鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味成分與細(xì)菌種群演替的相關(guān)性研究

杜穎琦，范麗莉，歐昌榮,2, ，湯海青，溫海英

（1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江寧波 315800；2.浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315800；3.浙江藥科職業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，浙江寧波 315100）

鯖魚是一種常見的經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于西太平洋，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營養(yǎng)成分，尤其是二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，對(duì)心腦血管健康有益，但鮮魚在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中容易腐敗，嚴(yán)重限制了產(chǎn)品的保質(zhì)期，通過對(duì)魚肉發(fā)酵可以增強(qiáng)食品的感官特性和營養(yǎng)價(jià)值，以及延長食品保質(zhì)期，因此，發(fā)酵是許多國家的主要食物儲(chǔ)存方法。傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵魚是通過復(fù)雜的微生物活動(dòng)自然發(fā)酵，存在含鹽量高，發(fā)酵周期長，產(chǎn)品穩(wěn)定性難以控制以及顯著的風(fēng)味差異不利于大規(guī)模生產(chǎn)等缺點(diǎn)。采用現(xiàn)代生物發(fā)酵技術(shù)可以縮短發(fā)酵時(shí)間，穩(wěn)定和提高發(fā)酵魚的質(zhì)量，使發(fā)酵魚制品實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)。有研究報(bào)道，接種發(fā)酵劑植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌的發(fā)酵制品比自發(fā)發(fā)酵的產(chǎn)品更安全，并且在其中檢測到的生物胺更少。

發(fā)酵食品是一種復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，依賴于酶與微生物代謝活動(dòng)之間的相互作用。微生物群落在魚類發(fā)酵過程中不僅可作為酶和必需營養(yǎng)素的來源，并且其代謝演替決定了風(fēng)味物質(zhì)的組成和含量。揮發(fā)性風(fēng)味化合物及其前體是由發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)和脂類的降解和縮合反應(yīng)產(chǎn)生的，與微生物活性密切相關(guān)，因此，研究食品發(fā)酵過程中風(fēng)味形成的機(jī)理需要更關(guān)注微生物群落、風(fēng)味和風(fēng)味前體之間的關(guān)系。Illumina MiSeq 測序平臺(tái)用于rRNA的高通量測序，是微生物多樣性分析的重要研究工具。近年來，該方法已被用于研究各種發(fā)酵食品的微生物多樣性，包括發(fā)酵牛奶和奧地利酸面團(tuán)等。許多微生物在發(fā)酵魚中具有開發(fā)風(fēng)味的良好前景，逐漸引起研究者們的關(guān)注，已有研究人員成功研究了細(xì)菌成分與風(fēng)味化合物之間的相關(guān)性，但是關(guān)于細(xì)菌演替與發(fā)酵魚中揮發(fā)性風(fēng)味成分之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究采用氣相色譜-離子遷移譜技術(shù)鑒定出接菌鯖魚發(fā)酵過程中促進(jìn)風(fēng)味形成的特征揮發(fā)性化合物，并通過高通量測序手段顯示出鯖魚發(fā)酵過程中細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)變化，采用皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析了鯖魚發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味與細(xì)菌演替之間的相關(guān)性，確定接菌鯖魚在發(fā)酵過程中的風(fēng)味演替。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鯖魚 寧波路林水產(chǎn)品批發(fā)市場；植物乳桿菌24258（）、嗜酸乳桿菌6074（） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；瓊脂糖、細(xì)菌DNA 提取試劑盒 美國OMEGA 科技公司；DL2000、DNA Marker 上海意泓生物科技有限公司；6×Load Buffer 北京全式金生物技術(shù)有限公司。

