粗壯女貞苦丁茶精油的抗氧化和抑菌作用研究

馬秋越，徐乾達，陳 南，高浩祥,2，曾維才,2,

（1.四川大學(xué)食品工程系，四川成都 610065；2.食品科學(xué)與技術(shù)四川省高校重點實驗室，四川成都 610065）

氧化變質(zhì)及微生物污染是食品加工和貯藏過程中引發(fā)食品品質(zhì)褪變的主要原因?；谧杂苫?zhǔn)椒磻?yīng)的氧化變質(zhì)對油脂類食品的理化品質(zhì)及色、香、味等感官品質(zhì)有較大的負面影響，進而縮短產(chǎn)品的貨架期。此外，氧化變質(zhì)產(chǎn)生和蓄積的部分氧化產(chǎn)物對人體健康有潛在危害，可進一步誘發(fā)相關(guān)的食品安全問題。同時，由微生物污染引起的食品腐敗顯著降低食品的加工和食用品質(zhì)，并引發(fā)相關(guān)的食源性疾病，不僅對食品工業(yè)生產(chǎn)有較大影響，還嚴重威脅人體生命健康。為抑制食品的氧化變質(zhì)和腐敗，相關(guān)的食品添加劑在食品生產(chǎn)中開始使用。雖然化學(xué)合成的食品添加劑表現(xiàn)出較強的作用，但其對人體有潛在的毒性和危害，開始被逐漸限制使用。因此，從可食用資源中尋找天然、高效的物質(zhì)并將其應(yīng)用于食品生產(chǎn)已成為食品及相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。

粗壯女貞（（Rxob.）Bume）為木犀科女貞屬植物，其干燥的葉是我國西南地區(qū)一種傳統(tǒng)的植物代用茶并被批準(zhǔn)為普通食品進行加工和食用。研究表明，粗壯女貞苦丁茶富含多種活性成分，具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛抗炎、降壓降脂等臨床藥理作用。目前，對于粗壯女貞苦丁茶的研究多集中于其醇提物和水提物，有關(guān)粗壯女貞苦丁茶精油的研究鮮有報道。精油是植物的次生代謝產(chǎn)物，常溫下為油狀液體并具有芳香氣味，主要由小分子量的萜類化合物、芳香族和脂肪族化合物組成。植物精油具有抗病毒、抗寄生蟲和殺蟲等多種生物活性，在日用化工和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用價值與前景。本文對粗壯女貞苦丁茶精油的抗氧化和抑菌作用進行研究，并進一步探究其在食品保鮮中的應(yīng)用，為粗壯女貞苦丁茶資源在食品加工與貯藏領(lǐng)域的高值開發(fā)利用提供實驗基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗壯女貞苦丁茶 四川省瀘州市，樣品（編號2021-0718），-20 ℃低溫保藏；花生油 金龍魚一級壓榨花生油，成都沃爾瑪超市；橙子 成都沃爾瑪超市，4 ℃保存?zhèn)溆?；ABTS（2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，2,2'-聯(lián)氮-二（-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽）、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）、正己烷（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；慶大霉素 四川長威藥品有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純 成都金山試劑有限公司；實驗用水 為蒸餾水；色譜分析用水為超純水；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂20 g、水1 L），121 ℃滅菌20 min 備用；土豆培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 L），115 ℃滅菌30 min 備用 成都蜀都試劑有限公司；大腸桿菌（ATCC25922）、沙門氏菌（ATCC14028）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、枯草芽孢桿菌（ATCC 21216）、蠟狀芽孢桿菌（ATCC10231）、黃曲霉（ATCC204304）、黑曲霉（ATCC16404）、青霉（ATCC14994）、啤酒酵母（ATCC9763）等菌種 四川大學(xué)微生物實驗室。

Thermo TRACE DSQII 型氣相色譜-質(zhì)譜（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀美國Thermo Fisher 公司；UV-2000 型紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；FA-2004 型電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LDZH-150KBS 型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D 型超凈工作臺 上海舍巖儀器有限公司；YGP-9160 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海姚氏儀器設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油的提取 通過水蒸氣蒸餾法制備粗壯女貞苦丁茶精油：稱取適量粗壯女貞苦丁茶置于圓底燒瓶內(nèi)，按固液比1:10 g/mL 添加蒸餾水，沸水回流提取4 h，收集產(chǎn)生的精油，后向精油樣品中加入少量無水硫酸鈉除去多余水分，4 ℃冷藏備用。

