三種非釀酒酵母對貴人香白葡萄酒發(fā)酵進(jìn)程及揮發(fā)性組分的影響

周洪江，姜文廣，阮仕立，李記明

（煙臺張?jiān)＜瘓F(tuán)有限公司，山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東煙臺 264001）

香氣是決定葡萄酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，是上百種揮發(fā)性化合物相互作用的結(jié)果，也是吸引消費(fèi)者和增強(qiáng)市場競爭力的重要因素。在葡萄酒釀造中，接種商業(yè)化釀酒酵母并使其主導(dǎo)完成酒精發(fā)酵是常規(guī)操作，這是基于釀酒酵母（）的若干優(yōu)良釀造特性，如發(fā)酵完全、酒精產(chǎn)率高、發(fā)酵可重復(fù)性強(qiáng)、抑制雜菌生長等，但是只接種商業(yè)化釀酒酵母帶來的共性問題是產(chǎn)品風(fēng)格單一、缺乏典型性。將非釀酒酵母與釀酒酵母聯(lián)合使用，發(fā)揮每種酵母的釀造特性和優(yōu)勢，形成對酒體的提升是解決以上問題的有效方法。

非釀酒酵母是一類自然存在于漿果、果梗表面、果園土壤或釀酒環(huán)境中可參與葡萄酒發(fā)酵的微生物，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生甘油、酯類、高級醇、萜類化合物等代謝產(chǎn)物，并且能夠分泌糖苷酶、脂肪酶、蛋白酶等多種酶類，通過酶的活性反應(yīng)將果實(shí)中的香氣前體物質(zhì)分解并釋放出香氣組分，從而影響葡萄酒的香氣、風(fēng)味和復(fù)雜性。隨著研究者對非釀酒酵母的深入研究，非釀酒酵母的潛在應(yīng)用價(jià)值受到越來越多的關(guān)注。目前葡萄酒釀造領(lǐng)域研究較多的非釀酒酵母主要有孢圓酵母屬（）、有孢漢遜酵母屬（）、假絲酵母屬（）、畢赤酵母屬（）、美奇酵母屬（）、克魯維酵母屬（）等，它們以不同的代謝機(jī)制影響著果酒的風(fēng)味。Azzolini 等發(fā)現(xiàn)和釀酒酵母混合發(fā)酵能夠增加芳香醇類和酯類的合成量，明顯提升葡萄酒的香氣和復(fù)雜性，以及緩和葡萄酒的發(fā)酵進(jìn)程。Whitener 等證實(shí)某些特定的戴爾有孢圓菌株可生成高濃度的萜烯化合物，如-萜品醇、芳樟醇、香葉醇等，從而提高葡萄酒的品種香氣。Hranilovic 等研究發(fā)現(xiàn)美極梅氏酵母（）與釀酒酵母順序接種發(fā)酵葡萄酒時(shí)，能夠促進(jìn)三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物的合成，如富馬酸、琥珀酸、甘油等，同時(shí)增加多種乙酸酯、高級醇等揮發(fā)性組分的產(chǎn)量。Ciani 等發(fā)現(xiàn)耐熱克魯維酵母（）與釀酒酵母實(shí)施混合發(fā)酵時(shí)可以改善影響葡萄酒品質(zhì)和感官質(zhì)量，如增加萜烯、異丁酸等芳香化合物，限制乙酸、乙醛等物質(zhì)的合成，還能提高甘油、葡萄花色苷和多糖的含量。但是非釀酒酵母目前在紅葡萄酒釀造中研究及應(yīng)用較多，白葡萄酒中涉及較少，急需開展相關(guān)研究。

揮發(fā)性組分的測定利用氣相色譜-離子遷移譜（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GCIMS）技術(shù)完成，這是近年出現(xiàn)的檢測風(fēng)味化合物的新手段。GC-IMS 的分析原理是樣品經(jīng)氣相色譜分離后，先經(jīng)IMS 離子源進(jìn)行離子化然后進(jìn)入漂移區(qū)，根據(jù)在漂移區(qū)的遷移速率不同，不同物質(zhì)按照先后順序到達(dá)檢測器，從而被檢測。相較于氣相色譜，該技術(shù)具有靈敏度高、檢測速度快、檢測限低、樣品無需復(fù)雜預(yù)處理、可用于現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)勢。本研究以在煙臺種植的“貴人香”葡萄為釀造原料，測試三種商業(yè)化非釀酒酵母，即戴爾有孢圓酵母（）、美極梅奇酵母（）和耐熱克魯維酵母（）與釀酒酵母混合發(fā)酵對白葡萄酒的理化指標(biāo)、揮發(fā)性組分和感官品質(zhì)的影響，以釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵的白葡萄酒為對照，分析比較三種非釀酒酵母間的區(qū)別，及其對解決白葡萄酒香氣淡、風(fēng)格典型性不突出問題的貢獻(xiàn)，以期為在白葡萄酒中釀造應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貴人香 釀造葡萄品種，采自煙臺萊州，2019 年9 月完成成熟采摘。果實(shí)理化指標(biāo)：總糖189 g/L，總酸6.1 g/L（以酒石酸計(jì)），pH3.51；釀酒酵母Lalvin D21、美極梅奇酵母Flavia?MP346 加拿大Lallemand 公司；戴爾有孢圓酵母Prelude、耐熱克魯維酵母Concerto丹麥科漢森公司；n-酮C4～C9色譜純，國藥化學(xué)試劑北京有限公司；葡萄糖、酵母粉、瓊脂等培養(yǎng)基成分 分析純，國藥化學(xué)試劑北京有限公司。