H1850R 高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；JY-SPCT 電泳槽 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；NanoDrop-1000 微量分光光度計(jì) 美國BIO-RAD 公司；ArktikPCR 擴(kuò)增儀 賽默飛公司；Flavour Spec 氣相色譜-離子遷移譜（配有LAV Laboratory Analytical Viewer 和Library Search分析軟件） 德國G.A.S 公司；H1850-R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司；AL204天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；Illumina MiSeq測序儀 美國Illumina 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 混合發(fā)酵劑的制備 參考Liao 等的菌種活化方法將植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，再以3%（v/v）接種量接種于肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)培，并通過高速冷凍離心機(jī)在4 ℃下以5000 g 離心10 min 后棄去培養(yǎng)液收集菌體沉淀，加入適量無菌生理鹽水（0.9% NaCI，w/v）洗滌兩次后，調(diào)至菌液濃度為10～10CFU/g，按照植物乳桿菌發(fā)酵劑和嗜酸乳桿菌發(fā)酵劑體積比為1:1 制備混合發(fā)酵劑，將菌液于4 ℃保存，并于24 h 內(nèi)使用。

1.2.1.2 鯖魚樣品的發(fā)酵 用蒸餾水洗滌、去頭去尾，剔除魚身中心主要骨刺并取出內(nèi)臟，洗凈腹腔黑膜，瀝干后切成5 cm×3 cm×3 cm 的小塊。將鯖魚塊與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的食鹽，2%的蔗糖（以瀝干魚肉計(jì)重）混合翻拌混勻，壓實(shí)，在4 ℃條件下腌制24 h，中間翻拌1～2 次，使魚塊腌制均勻。腌制結(jié)束后放置陰涼通風(fēng)處，自然風(fēng)干至表面沒有水分后接種2%（v/v）的混合發(fā)酵劑，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，分別在第0、6、12、18、24 d 取樣測定鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味化合物和細(xì)菌多樣性變化，并進(jìn)一步通過皮爾森分析兩者相關(guān)性。樣品按發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行編號(hào)（如MF06 表示發(fā)酵第6 d 樣品）。

1.2.2 魚肉DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

1.2.2.1 樣品預(yù)處理 無菌條件下稱取10 g 的發(fā)酵鯖魚樣品，加入10.0 mL 滅菌生理鹽水，渦旋后離心5 min（4 ℃，2000×g）收集上清液，用四層紗布過濾，將上清液再次離心10 min（4 ℃，10000×g），收集菌體沉淀。

1.2.2.2 DNA 提取 按照DNA 試劑盒說明提取魚肉樣品DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測DNA提取結(jié)果，用NanoDrop-1000 微量分光光度計(jì)測DNA 純度，將檢測合格的DNA 置于在-80 ℃冰箱備用。

1.2.2.3 PCR 擴(kuò)增及測序 魚肉用上游引物341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和下游引物806R（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的V3～V4 高變區(qū)，提取的DNA 用熱循環(huán)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增體系總量為50 μL，包括2×Taq Master Mix（Dye）25 μL，正反向引物各2 μL、Template DNA 1 μL，補(bǔ)雙蒸水（ddHO）至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃擴(kuò)展2 min。利用PCR 純化試劑盒對(duì)瓊脂糖凝膠回收的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后用Nanodrop 2000 超微量分光光度計(jì)定量并按每個(gè)樣本的測序要求進(jìn)行混合，最后使用Illumina HiSeq 2500 平臺(tái)對(duì)純化的混合樣本進(jìn)行細(xì)菌rRNA 基因的高通量測序分析。為避免不同測序深度引起偏差對(duì)每個(gè)樣品隨機(jī)選取均一化到50000 序列用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析。

1.2.3 揮發(fā)性化合物檢測

1.2.3.1 頂空進(jìn)樣條件 將2.5 g 樣鯖魚品置于20 mL頂空玻璃取樣瓶中；頂空孵化溫度40 ℃；孵化時(shí)間20 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；進(jìn)樣體積500 μL；進(jìn)樣針溫度85 ℃。

