜條件及具體操作步驟參照GB 31645-2018。將紅極參肽粉配制成濃度為5.0 mg/mL 的樣品用于測定，利用相對(duì)分子質(zhì)量回歸方程計(jì)算紅極參肽的相對(duì)分子質(zhì)量大小，根據(jù)色譜峰峰面積計(jì)算不同分子量段的占比。

1.2.7 氨基酸組成測定 噴干的紅極參肽粉氨基酸組成按照GB 5009.124-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定中方法進(jìn)行檢測。

1.2.8 紅極參肽體外抗氧化能力的測定

1.2.8.1 羥自由基清除率的測定 采用陳發(fā)河等的方法。將肽粉配制成不同濃度的待測溶液，向試管中依次加入1.0 mL 磷酸鹽緩沖液（pH7.4）、1.0 mL番紅花紅試劑（100 mg/L）、1.0 mL EDTA-Fe試劑（1 mmol/L）、0.5 mL 待測液和1mL 3%的HO溶液，混勻，37 ℃水浴30 min，反應(yīng)完畢后以1.0 mL磷酸緩沖液加3.5 mL 去離子水調(diào)零，測定520 nm處的吸光值A(chǔ)。以蒸餾水替代樣品測定吸光值A(chǔ)，用蒸餾水替代樣品和HO測定吸光值A(chǔ)。將V配制成與待測液相同的濃度，按上述步驟測定吸光值，作為陽性對(duì)照。羥自由基清除率公式為：

式中：A為樣品組吸光值；A為空白組吸光值；A 為對(duì)照組吸光值。

1.2.8.2 超氧陰離子清除率的測定 超氧陰離子是由鄰苯三酚在弱堿性環(huán)境中自身氧化分解產(chǎn)生。依據(jù)文獻(xiàn)[23-24]的方法，加以改進(jìn)，取Tris-HCl 緩沖液（pH8.2，0.05 mol/L）3.5 mL 和各濃度紅極參肽粉溶液1.0 mL，混勻，25 ℃水浴中預(yù)熱20 min。再加入0.5 mL 10 mmol/L 鄰苯三酚試劑，充分混勻，25 ℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，迅速加入 10 mol/L 的濃鹽酸1.0 mL 終止反應(yīng)。波長325 nm 處測得吸光值A(chǔ)，以相同體積的蒸餾水代替樣品，測得吸光值A(chǔ)，同樣將V配制成與待測液相同的濃度，按上述步驟測定吸光值，作為陽性對(duì)照。超氧陰離子清除率計(jì)算公式：

式中：A為空白組的吸光值；A為加入樣品組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 基本營養(yǎng)成分分析

紅極參與仿刺參、海地瓜、土耳其刺參的基本營養(yǎng)成分占干基比重如表2 所示。紅極參的蛋白含量和總皂苷含量在四種海參中最高，加之其無污染的生長環(huán)境和潛在的經(jīng)濟(jì)開發(fā)價(jià)值，后期選用紅極參作為海參肽制備的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行研究。

表2 不同品種海參中基本營養(yǎng)成分組成（干基，g/100 g）Table 2 Approximate nutrients in different kinds of sea cucumbers (in dry basis,g/100 g)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解溫度對(duì)水解度的影響 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響結(jié)果見圖1。當(dāng)溫度由30 ℃升高至50 ℃，反應(yīng)體系的蛋白質(zhì)水解度快速升高，50 ℃時(shí)蛋白質(zhì)水解度達(dá)到最大值26.17%±0.47%。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，水解度率呈下降趨勢。這是因?yàn)闇囟冗^低會(huì)降低酶分子在酶解反應(yīng)中運(yùn)動(dòng)的激烈程度，酶與底物結(jié)合幾率變小；溫度過高會(huì)影響酶分子的空間構(gòu)型，導(dǎo)致酶活性降低，因此選擇酶解溫度為50 ℃。