1.2.2 GC-MS 分析 采用GC-MS 技術(shù)分析精油樣品的揮發(fā)性成分，以正己烷為溶劑配制精油樣品（0.05%，v/v）進行測定，GC-MS 的分析條件如下：

色譜條件：色譜柱為DB-5MS 石英毛細柱（30 m×0.25 mm,0.25 μm）；升溫程序為初始溫度60 ℃保持4 min，以4 ℃/min 升至240 ℃，保持15 min；進樣口溫度為250 ℃；分流比為20:1；進樣體積為1.0 μL；檢樣器溫度為280 ℃；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。

總之,骨傷患者大量輸血后由于血小板減少、凝血因子水平降低、凝血功能下降等,需對血小板及凝血因子等進行及時進行檢測,補充凝血因子及血小板,以降低凝血功能障礙的發(fā)生率。

質(zhì)譜條件：采用電子轟擊（EI）方式電離；電離能為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為40～500 amu；離子源溫度為200 ℃。通過檢索和對比標(biāo)準(zhǔn)譜庫（NIST，14.0 Gaithersburg，MD，USA）對目標(biāo)化合物進行定性分析，采用歸一化積分法對各物質(zhì)進行定量分析。

1.2.3 ABTS自由基清除能力的測定 按照文獻[10]所述的詳細步驟測定精油樣品對ABTS自由基的清除作用。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，配制濃度為85、170、340、510、680 μg/mL 的精油樣品用于測定，測試波長為734 nm。DMSO 作空白對照，丁基羥基茴香醚（BHA）作陽性對照，精油樣品對ABTS 自由基的清除能力按后式計算：ABTS 自由基清除率（%）=（1-A/A）×100，A為樣品組的吸光度，A為空白組的吸光度。

1.2.4 DPPH 自由基清除能力的測定 按照文獻[10]所述的詳細步驟測定精油樣品對DPPH 自由基的清除作用。以DMSO 為溶劑，配制濃度為42.5、85.0、127.5、170.0、212.5 μg/mL 的精油樣品用于測定，測試波長為517 nm。DMSO 作空白對照，BHA作陽性對照，精油樣品對DPPH 自由基的清除能力按后式計算：DPPH 自由基清除率（%）=（1-A/A）×100，A為樣品組的吸光度，A為空白組的吸光度。

1.2.5 脂質(zhì)過氧化抑制能力的測定 按照文獻[10]所述的詳細步驟測定精油樣品的脂質(zhì)過氧化抑制能力。以DMSO 為溶劑，配制濃度為85、170、340、510、680 μg/mL 的精油樣品用于測定，測定波長為532 nm。DMSO 作空白對照，BHA 作陽性對照，精油樣品的脂質(zhì)過氧化抑制能力按后式計算：脂質(zhì)過氧化抑制率（%）=（1-A/A）×100，A為樣品組的吸光度，A為空白組的吸光度。

1.2.6 還原能力的測定 按照文獻[10]所述的詳細步驟測定精油樣品的還原能力。以DMSO 為溶劑，配制濃度為6.8、13.6、20.4、27.2、34 μg/mL 的精油樣品用于測定。記錄反應(yīng)溶液在波長700 nm 處的吸光度，以吸光度值的大小表征樣品的還原能力，吸光度值越大，樣品的還原能力越強，DMSO 作空白對照，BHA 作陽性對照。

1.2.7 食用油脂貯藏過程中過氧化值的測定 取500 g 花生油，于60 ℃水浴中敞口孵育15 min，根據(jù)文獻中抗氧化劑在食用油中的添加量，并結(jié)合實際情況稍作改動確定精油最佳濃度，向花生油中添加精油樣品使其在油脂中的濃度為0.05%（w/w），通過攪拌使精油均勻分散在花生油中，并向花生油中通入氧氣，于60 ℃水浴下恒溫敞口孵育12 h，每隔2 h測定花生油的過氧化值（POV）。

油脂過氧化值測定的詳細步驟按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》規(guī)定的方法進行。油脂的過氧化值（mmol/kg）=500×c×（V-V）/m，式中：V 為實驗組消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；V為空白組消耗硫代硫酸鈉溶液的體積，mL；c 為硫代硫酸鈉溶液的濃度，mol/L；m 為花生油樣品的質(zhì)量，g；500 為換算系數(shù)。

