超聲處理對蕓豆蛋白理化性質(zhì)及抗氧化能力的影響

周欣雨，佐兆杭，王 穎,2,3,4, ，么 楊 ，孫 維，張乃丹，龐惟俏

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319；3.糧食副產(chǎn)物加工與利用教育部工程研究中心，黑龍江大慶 163319；4.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點實驗室，黑龍江大慶 163319；5.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

隨消費者生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變，植物性蛋白倍受青睞。研究發(fā)現(xiàn)增加植物蛋白有助于預(yù)防糖尿病、增強心肺功能和抑制腫瘤細胞。蕓豆作為食用豆中的主要品種之一，種植范圍廣，成本低，廣泛被應(yīng)用于食品加工。蕓豆的蛋白質(zhì)含量豐富（23%），含脂量低，具有很高藥用和保健價值，心臟病和高脂血癥患者食用優(yōu)選，且蕓豆蛋白多肽的抗氧化活性較高，可提高機體免疫能力，抑菌和抗病功效突出。然而，因蕓豆蛋白表面電荷低，水溶性差，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中不穩(wěn)定，使蕓豆蛋白不能全面滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。因此，利用綠色、環(huán)保的物理技術(shù)，來改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，從而提高人們對植物蛋白的利用率是十分必要的。

超聲波技術(shù)被公認為一種實用高效的提取技術(shù)，與熱工藝不同，超聲波在食品蛋白行業(yè)的實施更簡單、更快、更便宜，能耗更低，設(shè)備污染更低，操作條件更便利、無菌。隨著超聲處理產(chǎn)生的空化作用和機械作用，導(dǎo)致分子間鍵的斷裂和重新形成，可降低液滴尺寸，提高乳液穩(wěn)定性，改變蛋白質(zhì)溶解度等，如改變豌豆蛋白、大豆蛋白的乳化性等性能，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。但目前豌豆蛋白、大豆蛋白的研究主要是超聲對其理化及結(jié)構(gòu)特性的影響，對蛋白質(zhì)不同超聲條件以及超聲前后抗氧化能力鮮有報道。本研究以蕓豆蛋白為原料，研究了超聲處理對蕓豆蛋白理化及抗氧化能力的影響，旨為拓寬蕓豆蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，為蕓豆蛋白在相關(guān)功能性食品的研發(fā)與加工中提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂蕓豆蛋白（蛋白質(zhì)量分數(shù)90%） 三原天域生物制品有限公司；T-AOC 試劑盒、鐵離子還原力試劑盒 上海博湖生物科技有限公司；5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、乙二胺四乙酸 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；甘氨酸 上海吉至生化科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷 天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美國Sigma 公司；以上試劑 均為分析純。

AR2140 電子天平 常州勵岸寶機械設(shè)備科技有限公司；DL-360B 型超聲波清洗機、FD-1A-50 型冷凍干燥機、JIDI-18D 型臺式多用途高速離心機上海之信儀器有限公司；UV759 型紫外分光光度計愛來寶醫(yī)療科技有限公司；PHS-3C pH 計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；NLM100 均質(zhì)機 上海人和科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲處理蕓豆蛋白樣品的制備 參考Tomotake等的方法制備超聲后蕓豆蛋白樣品，略有改動。20 g 蕓豆蛋白粉溶解于100 mL 蒸餾水中并攪拌均勻，分別作用于不同超聲功率（160、400 W），不同超聲時間（10、20、30 min），樣品為A、A、A、B、B、B。超聲結(jié)束將樣品平鋪放入容器中，-80 ℃冰箱凍12 h 后通過凍干機干燥成粉末，于4 ℃冰箱密封保存。

1.2.2 蕓豆蛋白水解度測定 利用鄰苯二甲醛（OPA）法對蕓豆蛋白進行水解度測定。用紫外可見光分光光度計測定其吸光度（340 nm），吸光度要在精準反應(yīng)2 min 后測定。按照下列公式進行計算：

式中：0.9516 meqv/L：去離子水固定參數(shù)；OD：吸光度；h：水解的肽鍵數(shù)；h：總肽鍵數(shù)，（蕓豆蛋白為7.42 mmol/g）；SerineNH：毫摩SerineNH/g 蛋白；X：待測樣品重量（g）；P：待測樣品濃度（g/mL）；、：分別用常數(shù)1.00、0.40 表示。