FlavourSpec? GC-IMS 聯(lián)用儀（配有CTC 自動頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search 定性軟件的GC-IMS 系統(tǒng)）德國G.A.S 公司；20 mL 頂空進(jìn)樣瓶 寧波哈邁儀器科技有限公司；酸度計(jì)FE28 梅特勒集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 WL 營養(yǎng)培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖50 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀550 mg，氯化鈣125 mg，氯化鐵2.5 mg，氯化鉀425 mg，硫酸錳2.5 mg，硫酸鎂125 mg，溴甲酚綠22 mg，瓊脂20 g，pH6.5，121 ℃滅菌20 min。

賴氨酸瓊脂培養(yǎng)基（1 L）：D-葡萄糖10 g，DL-蛋氨酸2 mg，DL-色氨酸2 mg，L-組氨酸1 mg，對氨基苯甲酸200 μg，泛酸2 mg，生物素20 μg，葉酸2 μg，煙酸400 μg，鹽酸吡哆醇400 μg，核黃素200 μg，鹽酸硫胺素400 μg，肌醇10 mg，硼酸500 μg，碘化鉀100 μg，氯化銅40 μg，氯化鐵200 μg，鉬酸鈉200 μg，硫酸鋅400 μg，硫酸錳400 μg，磷酸氫二鉀150 mg，磷酸二氫鉀850 mg，氯化鈣100 mg，硫酸鎂500 mg，賴氨酸鹽酸鹽2.5 g，氯化鈉100 mg，瓊脂20 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 白葡萄酒發(fā)酵 將新鮮葡萄破碎擠壓出葡萄汁入發(fā)酵罐中，加入SO并使其濃度達(dá)到50 mg/L，再加入30 mg/L 的果膠酶于5 ℃下反應(yīng)12 h，分離出上清液。添加適量蔗糖，使還原糖濃度達(dá)到210 g/L。將經(jīng)過上述處理的葡萄汁等分為8 份，6 份用于非釀酒酵母/釀酒酵母混合發(fā)酵，2 份為釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵，即每組發(fā)酵酒樣均有2 組平行樣品。

每份葡萄汁倒入20 L 小型發(fā)酵罐中，進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。所有酵母在使用前均需要進(jìn)行充分活化，即將酵母置于20%蔗糖水溶液中，30 ℃下輕輕攪拌至酵母產(chǎn)生豐富氣泡，而后直接接種于葡萄酒中。為便于區(qū)分四種發(fā)酵葡萄酒，對其進(jìn)行代碼命名。將接種美極梅奇酵母Flavia?MP346、戴爾有孢圓酵母 Prelude和耐熱克魯維酵母Concerto的混合發(fā)酵葡萄酒分別用M1、M2、M3 表示，釀酒酵母Lalvin D21 單獨(dú)發(fā)酵的葡萄酒用M4 表示。

M1、M2、M3 中先分別上述接種商業(yè)化非釀酒酵母，接種量為250 mg/L，24 h 后接種釀酒酵母Lalvin D21，接種量為300 mg/L。20 ℃恒溫發(fā)酵，并監(jiān)測白葡萄酒中的酵母增殖情況和還原糖濃度變化情況，直至還原糖濃度小于4 g/L。M4 中釀酒酵母的接入量為250 mg/L，其它處理與以上三種樣品完全相同。上述樣品中酵母增殖情況通過檢測酵母的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行表征，測定方法見1.2.3；還原糖濃度測定方法見1.2.4。

發(fā)酵結(jié)束后將SO加入到酒樣品中，使游離SO濃度達(dá)到30 mg/L，所有樣品均保存于4 ℃冰箱中，待后續(xù)完成理化指標(biāo)以及揮發(fā)性香氣組分測定。