受試樣品的制備：以50%的甲醇溶液為溶劑配制50 μg/mL 的精油樣品，以無菌水（蒸餾水121 ℃滅菌20 min）為溶劑配制50 μg/mL 的慶大霉素溶液，受試樣品均經(jīng)0.22 μm 細菌濾器過濾備用。

含菌雙碟平板的制備：取含菌數(shù)為1×10CFU/mL的各供試菌種的菌懸液倒入經(jīng)高溫滅菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：121 ℃，20 min；土豆培養(yǎng)基：115 ℃，30 min）的培養(yǎng)基中（菌懸液和培養(yǎng)基按體積比1:10），混勻，冷卻備用。

將經(jīng)高溫滅菌的牛津杯放置于含菌雙碟平板表面，吸取精油樣品溶液100 μL 注入牛津杯杯體，后把平板放入各菌種適宜的溫度下培養(yǎng)（細菌于37 ℃培養(yǎng)24 h，霉菌于37 ℃培養(yǎng)72 h，酵母菌于37 ℃培養(yǎng)24 h），記錄抑菌圈的直徑，慶大霉素作陽性對照，每組平行3 個平板。

1.2.9 最低抑菌濃度及最低殺菌濃度的測定 采用微量二倍稀釋法在96 孔平板中測定精油樣品對受試微生物的最低抑菌濃度（MIC）。使用甲醇溶液（50%，v/v）稀釋精油樣品（0.15～80 μg/mL）并通過0.22 μm 細菌濾器除菌后備用。每孔加入100 μL 液體培養(yǎng)基，然后加入相應(yīng)的精油樣品進行對倍稀釋，最后再加入100 μL 菌懸液，每孔含菌量約為1×10CFU/mL。將96 孔板置于各菌種適宜的溫度下培養(yǎng)，肉眼觀測受試微生物的生長情況，以完全沒有微生物生長的最低的精油樣品濃度作為最MIC。

在MIC 值的基礎(chǔ)上，分別將上述無微生物生長孔中的液體培養(yǎng)基劃線接種于平板上，置于各菌種適宜的溫度下培養(yǎng)，以平板上無菌落生長的最低的精油樣品濃度作為最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.10 大腸桿菌生長曲線的測定 以大腸桿菌為對象菌，將其培養(yǎng)至對數(shù)期，按2%接種量加入到肉湯培養(yǎng)基中，精油樣品的濃度為50 μg/mL。經(jīng)37 ℃、100 r/min 搖床培養(yǎng)，每隔4 h 測定培養(yǎng)液在波長600 nm 處的光密度（Optical density，OD）值。以時間為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，繪制大腸桿菌的生長曲線，觀察精油對大腸桿菌生長期的影響。

1.2.11 橙汁貯藏過程中總菌數(shù)的測定 用50%甲醇溶液稀釋精油樣品，并將其加入到10 mL 的橙汁（初始總菌落數(shù)為1×10CFU/mL 左右）中，使其在橙汁中的最終濃度為0.05%（w/v），將橙汁置于37 ℃培養(yǎng)72 h，每隔12 h 測定橙汁的菌落總數(shù)。不添加精油樣品的橙汁作為空白對照，添加0.05%（w/v）苯甲酸鈉的橙汁作為陽性對照，樣品菌落總數(shù)測定的詳細步驟按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》規(guī)定的方法進行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均進行3 次重復(fù)實驗，所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。實驗結(jié)果用SPSS 25.0 的單因素分析（analysis of variance，ANOVA）法進行統(tǒng)計分析，顯著性差異＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 精油揮發(fā)性成分的GC-MS 分析

經(jīng)GC-MS 分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對，從粗壯女貞苦丁茶精油中鑒定出相對含量在0.3%以上的揮發(fā)性成分22 種，具體結(jié)果如表1所示。

由表1 可知，精油中主要為醇類化合物和烯類化合物。其中醇類的相對含量為36.75%，而醇類化合物中4-萜品醇含量最高（31.91%），是精油中的主要揮發(fā)性成分。相關(guān)研究表明，4-萜品醇無色透明，具有良好的芳香味及抗氧化活性，可較好地改善產(chǎn)品的感官特征，展現(xiàn)出開發(fā)為香精香料及抗氧化劑的潛力。此外，精油中烯類的相對含量為53.01%，γ-萜品烯含量最高（19.50%），其次為4-蒈烯（11.54%）。萜品烯具有獨特的香味，是一類生產(chǎn)食用香精香料的重要天然原料，主要用以配制人造檸檬和薄荷精油，在食品工業(yè)中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。同時，精油的揮發(fā)性成分中多數(shù)為不飽和烯烴類物質(zhì)，預(yù)示著精油樣品可能具有淬滅自由基的效果。因此，實驗進一步測定了精油的體外抗氧化活性。