圖1 酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis

2.2.2 初始pH 對(duì)水解度的影響 圖2 反映了初始pH在5.0～9.0 范圍內(nèi)酶解液蛋白質(zhì)水解度的變化。從圖中可以看出，隨pH 的升高，酶解液的蛋白質(zhì)水解度先顯著增大（＜0.05），pH 為7.0 時(shí)，蛋白質(zhì)水解度為26.13%±0.58%，之后再增大pH，水解度緩慢降低，這是因?yàn)閜H 影響蛋白酶的活性，過酸或過堿均會(huì)使酶活降低。紅極參酶解料液的自然pH 在6.0～7.0 之間，而在這一范圍內(nèi)，水解度無明顯變化，說明復(fù)合蛋白酶在此pH 范圍具有良好的活性。另外，在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中，中性條件不易造成設(shè)備損害，因此選擇紅極參酶解的最適pH 為7.0。

圖2 酶解初始pH 對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of initial pH of enzymatic on the degree of hydrolysis

2.2.3 料液比對(duì)水解度的影響 料液比對(duì)水解度的影響結(jié)果見圖3。當(dāng)料液比從1:1.0 變化到1:1.5時(shí)，水解度顯著上升（＜0.05），當(dāng)料液比在1:1.5～1:2.5之間時(shí)，水解度無顯著變化（＞0.05），這是由于開始體系中水占比較小，酶解底物濃度過高，料液粘稠、蛋白吸水溶脹導(dǎo)致流動(dòng)性差，不利于底物和酶的擴(kuò)散，從而抑制了酶解作用，隨著料液比增大，酶與底物充分接觸，酶解反應(yīng)加快，水解度升高，料液比為1:2 時(shí)水解度達(dá)到最大27.01%±0.34%，繼續(xù)增大料液比，底物中紅極參蛋白濃度降低，底物與酶分子結(jié)合的幾率變小，水解度降低。在規(guī)模化生產(chǎn)中，酶解效果無明顯差異時(shí)，優(yōu)先選擇較低的料液比，有利于增加產(chǎn)量，節(jié)省成本。綜上所述，選擇最佳料液比為1:1.5。

圖3 料液比對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on the degree of hydrolysis

2.2.4 加酶量對(duì)水解度的影響 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響如圖4 所示。結(jié)果顯示，紅極參蛋白質(zhì)水解度隨著酶制劑用量的增加而增大，當(dāng)加酶量在600～1000 U/g 范圍內(nèi)時(shí)，水解度顯著增加（＜0.05），加酶量為1000 U/g 時(shí)的水解度為26.26%±0.33%；這是由于酶解過程中，酶量增多利于底物與酶的接觸，酶解反應(yīng)加速。繼續(xù)增加酶制劑用量時(shí)，水解度無顯著增加（＞0.05）。這是由于酶解過程中，大分子蛋白被水解后減少，小分子多肽產(chǎn)物增多，產(chǎn)物的增多反饋抑制了底物與酶的結(jié)合，減緩了水解進(jìn)程。由以上分析可知，選擇適宜的加酶量既能達(dá)到理想的酶解效果，又能避免酶制劑的浪費(fèi)。因此，選擇最佳加酶量為1000 U/g。

圖4 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響如圖5 所示。隨著酶解時(shí)間的延長，水解度逐漸增大，當(dāng)酶解時(shí)間超過6 h，水解度無顯著增加（＞0.05）。原因是在酶解反應(yīng)初期，底物與酶的濃度較高，酶解速度較快，隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，底物大蛋白分子逐漸被酶解，濃度降低，酶解反應(yīng)變緩，水解度上不再增加。因此選擇酶解時(shí)間為6 h。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis time on the degree of hydrolysis

2.3 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 基于復(fù)合蛋白酶各單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間為影響水解度的主要因素，按照Box-Behnken 試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface experimental design and results