1.2.3 酵母活細(xì)胞數(shù)的測定方法 WL 鑒別培養(yǎng)基和賴氨酸瓊脂培養(yǎng)基分別應(yīng)用于釀酒酵母和非釀酒酵母的菌落計(jì)數(shù)，并采用梯度稀釋法對它們在發(fā)酵過程中的增殖情況進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。取5 mL 酒樣，用無菌生理鹽水梯度稀釋后（稀釋倍數(shù)為10～10），涂布于WL 營養(yǎng)培養(yǎng)基，在28 ℃好氧條件下培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)釀酒酵母的數(shù)目。相同的酒樣經(jīng)無菌生理鹽水梯度稀釋后，涂布于賴氨酸培養(yǎng)基，在28 ℃好氧條件下培養(yǎng)72 h 后統(tǒng)計(jì)非釀酒酵母的數(shù)量。菌體量的表示方法為CFU/mL。

1.2.4 理化指標(biāo)測定 酒精度、總糖、總酸、揮發(fā)酸的測定方法參照《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038-2006）執(zhí)行。其中：酒精度采用密度瓶法；總糖采用斐林氏劑滴定法測定，以葡萄糖計(jì)；揮發(fā)酸和總酸：采用氫氧化鈉滴定法測定，分別以乙酸和酒石酸計(jì)。pH 采用酸度計(jì)測定。每個(gè)樣品檢測3 次。

1.2.5 揮發(fā)性組分分析 取1 mL 樣品，放入20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，保溫孵化后經(jīng)頂空進(jìn)樣，用氣相離子遷移譜儀FlavourSpec?進(jìn)行測試。每個(gè)樣品分析3 次。

頂空進(jìn)樣條件：頂空孵化于60 ℃，孵化10 min；振蕩加熱；頂空進(jìn)樣針溫度為65 ℃；進(jìn)樣量為100 μL，不分流模式。

GC 條件：載氣為高純氮?dú)猓兌取?9.999%），流速設(shè)定為2 mL/min，保持2 min，8 min 上升至30 mL/min，10 min 第二次上升至150 mL/min，保持150 mL/min，持續(xù)10 min。

IMS 條件：漂移管長度98 mm；漂移管溫度45 ℃；管內(nèi)線性電壓5 kV/cm；漂移氣為N（純度≥99.999%），漂移氣流速150 mL/min；放射源為3H；離子化模式為正離子。

1.2.6 香氣感官質(zhì)量評價(jià) 利用定量描述分析法對白葡萄酒進(jìn)行香氣感官質(zhì)量分析，由15 位具有葡萄酒品評經(jīng)驗(yàn)的品評者（6 名女性，9 名男性，年齡21～52 歲）組成感官評價(jià)小組。在正式品評之前，小組成員先接受葡萄酒描述性感官分析的培訓(xùn)，通過進(jìn)行多次檢驗(yàn)與討論，品評小組確定了葡萄酒中主要的香氣屬性特征，包括果香、花香、植物香、蜂蜜、化學(xué)味及整體香氣。品評實(shí)驗(yàn)在感官評價(jià)室進(jìn)行，室溫20 ℃，通風(fēng)良好，無噪音，無任何氣味。以3位數(shù)字隨機(jī)編碼12 份葡萄酒樣品，平均分為2 組呈送給評價(jià)員。評價(jià)員按順序聞香，并采取10 點(diǎn)制打分，0 表示無，9 表示特征性最強(qiáng)。0.0～3.0：香氣屬性微弱；3.1～6.0：香氣屬性強(qiáng)度適中，與其它屬性平衡；6.1～9.0：呈現(xiàn)典型的、濃郁的屬性香氣，且與其它屬性協(xié)調(diào)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品中揮發(fā)性組分的鑒定通過GC-IMS 聯(lián)用儀自帶分析軟件LAV（Laboratory Analytical Viewer）、定性軟件GC×IMS Library Search（內(nèi)置NIST2014、IMS 數(shù)據(jù)庫）完成。運(yùn)用LAV 中插件Reporter 進(jìn)行樣品GC-IMS 譜圖對比，用插件Gallery Plot 進(jìn)行GCIMS 指紋圖譜的對比。

采用設(shè)備自帶的Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析軟件及Library Search 定性軟件對葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)成分進(jìn)行分析，以n-酮C4～C9 為外標(biāo)參照物，通過插值法計(jì)算遷移時(shí)間與保留指數(shù)（RI）的對應(yīng)關(guān)系，獲得RI 值，并利用軟件內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

采用SPSS Statistics 21.0 軟件對獲取的葡萄酒樣品的各指標(biāo)數(shù)據(jù)做方差分析（ANOVA）和顯著性差異（＜0.05）分析。利用SPSS Statistics 21.0 軟件中的主成分分析方法（PCA），對所得葡萄酒的香氣成分指標(biāo)進(jìn)行降維處理，旋轉(zhuǎn)方法采用最大方差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程跟蹤情況