1.2.3 蕓豆蛋白溶解度測定 取0.5 g 蕓豆蛋白粉加入30 mL 去離子水，500 r/min 下攪拌1 h，8000 r/min離心15 min，取上清液，微量凱氏定氮法測定蛋白含量。溶解度為上清液中蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)量濃度的百分比度。

1.2.4 蕓豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量測定 將10 mmol/L 5,5'-二硫代-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）溶解在0.1 mol/L Tris-甘氨酸緩沖液（2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）中得到Ellman’s 試劑。取50 μL DTNB 緩沖液與2 mL 濃度為0.01 g/mL 的樣品溶液混合，25 ℃避光反應(yīng)30 min。紫外分光光度計測定吸光度（412 nm），以緩沖液為空白，測定游離巰基含量。在測定總巰基含量時，將適量的蛋白質(zhì)樣品溶解于尿素-Tris-甘氨酸緩沖液（10 mol/L 尿素，2.5% SDS，0.004 mol/L EDTA，0.09 mol/L 甘氨酸，0.086 mol/L Tris，pH8.0）和-巰基乙醇（-Me；加入50 μL），搖勻后在25 ℃暗室孵育60 min。8000 r/min 離心20 min，將得到的上清溶于5 mL 濃度為12%的TCA（w/v）中，重復(fù)3 次。離心后將沉淀溶解于2.5 mL 的Tris-甘氨酸溶液中，加入50 μL DTNB，25 ℃避光孵育30 min。最后，用紫外分光光度計在412 nm 處測量吸光度。巰基含量的計算公式如下：

式中：A為樣品在412 nm 處減去空白后的紫外吸光度值；D 為樣品稀釋倍數(shù)；C 為樣品濃度（g/mL）；二硫鍵含量由總巰基含量減去游離巰基含量再除以二得到。

1.2.5 蕓豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性測定 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定參考Wu 等報道的方法，用磷酸鹽緩沖液溶液（0.1 mol/L，pH7.0）配制蕓豆蛋白溶液，使蛋白的質(zhì)量濃度為0.2%，蛋白溶液與大豆油的體積比為4:1，配置好溶液后，利用均質(zhì)機使其形成乳狀液（1000 r/min，1 min），均質(zhì)液靜止0 和10 min后從離心管底部0.5 cm 處取50 μL 漿液，并加入5 mL質(zhì)量分數(shù)為0.1%的SDS 溶液中制成混合液，振蕩混勻，在500 nm 處測定混合液吸光度。0 min 時混合液的吸光度值記為A，10 min 時混合液的吸光度值為A，以0.1%的SDS 溶液做空白對照，計算公式如下：

式中：θ 表示乳化液中的油相體積分數(shù)（25%）。

1.2.6 蕓豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性測定 配制100 mL 蛋白質(zhì)量分數(shù)為5%的蛋白分散液，均質(zhì)（8000 r/min，2 min），均質(zhì)20 s 停頓20 s，然后快速轉(zhuǎn)入量筒中，記錄剛轉(zhuǎn)入量筒的泡沫體積V，并分別記錄在2、30 min 時泡沫的體積為V、V。

1.2.7 蕓豆蛋白抗氧化能力測定

1.2.7.1 蕓豆蛋白總抗氧化能力測定 取0.5 g 蕓豆蛋白粉加入50 mL 去離子水中，混合均勻。采用TAOC 試劑盒測定。

1.2.7.2 蕓豆蛋白DPPH 自由基清除能力測定 參考張雪春等的方法略有改動。乙醇為溶劑配制濃度為2×10mol/L 的DPPH 自由基溶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?.5 mL 濃度為0.01 g/mL 樣品溶液，加入4 mL DPPH 自由基溶液混勻，室溫靜置30 min。利用紫外分光光度計測定其吸光值A(chǔ)（517 nm）；同時取4 mL 2×10mol/L DPPH 自由基溶與0.5 mL 60%乙醇混勻，測定其吸光值A(chǔ)，計算公式如下:

1.2.7.3 蕓豆蛋白鐵離子還原能力測定 取0.5 g 蕓豆蛋白粉加入50 mL 去離子水中，混合均勻。使用鐵離子還原力試劑盒進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均進行三次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。利用Excel、SPSS 22.0 等進行數(shù)據(jù)的處理和分析，采用Origin 2018 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對蕓豆蛋白水解度的影響

超聲處理對蕓豆蛋白水解度的影響如圖1 所示。與未處理組相比，蕓豆蛋白水解度隨著超聲功率與時間的增加而提高，當超聲時間20 min、功率400 W（B）時蕓豆蛋白的水解度增強效果最顯著（＜0.05），由3.34%增加至20.10%。分析是由于超聲處理產(chǎn)生的空化效應(yīng)改變了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露，增加了底物與活性部位的結(jié)合，使蛋白質(zhì)水解度提高，這一結(jié)果與杜雙奎等研究一致。但當超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時（B），水解度開始下降，分析是由于超聲時間過長，使蕓豆蛋白暴露在外的與底物結(jié)合的活性部位被破壞，導(dǎo)致水解度開始降低。

圖1 不同超聲條件對蕓豆蛋白水解度的影響Fig.1 Effects of different ultrasonic conditions on protein hydrolysis degree of kidney bean

2.2 超聲處理對蕓豆蛋白溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)之一。如圖2 所示，當超聲時間10 min、功率160 W（A）時，蕓豆蛋白溶解度變化并不顯著（＜0.05），在A（20 min，160 W）至B（20 min，400 W）時，蕓豆蛋白溶解度隨著超聲時間及功率的增加而顯著提高（＜0.05），在B時蛋白溶解度達到最大值79.43%。超聲產(chǎn)生的空化作用與機械效應(yīng)可將蛋白質(zhì)聚集體顆粒發(fā)生解聚現(xiàn)象，使蛋白質(zhì)聚集體粒徑降低，增強蛋白質(zhì)與水相互作用，從而增加蛋白質(zhì)溶解度。當超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時（B），蛋白質(zhì)溶解度發(fā)生下降現(xiàn)象，分析是超聲時間過長導(dǎo)致蛋白質(zhì)的解聚體重新聚集，溶解度減小。Zhong 等指出，在不同溫度和時間加熱時對綠豆蛋白的溶解度影響不大；相反，在熱與超聲共同作用下，隨處理溫度和時間增加，蛋白質(zhì)溶解度逐漸增加，由此超聲也被認定是蛋白質(zhì)溶解度增加的主要原因。

圖2 不同超聲條件對蕓豆蛋白溶解度的影響Fig.2 Effects of different ultrasonic conditions on protein solubility of kidney bean

2.3 超聲處理對蕓豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響

圖3 表示了不同超聲強度處理蕓豆蛋白中游離巰基與二硫鍵含量的變化。由圖3 可知，隨超聲強度增加，蛋白中游離巰基的含量顯著提高（＜0.05），二硫鍵的含量顯著降低（＜0.05）；與未處理組相比，超聲時間20 min、功率400 W（B）時游離巰基的含量最高、二硫鍵含量最低，分別由3.95 μmol/g 增加至7.45 μmol/g、由2.91 μmol/g 減少至1.31 μmol/g。分析是因超聲使蛋白質(zhì)分子顆粒減小，進而內(nèi)部機構(gòu)發(fā)生了改變。Hu 等研究表明，超聲處理會破壞蛋白質(zhì)內(nèi)二硫鍵，分解成新游離巰基。因此，本實驗中超聲處理使蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基暴露與二硫鍵的斷裂，降低了蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性，從而使蕓豆蛋白的游離巰基的含量增加與二硫鍵的減少。但在當超聲功率不變時間延長時，蛋白中游離巰基的含量變少，二硫鍵含量增多，分析是蛋白質(zhì)所含游離巰基在長期暴露于極性環(huán)境中易與二硫鍵重新結(jié)合，導(dǎo)致游離巰基的減少與二硫鍵增多。

圖3 不同超聲條件對蕓豆蛋白游離巰基與二硫鍵含量的影響Fig.3 Effects of different ultrasonic conditions on content of freegroup and disulfide bond in kidney bean protein