1.2.3.2 GC 條件 色譜柱：石英毛細(xì)管柱（15 m×0.53 mm，0.5 μm）；色譜柱溫度：60 ℃；載氣：N（純度≥99.999%）；載氣流速：開始2 mL/min；2～10 min，2～20 mL/min；10～20 min，20～100 mL/min；20～30 min，100～150 mL/min；分析時(shí)間：25 min。

1.2.3.3 IMS 檢測條件 IMS 漂移裝置安裝在GC的頂部，漂移管長度：98 mm；漂移管溫度：45 ℃；漂移氣：N；漂移氣流量：150 mL/min；放射源：射線。

1.2.4 相關(guān)性分析 將混和接菌鯖魚發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的改變之間進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析，結(jié)果顯示細(xì)菌群落的變化與揮發(fā)性有機(jī)化合物的產(chǎn)生具有相關(guān)性。用Origin 作圖，在屬水平上相對(duì)豐度R＞1%，0.01＜＜0.05 的用*標(biāo)記；相對(duì)豐度R＞1%，＜0.01 用**標(biāo)記。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用FLASH 軟件（version1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接二端序列；通過QIIME（quantitative insights into microbial ecology,http://qiime.org/）軟件處理樣品微生物群落的擴(kuò)增子基因序列，去除質(zhì)量較差的序列，包括質(zhì)控和去除嵌合體；最后將相似性大于97%的序列聚類成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTUs），去除古菌、葉綠體和非細(xì)菌序列及僅有一條序列的OTUs；采用Qiime 軟件計(jì)算細(xì)菌群落豐富度和多樣性；采用GC-IMS 設(shè)備自帶的LAV（Laboratory Analysis tical Viewer）分析軟件，GC-IMS Library Search 軟件內(nèi)置的2014NIST 數(shù)據(jù)庫和IMS 數(shù)據(jù)庫對(duì)特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析；采用LAV 中Reporter和Gallery 插件程序構(gòu)建不同樣品間揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異圖譜和指紋圖譜；利用SPSS11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，Origin Pro9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯖魚發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律

圖1 為根據(jù)LAV 分析得到的鯖魚發(fā)酵過程中的GC-IMS 三維譜圖。可以直觀看出，鯖魚樣品在發(fā)酵過程中揮發(fā)性有機(jī)物的種類較為相似，組間差異性觀察存在困難。為了更好地橫向比較分析貯藏時(shí)間對(duì)鯖魚發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的影響，通過采用差異對(duì)比模式，將圖1 進(jìn)行降維處理得到圖2。如圖2 所示，縱坐標(biāo)為保留時(shí)間，橫坐標(biāo)為遷移時(shí)間，紅色豎線為反應(yīng)離子峰，其兩側(cè)的每一點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物。取發(fā)酵第0 d 的樣品（MF00）作為參比，其他樣品的譜圖扣除參比。若背景為白色，表示揮發(fā)性物質(zhì)濃度一致；若背景為藍(lán)色，表示揮發(fā)性物質(zhì)濃度低于參比；若背景為紅色，表示揮發(fā)性物質(zhì)濃度高于參比。可以看出，大多數(shù)信號(hào)保留時(shí)間范圍為100～200 s，漂移時(shí)間為1.0～1.5 s，在相同的保留時(shí)間和漂移時(shí)間下，樣品的揮發(fā)性物質(zhì)含量各不相同。隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，樣品揮發(fā)性物質(zhì)含量明顯增多，與發(fā)酵第0 d 相比，第6～24 d 的樣品在200～400 s 的保留時(shí)間范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)更多紅點(diǎn)，尤其是發(fā)酵后期顏色更深，表明隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，揮發(fā)性化合物的種類和濃度逐漸增加。

圖1 鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS 三維譜圖Fig.1 GC-IMS three-dimensional spectrogram of volatile flavor compounds during mackerel fermentation

圖2 鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-IMS 二維譜圖Fig.2 GC-IMS two-dimensional spectrogram of volatile flavor compounds during mackerel fermentation