分別使用WL 鑒別培養(yǎng)基和賴氨酸瓊脂培養(yǎng)基對釀酒酵母和非釀酒酵母細(xì)胞增殖情況進(jìn)行培養(yǎng)和統(tǒng)計(jì)。釀酒酵母在賴氨酸培養(yǎng)基上不能生長，因而可以利用該培養(yǎng)基對非釀酒酵母的活細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；而兩類酵母在WL 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顏色差異較大，因而可以利用WL 培養(yǎng)基對釀酒酵母的生長情況進(jìn)行計(jì)數(shù)。

四種白葡萄酒發(fā)酵過程中的酵母細(xì)胞生長和還原糖消耗情況見圖1。在混合發(fā)酵樣品中，非釀酒酵母優(yōu)先接種，從圖1A、1B 和1C 中可以看出，美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母均能較好地適應(yīng)各自的發(fā)酵環(huán)境，在微氧條件下快速繁殖，細(xì)胞數(shù)量急劇增加。發(fā)酵24 h 后接種Lalvin D21，它能夠耐受非釀酒酵母產(chǎn)生的競爭性抑制，自接種之初便維持較高的發(fā)酵速率。非釀酒酵母在與釀酒酵母共發(fā)酵的環(huán)境中表現(xiàn)不同，戴爾有孢圓酵母的活細(xì)胞數(shù)仍在穩(wěn)步增加，耐熱克魯維酵母也能實(shí)現(xiàn)較好的生長，美極梅奇酵母卻被明顯抑制，活細(xì)胞數(shù)在混合發(fā)酵24 h 后開始下降。美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母分別于第2、3 和3 d 達(dá)到峰值，活細(xì)胞數(shù)分別達(dá)到7.39、8.12 和7.40 lg（CFU/mL）。釀酒酵母在M1、M2、M3 三個(gè)混合發(fā)酵樣品中達(dá)到生長峰值均在第4～5 d，活細(xì)胞數(shù)分別是8.17、7.68 和9.98 lg（CFU/mL）。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，醪液中的糖分和營養(yǎng)素大部分被消耗掉，酵母開始衰老死亡，數(shù)量逐漸減少。所有混合發(fā)酵樣品均在第8 d完成發(fā)酵。由圖1D 可知，M4 酒樣中的釀酒酵母D21 在接種 3 d 時(shí)活細(xì)胞數(shù)達(dá)到最高，之后菌體數(shù)量緩慢下降，并于第 7 d 完成發(fā)酵。綜上，混合發(fā)酵較之M4 樣品延長了1 d。此外，針對還原糖的消耗而言，在M1、M2 和M3 葡萄酒中，兩種酵母從共存起始至發(fā)酵結(jié)束（第2～8 d），還原糖消耗速率分別是23.6、19.8 和21.9 g/（L·d），而對照樣品（M4）中還原糖代謝速率為29.6 g/（L·d），說明釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵時(shí)能夠更快速的利用糖類促進(jìn)自身的生長及乙醇的合成。

圖1 白葡萄酒中酵母的增殖進(jìn)程和還原糖代謝過程Fig.1 Growth kinetics of yeasts and sugar consumption in white wines.

2.2 白葡萄酒理化指標(biāo)比較

發(fā)酵結(jié)束后對葡萄酒的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果經(jīng)均值化處理和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算后見表1。所有樣品的總糖含量都低于4 g/L，表明發(fā)酵比較充分，殘?zhí)呛枯^低，均為干型葡萄酒。酒精度在10.81%vol～11.58%vol 之間，M4 酒樣最高，M1 最低。pH 在3.45～3.60 范圍內(nèi)，M1、M2 和M4 之間差異較小，M3 最低?？偹嵩?.52～6.37 g/L 之間，以M3 最高，證實(shí)了耐熱克魯維酵母具有產(chǎn)酸能力。揮發(fā)酸的濃度在0.19～0.38 g/L之間，M4 葡萄酒的該數(shù)值較高。

表1 不同發(fā)酵模式釀造貴人香白葡萄酒理化指標(biāo)Table 1 Compositional profile of Italian Riesling white wines resulting from different fermentations