2.3.2 模型回歸及顯著性分析 應(yīng)用Design Expert 11 對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元擬合，得到回歸方程為Y=29.53-0.015A+0.88B+1.36C-1.16AB-0.67AC+0.3BC-2A-2.2B-2.22C，決定系數(shù)=0.9813，說明擬合度較好，可用于分析和預(yù)測。方差分析結(jié)果如表4 所示，該模型＜0.0001，極顯著；失擬項(xiàng)=0.3028＞0.05，不顯著；調(diào)整決定系數(shù)=0.9572，說明該模型能解釋約95%響應(yīng)值的變化，擬合度良好。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，模型中一次項(xiàng)B（加酶量）、C（時(shí)間）對(duì)響應(yīng)值的影響為極顯著(＜0.01)，A（溫度）影響不顯著；由值可知，各因素對(duì)紅極參水解度的影響順序?yàn)椋篊（時(shí)間）＞B（加酶量）＞A（溫度）。溫度與加酶量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著(＜0.01)，溫度與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響顯著(＜0.05) 。

2.3.3 因素間的交互作用分析 根據(jù)多元二次回歸方程做相應(yīng)曲面，如圖6～圖7 所示，響應(yīng)面均呈陡坡狀且等高線為橢圓形，說明溫度、加酶量和時(shí)間兩兩之間存在交互作用，且溫度與加酶量、溫度與時(shí)間之間的交互作用對(duì)水解度影響較大。這與表4 中交互項(xiàng)AB 處于極顯著、AC 處于顯著水平是一致的。

圖6 酶解溫度與加酶量交互作用對(duì)紅極參水解度的影響Fig.6 Effect of the interaction between enzymolysis temperature and enzyme dosage on the degree of hydrolysis of Cucumaria frondosa

圖7 酶解溫度與時(shí)間對(duì)紅極參水解度的影響Fig.7 Effect of the interaction between enzymolysis temperature and time on the degree of hydrolysis of Cucumaria frondosa

表4 響應(yīng)面模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the response surface model

2.3.4 最佳工藝參數(shù)驗(yàn)證 通過回歸方程最終確定的優(yōu)化酶解參數(shù)為溫度49.32 ℃、加酶量1052.00 U/g、酶解時(shí)間為4.69 h，水解度為29.88%。為方便操作，將酶解溫度調(diào)整為49 ℃，酶解時(shí)間為4.7 h，因此在優(yōu)化后的酶解條件：料液比為1:1.5（w:w）、初始pH7.0、酶解溫度49 ℃、加酶量1052 U/g、酶解時(shí)間4.7 h 下進(jìn)行3 批次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得紅極參的水解度為30.51%±0.85%，與預(yù)測值29.88%相比無明顯差異，且高于其他條件組合的結(jié)果，表明模型方案可靠，具有參考價(jià)值。

2.4 紅極參肽粉組分分析

對(duì)酶解制得紅極參肽粉的營養(yǎng)成分檢測如表5所示，紅極參肽粉具備高蛋白低脂肪的特點(diǎn)，同時(shí)在經(jīng)過酶解、酶解液離心、過濾和噴霧干燥等過程后還保存了部分海參多糖和海參皂苷這些活性物質(zhì)，因此紅極參肽粉作為一種綠色健康的食品原料，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和潛在的功能性價(jià)值。

表5 紅極參肽粉的組成成分Table 5 Nutrients in the Cucumaria frondosa peptide

2.5 分子量分布

紅極參肽粉分子量分布譜圖如圖8 所示，各峰詳細(xì)信息見表6，根據(jù)GPC 數(shù)據(jù)分析軟件計(jì)算可知，紅極參肽粉的平均分子量403 Da，分子量小于1 kDa的占比92.81%，分子量小于3 kDa 占比98.85%，小于5 kDa 占比99.89%，以上結(jié)果表明，最佳酶解工藝下酶解效果較好，產(chǎn)物中處于2～10 肽之間的低聚寡肽含量較高?，F(xiàn)有研究表明，不同分子量的海參肽抗氧化能力不同，通常小分子的海參肽生物利用率高，比氨基酸更易吸收且抗氧化活性相對(duì)要好。史亞萍等的研究顯示，分子量小于1 kDa 的海參肽對(duì)超氧陰離子的清除活性最強(qiáng)。曹學(xué)彬等研究的5 種酶解海參肽中，胰蛋白酶酶解的海參多肽中低分子量比重較大，綜合抗氧化能力最好。因此推測制備的紅極參肽粉可能具有抗氧化的作用。

表6 紅極參肽相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 6 Molecular weight distribution of Cucumaria frondosa peptide