通過GC-IMS 技術(shù)對(duì)鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組分進(jìn)行定性分析，共鑒定出酸類、醛類、醇類、酮類、酯類和呋喃類等51 種物質(zhì)（見表1）。為進(jìn)一步比較鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化情況，利用LAV 軟件的GalleryPlot 插件，根據(jù)各物質(zhì)組分在遷移譜中的信號(hào)峰生成指紋圖譜，如圖3 所示，橫坐標(biāo)表示揮發(fā)性化合物，縱坐標(biāo)表示不同樣品名稱，數(shù)字編號(hào)表示未定性的化合物，已定性的化合物用其名稱表示。其中，每行代表檢測樣品的所有信號(hào)峰，每列代表不同樣品同一揮發(fā)性物質(zhì)的信號(hào)峰。從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的離子峰排列可明顯看出，鯖魚樣品在第0 d 時(shí)含有的揮發(fā)性有機(jī)化合物以醛類、酮類物質(zhì)居多，主要包括己醛、丙酮、2,4-庚二烯醛和2-戊烯醛等，此外還含有少量酸類和酯類物質(zhì)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，鯖魚中揮發(fā)性有機(jī)物的種類和濃度都有所增加，發(fā)酵第6 d，己醇、2-丁酮、丙酮、2-庚酮、3-甲基丁醛含量顯著增加，3-羥基-2-丁酮和3-甲基丁醛的含量明顯高于其他組，并產(chǎn)生了富含香氣成分的乙酸乙酯等新的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，這是由于混合接菌的鯖魚發(fā)酵過程中，在微生物及各種酶的作用下，一些大分子類物質(zhì)被水解成小分子有機(jī)物。其中，醛類主要來源于脂質(zhì)氧化，賦予發(fā)酵鯖魚令人愉悅的青草或奶酪香味。酯類可賦予發(fā)酵鯖魚香甜的果香味。酮類被認(rèn)為是對(duì)發(fā)酵鯖魚風(fēng)味具有貢獻(xiàn)的揮發(fā)性成分，賦予發(fā)酵鯖魚花香及果香味，同時(shí)有助于消減魚肉腥味。直至發(fā)酵第12 d，酯類、酮類含量增加，醛類相對(duì)含量減少，形成了獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味，其中乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸異戊酯逐漸增加，之后繼續(xù)發(fā)酵，酯類化合物的相對(duì)含量變化不明顯，2-丁酮和2-庚酮含量顯著降低，其含量之后基本無變化。2-庚醛（二聚體）、2-戊烯醛（二聚體）、2-庚酮（單體）等一些相對(duì)分子較大的物質(zhì)含量增加，有辛辣和尖刺味的3-甲基丁酸及2-丁酮含量逐漸增加，并且具有水果香味的3-甲基丁醛含量逐漸降低，導(dǎo)致發(fā)酵鯖魚風(fēng)味不協(xié)調(diào)，鯖魚發(fā)酵達(dá)到末期。由此可見，接菌發(fā)酵可以增加魚肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，使發(fā)酵魚肉風(fēng)味更加渾厚，氣味延綿。

圖3 鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)指紋譜圖Fig.3 Fingerprint spectrum of volatile flavor compounds during mackerel fermentation

表1 鯖魚發(fā)酵過程中的主要揮發(fā)性化合物Table 1 Volatile compounds during mackerel fermentation

2.2 鯖魚發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成

通過對(duì)混合接菌鯖魚發(fā)酵過程中微生物在門和屬水平上的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。發(fā)酵魚肉的細(xì)菌菌群主要有厚壁菌門（Firmicutes）、變形桿菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）和纖維桿菌門（Fibrobacteres）。在整個(gè)發(fā)酵過程中厚壁菌門的相對(duì)豐度最高，其它門只占少數(shù)。發(fā)酵第6 d，厚壁菌門相對(duì)豐度從97.0%下降至91.38%，而在發(fā)酵中后期，其相對(duì)豐度逐漸增加到98.81%?？梢?，厚壁菌門為發(fā)酵鯖魚中的優(yōu)勢微生物，接種的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌均屬于厚壁菌門，發(fā)酵中后期其相對(duì)豐度不斷增加，抑制了相關(guān)腐敗微生物生長；變形菌門的相對(duì)豐度先增加后減少最后又略微上升。