2.3 白葡萄酒揮發(fā)性組分的比較

發(fā)酵結(jié)束后，利用GC-IMS 對白葡萄酒的揮發(fā)性香氣組分進(jìn)行檢測，結(jié)果以三維譜圖（保留時(shí)間，遷移時(shí)間和峰強(qiáng)度）形式呈現(xiàn)。為了更直觀地反映每種葡萄酒揮發(fā)性組分的差異，使用俯視圖進(jìn)行表示（圖2），這是通過對離子遷移時(shí)間和反應(yīng)離子峰（RIP）的歸一化而獲得的橫坐標(biāo)1.0 處的紅色垂直線是反應(yīng)離子峰（RIP）。每個(gè)RIP 代表一種風(fēng)味化合物，顏色表示其信號強(qiáng)度。紅色表示高濃度，白色表示低濃度，紅色越深表示該揮發(fā)性組分的濃度越高。根據(jù)揮發(fā)性化合物氣相色譜保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間對葡萄酒揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行分析，共計(jì)鑒定出34 種揮發(fā)性化合物，包括酯類、醇類、醛類、酮類、酸類和萜烯類物質(zhì)。每種化合物的檢測結(jié)果經(jīng)均值化處理和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算后見表2。由表中數(shù)據(jù)可以看出，接種不同非釀酒酵母發(fā)酵葡萄酒的揮發(fā)性成分信號強(qiáng)度差異較大。此外，利用揮發(fā)性指紋圖譜快速對比出不同葡萄酒樣品風(fēng)味物質(zhì)之間的差異（圖3），圖中每一行代表一個(gè)葡萄酒揮發(fā)性組分的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號峰強(qiáng)度。從圖中可以清晰看出每種葡萄酒的完整揮發(fā)性組分信息以及樣品之間揮發(fā)性組分的差異。

表2 不同發(fā)酵模式釀造貴人香白葡萄酒揮發(fā)性組分的信號強(qiáng)度Table 2 Signal intensities of volatile compounds detected in Italian Riesling white wine resulting from different fermentations by GC-IMS

圖2 不同發(fā)酵模式釀造貴人香白葡萄酒中揮發(fā)性化合物的GC-IMS 圖譜Fig.2 GC-IMS patterns of volatile compounds in Italian Riesling white wines resulting from different fermentations

圖3 混合發(fā)酵對貴人香白葡萄酒揮發(fā)性指紋圖譜的影響Fig.3 Gallery plot of volatile fingerprints of Italian Riesling white wines resulting from combined fermentations.

2.3.1 酯類 酯類物質(zhì)是貴人香白葡萄酒的最主要風(fēng)味物質(zhì)，對酒的整體香氣具有重要貢獻(xiàn)。本研究共檢測到16 種酯類物質(zhì)，信號強(qiáng)度最高的是乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯。表2 結(jié)果顯示，M4 的酯類信號總強(qiáng)度最低，而混合發(fā)酵則顯著提高了多種揮發(fā)性酯類化合物的信號強(qiáng)度，包括異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、庚酸乙酯和辛酸乙酯。以己酸乙酯為例，該物質(zhì)能夠散發(fā)出花香果香等氣息，其在M4 中的強(qiáng)度為333.19，接種了三種商業(yè)化非釀酒酵母，即美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母進(jìn)行混合發(fā)酵后，該物質(zhì)在M1、M2 和M3 的強(qiáng)度分別提升了9.4、7.3 和7.4 倍。就三種混合發(fā)酵的葡萄酒而言，M1 和M2酒樣中的揮發(fā)性酯類總強(qiáng)度最高，M3 次之。丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸異戊酯能夠釋放類似草莓、香蕉、青蘋果等果香香氣，乙酸異丁酯呈花香，這些酯類化合物在M1 和M2 樣品中的濃度較高，可能增強(qiáng)上述兩種葡萄酒的果香或花香，提高其風(fēng)味復(fù)雜性。

2.3.2 醇類 葡萄酒中的揮發(fā)性醇類化合物主要來源于發(fā)酵、氨基酸的轉(zhuǎn)化及亞麻酸降解物的氧化。當(dāng)酒中的高級醇質(zhì)量濃度適中時(shí)，有助于提高葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性，但當(dāng)其濃度過高時(shí)，就會對感官質(zhì)量帶來負(fù)面影響。貴人香白葡萄酒中共檢測出6 種醇類物質(zhì)，總強(qiáng)度最高的是M1，M3 次之，最低的是M4。M1 樣品顯著提升了正丁醇、3-甲基丁醇和正己醇和含量，其它兩組混合發(fā)酵主要增加了丙醇和2-甲基丙醇的合成量。乙醇含量在各樣品間的差異較小。

2.3.3 醛酮類 貴人香葡萄酒中還檢測到了2 種醛類化合物（丁醛、苯甲醛）和3 種酮類（丙酮、2-戊酮、2,3-丁二酮）。苯甲醛具有苦杏仁氣味，在M4 酒樣中信號強(qiáng)度最高（618.388），分別是M1、M2 和M3樣品的2.3、3.0 和2.8 倍。2-戊酮具有果香味，丁二酮散發(fā)黃油味，這兩種酮類組分在M1 樣品中信號強(qiáng)度最高，可能使得M1 風(fēng)味更復(fù)雜。它們在M2 和M3 中含量差異較小，在M4 中濃度最低。