表1 粗壯女貞苦丁茶精油的揮發(fā)性成分及相對含量Table 1 Composition and content of volatile compounds from L.robustum essential oil

2.2 精油對ABTS+自由基的清除作用

粗壯女貞苦丁茶精油對ABTS自由基的清除作用如圖1 所示。由圖1 可知，隨受試濃度的增加（85～680 μg/mL），精油對ABTS自由基的清除作用逐漸增大（18.11%～81.34%），展現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。精油的半數(shù)有效濃度（Half effective concentration，EC）值為395.90 μg/mL，陽性對照BHA 的EC值為5.31 mg/mL。結(jié)合GC-MS 的分析結(jié)果可知，粗壯女貞苦丁茶精油中含有大量的醇類及烯類化合物。陳潘等研究發(fā)現(xiàn)，精油的揮發(fā)性成分中對精油總抗氧化能力影響較大的化合物主要為烯類和醇類，且烯類化合物的含量與精油的總抗氧化能力呈正相關(guān)。精油中的烯類和醇類化合物均具有較強的給氫能力，可發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而淬滅體系中的自由基，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

圖1 ABTS+自由基的清除作用Fig.1 ABTS+ radical scavenging activity

2.3 精油對DPPH 自由基的清除作用

DPPH 是一種親脂性的穩(wěn)定自由基，靈敏度高，常用于天然產(chǎn)抗氧化活性的檢測。粗壯女貞苦丁茶精油對DPPH 自由基的清除作用如圖2 所示。由圖2 可知，隨著受試濃度的增加（42.5～212.5 μg/mL），精油對DPPH 自由基的清除作用逐漸增大（32.06%～71.39%），展現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其EC值為165.45 μg/mL，陽性對照BHA 的EC值為4.86 mg/mL。結(jié)合ABTS自由基清除實驗的結(jié)果可知，粗壯女貞苦丁茶精油能有效清除實驗體系中不同的自由基。同其他水提物的DPPH 自由基清除活性相比，由于精油具有良好的脂溶性，在以醇為溶劑的DPPH 實驗體系中，較低的受試濃度范圍內(nèi)仍然表現(xiàn)良好的清除效果，可對自由基引發(fā)的氧化反應(yīng)展現(xiàn)出較強的抑制作用，是一種良好的自由基清除劑。因此，實驗進一步測定了精油對脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用。

圖2 DPPH 自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging activity

2.4 精油對脂質(zhì)過氧化的抑制作用

脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是一種典型的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，會產(chǎn)生丙二醛等有毒物質(zhì)，引起細胞的氧化損傷，誘發(fā)組織器官的氧化病變。同時，脂類食品中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，不僅會使食品出現(xiàn)不愉悅的氣味，還會嚴重影響食品的品質(zhì)。粗壯女貞苦丁茶精油對脂質(zhì)過氧化的抑制作用如圖3 所示。

圖3 脂質(zhì)過氧化的抑制作用Fig.3 Inhibition on lipid peroxidation

由圖3 可知，隨著受試濃度的增加（85～680 μg/mL），精油對脂質(zhì)過氧化的抑制作用逐漸增大（17.73%～73.55%），展現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC）值為420.1 μg/mL，陽性對照BHA 的IC值為2.98 mg/mL。結(jié)合前述實驗結(jié)果分析可知，粗壯女貞苦丁茶精油在脂溶性反應(yīng)體系中具有比BHA更為良好的溶解性，可均勻地分散在實驗體系中，充分接觸并有效清除反應(yīng)體系中的自由基，從而阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，進而有效抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。

2.5 精油的還原能力

粗壯女貞苦丁茶精油的還原能力如圖4 所示。由圖4 可知，隨著受試濃度的增大（6.8～34 μg/mL），反應(yīng)混合物在700 nm 下的吸光度逐漸增大，且精油組的吸光度始終強于陽性對照。結(jié)果表明，粗壯女貞苦丁茶精油具有良好的還原能力，能在氧化還原反應(yīng)中發(fā)揮較強的給電子作用，淬滅不穩(wěn)定的自由基，是其展現(xiàn)良好的自由基清除作用的重要原因。同時，精油中富含單萜類物質(zhì)，它們可與反應(yīng)體系中的金屬離子發(fā)生強烈的螯合反應(yīng)，從而更好地將三價鐵離子還原為亞鐵離子，進而展現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