圖4 鯖魚發(fā)酵過程中細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria at phylum during mackerel fermentation

在屬的水平上細(xì)菌共得到41 個(gè)屬，由圖5 可知，在發(fā)酵第0 d 乳桿菌屬（）、巨型球菌屬（）和葡萄球菌屬（）的相對(duì)豐度較大，是該發(fā)酵時(shí)期的優(yōu)勢微生物，三者的相對(duì)豐度分別為81%、10%和6.14%，這是由于魚肉自身攜帶的微生物在適宜的條件下繁殖，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，接種的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌開始迅速增殖，抑制了大量微生物繁殖，僅有少量適應(yīng)酸性環(huán)境的微生物生長，細(xì)菌豐富度減少。發(fā)酵第6 d，乳桿菌屬（）的相對(duì)豐度顯著下降到46.74%（＜0.05），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，乳桿菌屬（）的相對(duì)豐度持續(xù)增加，這與Jiang 等的研究一致。發(fā)酵末期相對(duì)豐度達(dá)到94%，這是由于乳桿菌屬（）含有許多酶系，能產(chǎn)生能夠分解脂肪酸、亞硝胺，產(chǎn)生控制內(nèi)毒素等多種抗菌代謝產(chǎn)物，此外，乳桿菌屬（）與食品發(fā)酵過程中氨基酸的代謝有關(guān)，可以促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味形成。巨型球菌屬（）在發(fā)酵過程中相對(duì)豐度一直減少，可能是發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)物的影響。葡萄球菌屬（）在發(fā)酵第6 d 急劇增加到37.6%，隨著發(fā)酵進(jìn)行迅速下降至3.92%，之后趨于穩(wěn)定，這可能是由于發(fā)酵過程中酸化作用和厭氧條件所致。該結(jié)果與Casaburi 等的報(bào)告結(jié)果一致，即酸化抑制了發(fā)酵香腸中葡萄球菌的生長。此外，也有研究報(bào)道，葡萄球菌可抑制脫羧酶生長，從而減少生物胺的產(chǎn)生，提高發(fā)酵魚發(fā)酵質(zhì)量。

圖5 鯖魚發(fā)酵過程中細(xì)菌屬水平的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of bacteria at genus level during mackerel fermentation

除了占主導(dǎo)優(yōu)勢的乳桿菌屬、葡萄球菌屬和巨型球菌外，還有一些相對(duì)豐度較低的細(xì)菌存在發(fā)酵魚樣品中，如芽孢桿菌屬（）、不動(dòng)桿菌屬（）、嗜甲基菌（）、假單胞菌（）、嗜冷桿菌（）、青枯菌（）、馬賽菌（）、鞘氨醇單胞菌屬（）、糖單胞菌（）、魏斯氏菌屬（）等。其中，芽孢桿菌（）能夠分泌淀粉酶和糖化酶，主要與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)如吡嗪類、酮類、醛類、醇類的產(chǎn)生有關(guān)，部分芽孢桿菌屬（）有胺氧化酶或胺脫氫酶活性，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生抗菌活性，可以有效降低生物胺的積累。鞘氨醇單胞菌（）生命力旺盛，分布范圍廣泛，是海洋厭氧性超微細(xì)菌的代表，也是研究較多的藻類毒素的降解菌。有研究表明，不動(dòng)桿菌（）含量的增多會(huì)加速水產(chǎn)品品質(zhì)的劣變進(jìn)程，對(duì)水產(chǎn)品的品質(zhì)特性有顯著影響。馬賽菌屬（）是產(chǎn)生甘露聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶等多糖水解酶的菌株。魏斯氏菌（）是一種產(chǎn)于發(fā)酵食品中的乳酸菌，在食品發(fā)酵過程中，能夠發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、麥芽糖等產(chǎn)生乳酸，賦予發(fā)酵食品新的感官質(zhì)量和風(fēng)味質(zhì)量。糖單胞菌（）的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑制作用。綜上，乳桿菌屬（）、巨型球菌屬（）、葡萄球菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、不動(dòng)桿菌屬（）、嗜甲基菌屬（）、假單胞菌屬（）、魏斯氏菌屬（）等共同構(gòu)成了發(fā)酵鯖魚的細(xì)菌群落，為發(fā)酵鯖魚特征風(fēng)味的形成和產(chǎn)品安全特性提供良好的環(huán)境。