圖8 紅極參肽分子量分布色譜圖Fig.8 Chromatogram of the molecular weight distribution of Cucumaria frondosa peptide

2.6 氨基酸含量分析

多肽的抗氧化作用不僅與分子量有關(guān)，還與組成多肽的氨基酸序列有關(guān)，因此對(duì)紅極參肽粉進(jìn)行了氨基酸組成的分析，結(jié)果如表7 所示，其中疏水性氨基酸含量達(dá)38.00%。葛曉鳴等研究曾發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸含量（21.39%）最高的海馬多肽PH-V 在5 種多肽中抗氧化效果是最好的。這是由于疏水氨基酸有助于接近自由基，對(duì)抑制脂質(zhì)過氧化有積極作用。兩種酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量總計(jì)為21.17%。有研究發(fā)現(xiàn)酸性氨基酸側(cè)鏈羧基能鈍化金屬離子，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。除此之外，鮮味氨基酸占比為44.10%、必需氨基酸含量為21.27%，因此紅極參肽粉是一種營養(yǎng)豐富，味道鮮美，同時(shí)可能具有抗氧化作用的高品質(zhì)食品原料。

表7 紅極參肽粉的氨基酸組成Table 7 Amino acid composition of Cucumaria frondosa peptide

2.7 紅極參肽粉的抗氧化分析

羥自由基系活性氧的一種，是目前已知的對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，它可以殺死紅細(xì)胞，降解DNA，還可與生物體內(nèi)的多種分子作用，造成細(xì)胞膜、多糖化合物和脂類等物質(zhì)的氧化損傷，從而引起機(jī)體功能的紊亂。超氧陰離子是活性氧的另一種的自由基，與羥基結(jié)合后的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的氧化毒性，與人體的衰老及癌癥等疾病的發(fā)生有關(guān)。

對(duì)酶解制備的紅極參肽粉進(jìn)行羥自由基和超氧陰離子的清除率檢測分析，結(jié)果如圖9～圖10 所示，隨肽粉溶液濃度的增大，對(duì)羥自由基和超氧陰離子的清除能力也逐漸增強(qiáng)，其中對(duì)羥自由基的清除能力高于V，對(duì)超氧陰離子的清除能力不及V，這一結(jié)果與陳發(fā)河等報(bào)道的海地瓜多肽的抗氧化能力相符。肽粉濃度為0.50 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為91.84%±1.19%；肽粉濃度為1.20 mg/mL 時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率為92.32%±2.21%。紅極參肽粉清除羥自由基和超氧陰離子的IC分別為0.19和0.49 mg/mL，表明紅極參肽粉具備較好的體外抗氧化能力，這與其較低的分子量分布和特定氨基酸組成有密切關(guān)系。

圖9 紅極參肽和VC 對(duì)羥自由基的清除能力Fig.9 Scavenging rates of Cucumaria frondosa peptide and VC on hydroxyl free radicals

圖10 紅極參肽和VC 對(duì)超氧陰離子的清除能力Fig.10 Scavenging rates of Cucumaria frondosa peptide and VC on superoxide anions

3 結(jié)論

本研究以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到復(fù)合蛋白酶酶解紅極參的最佳工藝：料液比1:1.5（w:w），溫度49 ℃、初始pH 為7.0、加酶量1052 U/g、酶解時(shí)間4.7 h，此條件下紅極參蛋白質(zhì)水解度可達(dá)30.51%±0.85%，分子量小于1 kDa 的占比92.81%。紅極參肽粉中富含疏水性和酸性氨基酸，對(duì)羥自由基和超氧陰離子清除率IC分別為0.19、0.49 mg/mL，顯示了良好的抗氧化活性。紅極參肽可作為膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑應(yīng)用于保健食品或特殊功能性輔助食品中，也可應(yīng)用于抗氧化、延緩衰老相關(guān)的護(hù)膚品原料，因此具備較大的開發(fā)潛力和市場前景。本研究為紅極參資源的工業(yè)化利用提供了理論基礎(chǔ)，但對(duì)抗氧化起決定性作用的肽段分子量及多肽序列有待更深入研究。