圖4 精油的還原能力Fig.4 Reducing power of essential oil

2.6 精油對油脂貯藏過程中氧化的抑制作用

粗壯女貞苦丁茶精油對花生油在貯藏過程中氧化的抑制作用如圖5 所示。由圖5 可知，隨著貯藏時間的延長，各組花生油樣品的POV 值都有不同程度的增大，空白組從18.6 mmol/kg 增加到29.4 mmol/kg；精油組從18.5 mmol/kg 增加到24.4 mmol/kg。結(jié)果表明，在實驗條件下，各組花生油均發(fā)生了不同程度的氧化變質(zhì)。同空白組相比，在相同的貯藏時間內(nèi)，添加精油的花生油展現(xiàn)出較低的POV 值，說明粗壯女貞苦丁茶精油可有效抑制花生油在貯藏過程中的氧化酸敗。油脂既是一種人體必須的營養(yǎng)素，又是一種食品工業(yè)的重要加工原料，還是一種食品熱加工中重要的熱量傳遞媒介。由于油脂的結(jié)構(gòu)中碳鏈較長且飽和度較高，在食品加工和貯藏過程中，油脂容易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量的醛、酮、酸等副產(chǎn)物。研究表明，油脂的氧化不僅會顯著降低其食用價值和油脂類食品的品質(zhì)，也對油脂在食品加工中的特性有較大的負面影響，還會帶來潛在的食品安全風(fēng)險。從化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)上分析，油脂的氧化是一種典型的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該過程的發(fā)生和發(fā)展既需要自由基推動，又會產(chǎn)生大量自由基。若能淬滅反應(yīng)中產(chǎn)生的自由基，則能有效阻斷反應(yīng)的進行。因此，有效清除反應(yīng)體系中的自由基是一種抑制油脂氧化變質(zhì)的重要途徑。結(jié)合前述實驗結(jié)果，粗壯女貞苦丁茶精油具有良好的自由基清除作用，故能在油脂貯藏過程中清除體系中產(chǎn)生和蓄積的自由基，從而阻斷油脂的自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，抑制油脂的氧化變質(zhì)。同時，基于相似相溶的特點，粗壯女貞苦丁茶精油在花生油中展現(xiàn)出良好的分散性，進一步提升其對花生油氧化變質(zhì)的抑制作用。

圖5 精油對花生油在貯藏過程中氧化的抑制作用Fig.5 Inhibition of essential oil on the oxidation of peanut oil during storage

2.7 精油的抑菌作用

腐敗菌在食品中的生長繁殖是一類引發(fā)食品腐敗變質(zhì)的重要原因，且還會進一步引起相關(guān)的食源性疾病，進而危害人體健康。因此，抑制食品加工和貯藏過程中腐敗菌的生長是提升食品質(zhì)量與安全和延長食品貨架期的一種有效途徑。粗壯女貞苦丁茶精油對微生物的抑制作用如表2 所示。

表2 精油的抑菌圈結(jié)果Table 2 Inhibition zone of essential oil

由表2 可知，精油對供試菌株的生長繁殖均展現(xiàn)出顯著的抑制作用，在實驗條件下表現(xiàn)出良好的廣譜抑菌作用。其中，精油對細菌和真菌的抑制作用較強；對革蘭陰性菌與真菌的抑制作用強于陽性對照；對大腸桿菌的抑菌效果最強，其次為青霉。實驗進一步測定了精油對供試菌株的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），結(jié)果如表3 所示。

由表3 可知，精油對供試細菌的MIC 和MBC值的范圍分別是0.31～5.00 μg/mL 及1.25～20.00 μg/mL；對供試真菌的MIC 和MBC 值的范圍分別是0.62～1.25 μg/mL 及1.25～2.50 μg/mL；精油對革蘭氏陰性菌展現(xiàn)出較強的抑制作用；大腸桿菌對精油較為敏感。結(jié)果表明，粗壯女貞苦丁茶精油在較低濃度下即可殺滅供試菌株或抑制其生長繁殖，具有良好的抑菌作用。為進一步觀察精油對微生物各生長期的影響，實驗以大腸桿菌為對象繪制了生長曲線，結(jié)果如圖6所示。