2.3 鯖魚發(fā)酵過程中微生物多樣性分析

利用Alpha 多樣性可直觀反應(yīng)微生物群落的豐富度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計(jì)分析指數(shù)如Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Richness 指數(shù)和Simpson 指數(shù)等。Chao1 指數(shù)數(shù)值越大，表明群落中的物種種類越多，豐富度越高。Shannon 和Richness 指數(shù)值越大，Simpson 值越小，表明群落多樣性越高。多樣性指數(shù)分析如表2 所示，鯖魚發(fā)酵過程中細(xì)菌多樣性整體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。發(fā)酵早期，細(xì)菌群落多樣性和豐度較高，可能由于經(jīng)過一段時(shí)間的微生物代謝，環(huán)境中的代謝產(chǎn)物得到積累，能夠?yàn)楦嗟奈⑸锷L提供營養(yǎng)物質(zhì)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌種群多樣性逐漸降低，這說明接種的發(fā)酵菌株能很好的適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，產(chǎn)生大量酸類物質(zhì)，從而抑制了其他不適應(yīng)較高酸性發(fā)酵環(huán)境微生物的生長，物種數(shù)量也隨之下降，同時(shí)發(fā)酵過程中乳酸菌具有較強(qiáng)酸的耐受力，逐漸成為豐度較高的主體，導(dǎo)致微生物多樣性不斷降低。吳燕燕等對(duì)腌干魚加工過程中微生物進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)腌制過程中魚類細(xì)菌多樣性呈先升后降的趨勢。大量研究表明，發(fā)酵水產(chǎn)品在貯藏或加工過程中優(yōu)勢微生物的不斷積累，抑制了其他微生物的生長，導(dǎo)致微生物多樣性降低。

表2 鯖魚發(fā)酵過程中微生物群落的多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index of microbial communities during mackerel fermentation

為研究樣品的取樣量能否代表原樣品物種豐富度，對(duì)樣品的個(gè)數(shù)和物種的種類做稀釋分布曲線，從而評(píng)估所構(gòu)建的文庫的覆蓋率是否達(dá)到飽和。結(jié)果見圖6，隨著測序深度的增加，Chao1 和Shannon指數(shù)曲線基本趨于平坦，表明測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度能夠反映出樣品中絕大多數(shù)微生物的物種信息。

圖6 鯖魚發(fā)酵過程中魚肉細(xì)菌群落Chao1 指數(shù)（a）和Shannon 指數(shù)（b）分析Fig.6 Curve analysis of Chao1 index (a) and Shannon index (b) of bacterial community in mackerel during fermentation