2.3.4 其它揮發(fā)組分 除揮發(fā)性酯類、醇類、醛類、酮類物質(zhì)以外，白葡萄酒中還檢測出2 種揮發(fā)酸類（乙酸、3-甲基丁酸）、3 種萜烯和雜環(huán)類物質(zhì)（-松油烯、苯乙烯、芳樟醇）和2 種內(nèi)酯類化合物（-辛內(nèi)酯和-壬內(nèi)酯）。乙酸是具有典型酸味的化合物，在M4 樣品中信號強(qiáng)度最高（4284.770），分別是M1、M2和M3 樣品的2.6、3.4 和4.1 倍。萜烯類和雜環(huán)類化合物會為葡萄酒帶來一定程度的花香甜味和草木味，富含這類化合物可能會賦予葡萄酒更加豐富的香氣風(fēng)格。與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比，戴爾有孢圓酵母—釀酒酵母混合發(fā)酵提升了-松油烯的含量（M2樣品），美極梅奇酵母—釀酒酵母混合發(fā)酵則增加了芳樟醇的合成量（M1 樣品）。-松油烯和芳樟醇分別具有檸檬、鈴蘭氣味，可能增強(qiáng)上述兩種葡萄酒的果香或花香，增強(qiáng)其風(fēng)味特征。

2.4 主成分分析

為了進(jìn)一步了解混合發(fā)酵對白葡萄酒中香氣成分的變化，對其進(jìn)行主成分分析（PCA）。由圖4 可得，PC1 和PC2 對總方差的解釋率分別為52.3%和37.5%，該兩個(gè)主成分對初始數(shù)據(jù)總方差的解釋率為89.8%，能體現(xiàn)葡萄酒的香氣成分信息。

圖4 貴人香白葡萄酒PCA 分類結(jié)果及與香氣組分的對應(yīng)關(guān)系Fig.4 PCA score plots of Italian Riesling white wines resulting from different fermentations and corresponding loadings of volatile variables.

酒樣M1 位于載荷圖中的第一象限，并與PC1和PC2 正向端含量較高的相關(guān)變量有關(guān)，包括己酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、乙酸己酯、-壬內(nèi)酯、-辛內(nèi)酯、己醇、丁醇、3-甲基丁醇、2-戊酮、2,3-丁二酮、芳樟醇。酒樣M2 和M3 比較類似，分布在第四象限，與PC2 負(fù)向端含量較高的辛酸乙酯、乙酸丙酯、丙酸乙酯、-松油烯、丙酮、丙醇有關(guān)。M4 與其它酒樣的香氣成分含量差異較大，位于第三象限，與PC1 負(fù)向端含量較高的甲酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、3-甲基丁酸、苯甲醛、苯乙烯有關(guān)。

2.5 香氣感官質(zhì)量分析

雖然采用HS-GC-IMS 對不同混合發(fā)酵模式的貴人香白葡萄酒揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測分析，但其結(jié)果不能完全體現(xiàn)出酒體的整體香氣質(zhì)量，因此由一個(gè)訓(xùn)練有素的15 人小組對酒體香氣進(jìn)行感官評估分析，評價(jià)樣品的香氣特征，包括果香、花香、植物香、蜂蜜、化學(xué)味及整體香氣，結(jié)果如圖5 所示。

圖5 貴人香白葡萄酒香氣品質(zhì)定量分析結(jié)果Fig.5 Average values of sensory evaluation scores of Italian Riesling white wines resulting from different fermentations.

酒樣M1 具有濃郁的果香，中等強(qiáng)度的花香，以及一定強(qiáng)度的蜂蜜、植物和化學(xué)味，整體香氣質(zhì)量得分最高。酒樣M2 和M3 的香氣質(zhì)量的評分結(jié)果比較相似，果香、花香的評分值是分別為M1 的83.1%～90.4%、84.9%～89.8%，但以上兩種屬性的評分M2均高于M3，而M3 的化學(xué)味強(qiáng)度高于M2。M4 在花香和果香屬性上的得分都低于其他三個(gè)酒樣，植物味和化學(xué)味評分均最高，整體香氣得分最低。