表3 精油對供試菌株的MIC 和MBC 值Table 3 MIC and MBC values of essential oil against the strains

由圖6 可知，同空白組相比，粗壯女貞苦丁茶精油明顯抑制了大腸桿菌的生長，且主要作用于大腸桿菌的對數(shù)生長期，從而使其無法正常生長繁殖，進而使得實驗體系的OD 值維持在較低的水平。對數(shù)生長期是微生物生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，微生物在對數(shù)生長期呈現(xiàn)出較大的生長和繁殖速度。結(jié)果表明，粗壯女貞苦丁茶精油能有效抑制大腸桿菌在對數(shù)生長期的繁殖，并通過縮短菌體的對數(shù)生長期及減緩其生長速率起到抑菌的作用。相關(guān)研究指出，植物精油的抑菌活性主要由其中一些萜烯類化合物產(chǎn)生，它們可通過破壞微生物細胞壁和細胞膜的完整性，引起細胞內(nèi)容物的外溢，從而抑制微生物的生長與繁殖。粗壯女貞苦丁茶精油中含有的大量萜烯類化合物，因此精油在實驗中展現(xiàn)出很好的抑菌效果。

圖6 精油對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.6 Effect of essential oils on the growth of Escherichia coli

2.8 精油對橙汁貯藏過程中總菌數(shù)的影響

實驗以橙汁為模型，觀察了粗壯女貞苦丁茶精油在食品貯藏過程中對微生物生長的抑制作用，結(jié)果如圖7 所示。

由圖7 可知，隨著貯藏期的延長，空白組橙汁中的微生物不斷生長，總菌數(shù)逐漸增大。在36 h 內(nèi)，精油組橙汁中的總菌數(shù)顯著低于空白組和陽性對照組；在36 h 后，各試驗組橙汁中總菌數(shù)逐漸趨于穩(wěn)定，空白對照組總菌數(shù)為1×10CFU/mL，陽性對照組為1×10CFU/mL，精油組基本沒有微生物生長。橙汁中的主要優(yōu)勢腐敗微生物為耐高酸的細菌和釀酒酵母等，結(jié)合前述實驗可知，粗壯女貞苦丁茶精油具有良好的廣譜抑菌性，在食品的貯藏過程中具有良好的抑菌防腐效果，可有效抑制橙汁中微生物的生長或殺死微生物，可能對延長橙汁的貯藏期有益。此外，橙汁中的萜烯烴類和醛類有助于橙汁呈現(xiàn)出橙子的新鮮、自然的風(fēng)味，而粗壯女貞苦丁茶精油亦含有萜烯烴類及醛類，有益于維持橙汁特有的風(fēng)味。同時，精油在橙汁中的添加量較低，其含有的其他成分對橙汁的風(fēng)味基本沒有影響。

圖7 精油對鮮橙汁貯藏過程中總菌數(shù)的影響Fig.7 Effect of essential oil on total colony count of fresh orange juice during storage

3 結(jié)論

粗壯女貞苦丁茶精油中主要含有4-萜品醇、γ-萜品烯和4-蒈烯等22 種揮發(fā)性成分。精油具有良好的抗氧化作用和較強的還原能力，能夠有效清除反應(yīng)體系中的自由基（ABTS自由基EC：395.9 μg/mL、DPPH 自由基EC：165.45 μg/mL），抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)（IC：420.1 μg/mL），并顯著抑制花生油在貯藏過程中的氧化變質(zhì)。此外，粗壯女貞苦丁茶精油展現(xiàn)出良好的廣譜抑菌作用（供試菌MIC：0.31～5.0 μg/mL；MBC：1.25～20.0 μg/mL），對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌具有明顯的抑制效果，能顯著抑制微生物在對數(shù)生長期的繁殖。同時，精油能有效抑制橙汁在貯藏過程中總菌數(shù)的增加。實驗結(jié)果表明，粗壯女貞苦丁茶精油具有良好的抗氧化及抑菌作用，研究為粗壯女貞苦丁茶精油在食品加工與貯藏領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實驗基礎(chǔ)與支撐。后續(xù)還需要進一步優(yōu)化和確定精油在相關(guān)食品中添加的工藝參數(shù)，并對其在抗氧化和抑菌活性中的構(gòu)效關(guān)系和相關(guān)分子機理進行研究。