2.4 鯖魚發(fā)酵過程中微生物群落與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)性分析

水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物等大分子化合物是風(fēng)味物質(zhì)形成的前體，在微生物及其相關(guān)酶系作用下，這些物質(zhì)發(fā)生水解，參與氨基酸代謝及脂質(zhì)代謝等途徑，形成特征風(fēng)味物質(zhì)。由圖7 可知，與揮發(fā)性有機(jī)化合物相關(guān)的細(xì)菌有22 個(gè)屬，其中乳桿菌屬、葡萄球菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬和鞘脂菌屬對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成有顯著影響。乳桿菌屬與戊酮、乙醇、3-羥基-2-丁酮等物質(zhì)存在極強(qiáng)的正相關(guān)，與3-甲基丁酸、3-辛酮等存在負(fù)相關(guān)性；葡萄球菌與酯類化合物存在極強(qiáng)的正相關(guān)，與酮類物質(zhì)存在負(fù)相關(guān)；不動(dòng)細(xì)菌屬與9 種物質(zhì)存在正相關(guān)，與10 種物質(zhì)存在負(fù)相關(guān)，其中與醛類、酮類的相關(guān)性比較強(qiáng)。魏斯氏菌、鞘脂桿菌、不動(dòng)桿菌、嗜甲基菌等微生物雖然相對(duì)豐度不高，但與揮發(fā)性風(fēng)味的形成存在很大的相關(guān)性，例如，魏斯氏菌與吡嗪類、酮類、酸類、酯類等15 種揮發(fā)性物質(zhì)存在相關(guān)性，鞘脂桿菌與多種酮類物質(zhì)存在很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性?；旌暇杲臃N的鯖魚發(fā)酵過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化與微生物群落演替聯(lián)系緊密，多種微生物共同作用不僅提高了發(fā)酵鯖魚的穩(wěn)定性，而且使其風(fēng)味更加濃郁協(xié)調(diào)。

圖7 鯖魚發(fā)酵過程中細(xì)菌菌落與揮發(fā)性化合物相關(guān)性熱圖Fig.7 Mogram of correlation between bacterial colony and volatile compounds during mackerel fermentation

3 結(jié)論

本研究基于鯖魚發(fā)酵過程中細(xì)菌群落組成和關(guān)鍵氣味物質(zhì)的特征，揭示了鯖魚發(fā)酵過程中風(fēng)味演替規(guī)律。主要結(jié)論如下：混合接種鯖魚發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量逐漸增加。發(fā)酵初期以醛類和酮類為主，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酯類和酮類化合物相對(duì)含量增多，共同構(gòu)成了發(fā)酵魚肉獨(dú)特的風(fēng)味；接種鯖魚發(fā)酵過程中微生物豐度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈先上升后下降趨勢。門水平上分析表明，厚壁菌門是發(fā)酵鯖魚中的優(yōu)勢微生物。屬水平分析表明，細(xì)菌優(yōu)勢菌屬從發(fā)酵前期的乳桿菌屬（）、巨型球菌屬（）和葡萄球菌屬（）逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橹?、后期的乳桿菌屬（），此外，豐度較低的芽孢桿菌屬（）、不動(dòng)桿菌屬（）、嗜甲基菌屬（）、假單胞菌屬（）、魏斯氏菌屬（）等在發(fā)酵過程中也扮演著重要作用，共同構(gòu)成了發(fā)酵鯖魚的細(xì)菌群落，為發(fā)酵鯖魚特征風(fēng)味的形成和產(chǎn)品安全特性提供良好的環(huán)境；利用皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析接菌鯖魚發(fā)酵過程中微生物群落演替與揮發(fā)性風(fēng)味形成的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)微生物菌落結(jié)構(gòu)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)關(guān)系復(fù)雜，其中乳桿菌屬、葡萄球菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬和鞘脂菌屬對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成有顯著影響，豐度較低的魏斯氏菌、鞘脂桿菌、不動(dòng)桿菌、嗜甲基菌等微生物與揮發(fā)性風(fēng)味的形成也存在顯著正相關(guān)性，可見揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果。本研究為深入了解鯖魚發(fā)酵的本質(zhì)，探索揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與微生物的關(guān)系及為人工發(fā)酵劑的生產(chǎn)和發(fā)酵調(diào)控提供理論依據(jù)。