2.4 超聲處理對蕓豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

乳化性是指超聲通過改變蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，使之部分變性，從而暴露疏水基團使之相互作用解離，促進分子在小顆粒表面擴散，從而更好地吸附油水界面上的油滴，乳化穩(wěn)定性越高，則表示乳化性質(zhì)越好。如圖4 所示，超聲后蕓豆蛋白的乳化及乳化穩(wěn)定性顯著增加（＜0.05），超聲時間10 min、功率400 W 時蕓豆蛋白的乳化性最佳，由2.66 m/g 增加至5.49 m/g，乳化穩(wěn)定性最好，由51.68%增加至70.11%，但當超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時，乳化及乳化穩(wěn)定性開始下降。這是由于超聲時間過長會使蛋白質(zhì)嚴重變性，蛋白質(zhì)小顆粒重新聚集成大顆粒從而降低了乳化性。大量研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理可以有效地改善蛋白質(zhì)的乳化性及乳化穩(wěn)定性等功能性指標。

圖4 不同超聲條件對蕓豆蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of different ultrasonic conditions on sulfhydryl emulsification and stability of kidney bean protein

2.5 超聲處理對蕓豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響

由圖5 可知，超聲處理對蕓豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性差異顯著（＜0.05），在超聲時間10 min、功率400 W 時蕓豆蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性達到最大值，分別由88.13%增加至162.81%，由65.24%增加至72.94%。分析是超聲波產(chǎn)生的空化作用使蕓豆蛋白分子聚集程度降低，蛋白質(zhì)疏松，從而蕓豆蛋白更容易吸附在氣-水界面上，增加了蕓豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性。望運滔等研究，隨超聲強度增加，鷹嘴豆蛋白的起泡性顯著增強（＜0.05），超聲處理20 min 時，達到最大值136.7%，是未處理組的2.3 倍。但當超聲功率不變、時間延長時，蕓豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性數(shù)值下降，這是由于超聲時間過度，蛋白質(zhì)疏松結(jié)構(gòu)變得緊密，使起泡性及起泡穩(wěn)定性出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。因此，適當?shù)某曁幚砟軌蛴行У奶岣呤|豆蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性。

圖5 不同超聲條件對蕓豆蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic conditions on foamability and foamability stability of kidney bean protein

2.6 超聲處理對蕓豆蛋白抗氧化能力的影響

蕓豆蛋白的抗氧化能力如圖6 所示。由圖6 可知，超聲處理前后蛋白抗氧化能力差異顯著（＜0.05），在超聲時間10 min、功率400W（B）時，蕓豆蛋白總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力與Fe 離子還原能力分別達到最大值，總抗氧化能力由323.60 U/mL增加到636.28 U/mL；DPPH 自由基清除能力由49.70%增加至87.28%；Fe 離子還原能力由62.74%增加至80.58%。研究人員發(fā)現(xiàn)超聲處理會加速蛋白質(zhì)疏水性氨基酸外露，使蛋白質(zhì)疏水性與水解度增加，而蛋白質(zhì)的抗氧化能力與疏水性與水解度成正比。由此說明，超聲處理增加蛋白質(zhì)的疏水性與水解度，從而增加了蕓豆蛋白的抗氧化能力。這也與上述試驗中水解度增加的趨勢相符。當超聲功率不變，時間繼續(xù)增加時，蛋白的三種抗氧化能力指標數(shù)值開始下降，分析是超聲時間過長，暴露氨基酸基團重新被掩埋，水解度下降，繼而抗氧化能力降低。

圖6 不同超聲條件對蕓豆蛋白抗氧化能力的影響Fig.6 Effects of different ultrasonic conditions on antioxidant capacity of kidney bean protein

3 結(jié)論

與未處理組相比，超聲處理顯著提高（＜0.05）蕓豆蛋白的溶解度、水解度、乳化性及乳化穩(wěn)定性、起泡性及起泡穩(wěn)定性，超聲處理使蕓豆蛋白游離巰基含量增加，二硫鍵含量減少。超聲處理提高了蕓豆蛋白抗氧化能力，總抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力與Fe 離子還原能力三種指標數(shù)據(jù)均顯著提高（＜0.05）。但超聲時間過長也會引發(fā)蕓豆蛋白的理化性質(zhì)數(shù)值與抗氧化能力下降，因此，適度超聲處理可以提高蕓豆蛋白理化性質(zhì)及抗氧化能力。