3 討論

3.1 混合發(fā)酵對酵母細(xì)胞增殖的影響

在混菌發(fā)酵的環(huán)境中，非釀酒酵母和釀酒酵母的共生可能會有多種表現(xiàn)，如相互促進(jìn)、互不干擾或產(chǎn)生抑制。在本文研究的混合發(fā)酵組合中，戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母能夠更好地與釀酒酵母共存，其自身的增殖未受到明顯影響，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)兩種非釀酒酵母在各自發(fā)酵環(huán)境中的活細(xì)胞數(shù)仍然達(dá)到6.31×10和9.77×10CFU/mL。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該兩類非釀酒酵母均屬于溫和發(fā)酵型酵母，增殖速率較慢，與釀酒酵母協(xié)同發(fā)酵時(shí)容易被釀酒酵母抑制，但某些菌株能夠分泌弒殺同環(huán)境中其它微生物的分泌物，以保障自身的優(yōu)勢存活。在本研究中戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母在混合發(fā)酵葡萄酒環(huán)境中的增殖均未見明顯抑制作用，可能也是上述原因所致。與以上結(jié)果形成鮮明對比的是M1 樣品，美極梅奇酵母的增殖被釀酒酵母顯著抑制，前者在發(fā)酵結(jié)束時(shí)的活細(xì)胞數(shù)僅為其峰值時(shí)的0.9%。該研究結(jié)果與Alexandre 團(tuán)隊(duì)和Sun 等比較一致，這可能與釀酒酵母分泌的某些針美極梅奇酵母生長有關(guān)的弒殺毒素或代謝物有關(guān)，使其在與釀酒酵母競爭的生長環(huán)境中處于劣勢，活細(xì)胞數(shù)迅速下降。

3.2 混合發(fā)酵對基本理化指標(biāo)的影響

本研究測試了三種非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對白葡萄酒基本組成的影響，發(fā)現(xiàn)與釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵相比，混合發(fā)酵明顯降低了酒體的酒精濃度。之所以出現(xiàn)上述結(jié)果，與它們利用糖類合成酒精的能力不及釀酒酵母有關(guān)。而揮發(fā)酸濃度下降則與所用釀造菌種低產(chǎn)乙酸的能力有關(guān)，雖然較早的研究一度認(rèn)為發(fā)酵時(shí)混入非釀酒酵母是造成葡萄酒品質(zhì)低劣的主要原因，但隨著研究的逐步深入，研究者和釀酒師發(fā)現(xiàn)在釀造實(shí)踐中非釀酒酵母能夠改善葡萄酒的風(fēng)味物質(zhì)組成，如增加揮發(fā)性酯類含量，降低乙酸含量，從而改善產(chǎn)品的整體品質(zhì)。再者，利用GC-IMS 獲得的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)也能說明該問題，M1、M2 和M3 酒樣中的乙酸信號強(qiáng)度顯著低于M4，說明混合發(fā)酵在一定程度上限制了乙酸的合成。本文中所測試的三種商業(yè)化非釀酒酵母，即美極梅奇酵母、戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母均屬于低產(chǎn)乙酸的菌株，對提高白葡萄酒的品質(zhì)具有積極作用。

3.3 混合發(fā)酵對揮發(fā)性組分的影響

揮發(fā)性香氣化合物的種類、含量及相互作用是形成葡萄酒香氣特征的化學(xué)基礎(chǔ)，因此對揮發(fā)性組分進(jìn)行有效分析是闡明葡萄酒香氣特征的前提。本研究運(yùn)用GC-IMS 技術(shù)分析不同葡萄酒的揮發(fā)性香氣指紋圖譜，通過信號峰的數(shù)量和信號強(qiáng)度進(jìn)而綜合判斷不同混合發(fā)酵模式對葡萄酒香氣化合物的影響和差異。

近年來非釀酒酵母引起廣泛關(guān)注的一個(gè)重要原因是其對葡萄酒香氣的積極影響，有望增加多種有益揮發(fā)性物質(zhì)的含量，如酯類、醇類、萜烯、硫醇等，從而提升果酒的香氣復(fù)雜性和品種特異性。以本研究中涉及的三種非釀酒酵母為例，據(jù)報(bào)道，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵能夠在一定程度上降低葡萄酒中乙醛、乙酸和部分高級醇的生成量，增加乳酸乙酯、己酸乙酯等乙酯類化合物濃度，并能釋放較高濃度的萜烯。但也有文獻(xiàn)指出戴爾有孢圓酵母對葡萄酒香氣無影響甚至有負(fù)面作用，可能與菌株特異性和發(fā)酵條件特異性等有關(guān)。據(jù)研究，美極梅奇酵母與釀酒酵母混合接種時(shí)可以增加酯類、萜烯、中鏈脂肪酸和高級醇產(chǎn)量，提高葡萄酒中的果香特征和總體得分。利用耐熱克魯維酵母作為產(chǎn)香酵母與釀酒酵母實(shí)施混合發(fā)酵時(shí)可以提高萜烯、異丁酸等揮發(fā)性組分的生成量，同時(shí)減少乙酸、乙醛等物質(zhì)的合成。

從本研究獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，較之釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵，接種戴爾有孢圓酵母的葡萄酒提升了丙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、異丁酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、-辛內(nèi)酯、2,3-丁二酮、-松油烯等多種酯類、酮類化合物的含量，但是對萜烯類化合物的釋放程度低于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵。萜烯類物質(zhì)一般都具有果香花香特征，多以非揮發(fā)性糖苷結(jié)合態(tài)存在，只有降解成揮發(fā)性游離態(tài)時(shí)才能增強(qiáng)感官香氣。本研究中測試的商業(yè)化戴爾有孢圓酵母適應(yīng)葡萄酒發(fā)酵環(huán)境時(shí)可能未完全激活其β-葡萄糖苷酶活性，所以未能將萜烯類前體物質(zhì)進(jìn)行徹底分解。M3樣品的檢測結(jié)果與M2 具有一定的相似性，因此在主成分分析時(shí)二者位于同一象限，距離接近。接種美極梅奇酵母的葡萄酒則全面提升了揮發(fā)性酯類、醇類、醛酮類的含量，多種具有花香、果香、品種香的化合物均在M1 樣品中信號強(qiáng)度最大，如異丁酸乙酯、乙酸異丁酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸乙酯、-辛內(nèi)酯、乙酸己酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、3-甲基丁醇、己醇、2-戊酮、2,3-丁二酮、芳樟醇等。不同非釀酒酵母的生理活性及代謝過程不同，對風(fēng)味物質(zhì)的影響也不同。本研究中M1 酒樣中揮發(fā)性芳香化合物的強(qiáng)度最高，說明該商業(yè)化美極梅奇酵母雖然不能完全適應(yīng)與釀酒酵母共存的葡萄酒發(fā)酵環(huán)境，但能仍高效合成與香氣合成有關(guān)的酶類，如酯酶、脂肪酶、-葡萄糖苷酶等，因此能較充分的分解多種香氣前體物質(zhì)，從而生成較多的芳香化合物。

3.4 白葡萄酒感官評定與香氣組分之間的關(guān)系

香氣感官質(zhì)量分析結(jié)果表明非釀酒酵母-釀酒酵母混合發(fā)酵對提升葡萄酒的香氣品質(zhì)貢獻(xiàn)較大，因?yàn)榛旌习l(fā)酵葡萄酒的評分均高于釀酒酵母單獨(dú)發(fā)酵。M1 貴人香白葡萄酒總體評分最高，M2 次之，其次是M3，得分最低的是M4。品評結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)中GCIMS 揮發(fā)性組分測定結(jié)果基本符合，M1 生成了豐富的酯類和萜烯類化合物，如己酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯、δ-辛內(nèi)酯、芳樟醇，以上這些揮發(fā)性化合物具有多樣的水果香氣和花香，因而能夠賦予M1 酒樣更濃郁的上述兩種屬性。M2 和M3 樣品中大多數(shù)化合物的信號強(qiáng)度低于M1，所以在多個(gè)香氣屬性上的評分均低于M1。M4 樣品中含有較高濃度的乙酸異丁酯、乙酸、丙酮等具有溶劑氣味的揮發(fā)性組分，因此化學(xué)味最為強(qiáng)烈，造成其總體香氣得分較低。

4 結(jié)論

本研究比較三種商業(yè)化非釀酒酵母，即戴爾有孢圓酵母、美極梅奇酵母和耐熱克魯維酵母分別與釀酒酵母混合發(fā)酵對貴人香白葡萄酒品質(zhì)的影響，特別是對發(fā)酵進(jìn)程、揮發(fā)性組分含量和香氣質(zhì)量的影響。研究結(jié)果顯示，在混合發(fā)酵過程中，美極梅奇酵母易被釀酒酵母所抑制，最大活細(xì)胞數(shù)僅有釀酒酵母的16.6%；而其它兩種產(chǎn)香酵母則能與釀酒酵母良好共存。就揮發(fā)性組分而言，美極梅奇酵母能夠增加貴人香白葡萄酒中多種與花香、果香有關(guān)的揮發(fā)性酯類、萜烯類化合物的合成量，如己酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、芳樟醇等，顯著提高了產(chǎn)品的感官品質(zhì)。戴爾有孢圓酵母和耐熱克魯維酵母對白葡萄酒的香氣品質(zhì)提高也有貢獻(xiàn)，增強(qiáng)了產(chǎn)品的復(fù)雜性，整體香氣得分分列第2 和第3 位。本研究對指導(dǎo)白葡萄酒及其他果酒的釀造生產(chǎn)具有重要的理論價(jià)值和借鑒意義，也凸顯了根據(jù)發(fā)酵目的合理選擇釀造微生物的重要性。